Manual para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo en el laboratorio de microbiología de alimentos.

Transcripción

1 Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios. Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Manual para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo en el laboratorio de microbiología de alimentos. Ciudad de México Página 1 de 35

2 DIRECTORIO SECRETARÍA DE SALUD José Narro Robles COMISIÓN FEDERAL PARA LA PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS Julio Sánchez y Tepoz COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA Armida Zúñiga Estrada DIRECCIÓN EJECUTIVA DE CONTROL ANALÍTICO Imelda Rocío Guzmán Cervantes DIRECCIÓN EJECUTIVA DE INNOVACIÓN Josefina Gutiérrez Ramírez Página 2 de 35

3 GRUPO DE TRABAJO QUE PARTICIPÓ EN LA REDACCIÓN DE ESTE MANUAL Fabiola Castañeda Coordinadora de Medios de Cultivo. César Omar Gálvez González Coordinador de Proyectos Analíticos. Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Anastasio Palacios Marmolejo - Jefe de departamento de control microbiológico. Laboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes Mayra Liliana Robledo Ortiz - Responsable del área de preparación de medios de cultivo. Laboratorio Estatal de Salud Pública de Chiapas. Magali del Carmen Carvajal Aguayo- Químico Analista Laboratorio Estatal de Salud Pública de Campeche María Fátima Trujillo Esquivel - Jefe del Laboratorio de Medios de Cultivo. Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Guanajuato. Maria de los Ángeles Miranda Uriostegui - Química analista Laboratorio Estatal de Salud Pública de Guerrero "Dr. Galo Soberon y Parra" Jose Manuel Acevedo Ariza- Analista de preparación de medios de cultivo. Laboratorio Estatal de Salud Pública de Morelos. Adriana Lorely Durham González Responsable de preparación y control de calidad de medios de cultivo y cepario. Laboratorio Estatal de Salud Pública de San Luis Potosí Maria de los Angeles Sanz Salazar Encargada del Laboratorio de Control de Medios de Cultivo y Cepario. Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sinaloa Odilia Hernández Hernández - Jefa del departamento de Análisis Sanitarios Nadia Karina Meza Químico Analista. Perla Yuridia Cárcamano Garcia Jefa de Sección de Análisis Microbiológicos Laboratorio Estatal de Salud Pública de Veracruz. Página 3 de 35

4 Esta edición fue preparada por la participación de los Laboratorios Estatales de Salud Pública, la Coordinación de Medios de Cultivo de la Gerencia de Análisis y Desarrollo de Pruebas Microbiológicas de la Dirección Ejecutiva de Control Analítico, por la Coordinación de Proyectos Analíticos de la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Este material podrá reproducirse íntegramente o parcialmente, siempre que se dé crédito a la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios, Ciudad de México, México Las denominaciones, marcas y catálogos señalados en esta publicación son enunciados sólo como ejemplos y no implica que la Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios, ni la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura, los apruebe o recomiende con preferencia a otros análogos. Salvo error u omisión, las denominaciones de productos patentados son indicadas con el símbolo (MR) y su propiedad pertenece a sus dueños. Los editores de esta publicación han adoptado todas las precauciones razonables para verificar la información que figura en la presente publicación, no obstante lo cual, el material publicado se distribuye sin garantía de ningún tipo, ni explícita ni implícita. El lector es responsable de la interpretación y el uso que haga de ese material, y en ningún caso la Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios podrá ser considerada responsable de daño alguno causado por su utilización. Página 4 de 35

5 Contenido INTRODUCCIÓN Y ALCANCE GLOSARIO... 7 SECCIÓN I. Buenas Prácticas de Laboratorio para la preparación y control calidad de medios de cultivo Áreas donde se elaboran y controlan medios de cultivo Agua empleada en la elaboración de medios de cultivo Pesado y rehidratación de medios de cultivo Medición de ph Envasado de los medios de cultivo preparados Esterilización Almacenamiento y vida de anaquel de los medios de cultivo Incubación de medios de cultivo SECCIÓN II. Recomendaciones generales para la preparación y uso de medios Distribución de medios de cultivo Fundido de agares Preparación de medio sólido en placas Petri Preparación de placas para inoculación Trazabilidad Desecho de medios SECCIÓN III. CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Muestreo Evaluación Física Prueba de esterilidad Determinación de ph SECCIÓN IV. CRITERIOS PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO Criterios de selección del método de evaluación de medios de cultivo Frecuencia de la evaluación del desempeño Evaluación de vida de anaquel Condiciones de incubación SECCIÓN V. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO Preparación y cuantificación del inóculo Medios Sólidos para pruebas Cuantitativas Coeficiente de productividad Factor de selectividad Página 5 de 35

6 3. Medios Sólidos para Pruebas Cualitativas Prueba de productividad y especificidad Prueba de selectividad Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método Cuantitativo Productividad Selectividad Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo para los medios líquidos selectivos Productividad: Selectividad: Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo por turbidez Medios de pre-enriquecimiento Medio de confirmación Método para la evaluación del desempeño de diluyentes Evaluación de desempeño de los medios de cultivo que se utilizan en los métodos de V. cholerae y V. parahaemolyticus Método para la evaluación de los Caldos triptona (T1Nx) Método para la evaluación de los Agares T1Nx Guía para la elaboración del Procedimiento de Preparación del Medio de Referencia (PMR) Formulación del medio de cultivo de referencia Preparación Control de Medio de Cultivo de Referencia Bibliografía Anexo I. Evaluación del desempeño de los medios de cultivo que no están presentes en los anexos ISO Página 6 de 35

7 INTRODUCCIÓN Y ALCANCE. Este Manual está destinado a los laboratorios que realizan análisis microbiológicos de alimentos, en particular para aquellos que siguen los métodos de análisis descritos en las Normas Oficiales Mexicanas publicadas por la Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios, en particular la NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos. El contenido de este Manual describe los requisitos establecidos en el punto 7 de la norma NOM-210-SSA GLOSARIO Especificidad. Materiales Referencia (MR). de Medio de cultivo de referencia. Método de prueba. Microorganismo blanco: Microorganismo blanco: Productividad. Selectividad. Temperatura ambiente no Es la demostración de la capacidad de un medio de cultivo que permite que los microorganismos no blancos, no muestren las mismas características del microorganismo blanco. Sustancia o material cuyas propiedades, o al menos una de ellas, son suficientemente estables para ser usados en la evaluación de métodos de medición o para caracterizar otros materiales. Para fines de este procedimiento, se considera un material de referencia a las cepas con certificado provenientes de colecciones reconocidas. Medio de cultivo no selectivo para la evaluación comparativa del desempeño (control) independiente del medio de cultivo a probar, con el objetivo de demostrar, que es adecuado para su uso. Este medio de cultivo debe asegurar, que tiene una calidad alta y consistente, su evaluación debe hacerse con inóculo cuantificado y caracterizado, se recomienda el uso de Materiales de Referencia (MR). Para su preparación debe emplearse un procedimiento específico, en el que se detalle, marca de medio/ingredientes. El medio de cultivo de referencia, generalmente es un medio de cultivo sin inhibidor como el Agar soya tripticasa (AST). Procedimiento definitivo que produce un resultado de una prueba, que incluyen la identificación, medición y evaluación de una o más cualidades, características o propiedades. Microorganismo de interés, aquel microorganismo para el cual fue diseñado el método o el microorganismo que se pretende recuperar o identificar. Microorganismos seleccionados para demostrar la capacidad del medio para impedir el crecimiento de microorganismos diferentes al microorganismo blanco. Es la capacidad de los medios de cultivo para recuperar a un microorganismo blanco en condiciones de incubación específicas. Es la capacidad de un medio de cultivo selectivo, para inhibir el desarrollo de los microorganismos no-blancos. Según la NOM-210-SSA Punto 3.22 la temperatura Ambiental: a la que oscila entre 18 C y 27 C. Página 7 de 35

8 SECCIÓN I. Buenas Prácticas de Laboratorio para la preparación y control calidad de medios de cultivo. El laboratorio de evaluación de medios de cultivo debe cumplir con las Buenas Prácticas de Laboratorio. Los medios de cultivo deshidratados son mezclas de sustancias higroscópicas, sensibles a la humedad, el calor y la luz. A pesar de que el envase de los medios deshidratados está protegido contra la luz y la humedad, el almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas indicadas en los frascos para conservar sus propiedades iniciales. Se debe evitar en la medida de lo posible, los cambios bruscos de temperatura y una vez abiertos, es necesario mantenerlo cerrado para protegerlo de la hidratación. El polvo de los medios de cultivo deshidratados debe ser homogéneo y deben tener el color inicial indicado para cada medio. Se debe descartar el medio si hay algún cambio de la apariencia física o indicios de humedad en el contenedor. El material que se utilice en el laboratorio debe estar limpio, la evaluación debe estar documentada y realizada siguiendo un procedimiento interno. 1. Áreas donde se elaboran y controlan medios de cultivo. El área donde se realice el control de calidad debe estar separada del área de preparación lo cual puede lograrse con cubículos independientes al interior del área. Se deberá contar con procedimientos de limpieza y sanitización de las áreas de trabajo en los que se considere un programa de rotación de sanitizantes. Se deben mantener registros de la limpieza, desinfección y monitoreo de partículas viables del área. El monitoreo de partículas viables no debe rebasar de 15 UFC/placa expuesta por 15 minutos de exposición de una placa de agar soya tripticasa o agar peptona-glucosa extracto de levadura. Realizar el monitoreo al menos quincenalmente. Para Módulos de Flujo Laminar el monitoreo debe realizarse durante la operación o al menos cada semana, la especificación es de <1 UFC/ placa durante no menos de 15 min de exposición. Cuando no se cumplan los criterios de monitoreo ambiental, se deberá considerar lo siguiente: Realizar limpieza y sanitización exhaustiva y repetir el monitoreo. Revisar los resultados de la prueba de esterilidad de los medios de cultivo, para detectar lotes de medios de cultivo afectados. 2. Agua empleada en la elaboración de medios de cultivo. Para la preparación de medios de cultivo, usar solo agua destilada, desmineralizada o desionizada producida por ósmosis inversa, o calidad equivalente, libre de sustancias inhibitorias o que puedan influenciar el crecimiento de microorganismos, por ejemplo, trazas de cloro, amonio y metales pesados. Se recomienda que el agua se use tan pronto como sea producida, el agua no deberá usarse después de 24h. La calidad microbiológica del agua con la que se preparen los medios de cultivo deberá cumplir con los siguientes criterios: Límite de Alerta 100 UFC/mL Límite de Acción 1000 UFC/mL La conductividad debe ser menor a 2.0 μ S/cm a 25 C o mayor de 0.5 megaω-cm (resistividad). La cual se debe medir antes de su uso. Página 8 de 35

9 3. Pesado y rehidratación de medios de cultivo. Leer cuidadosamente la etiqueta o la fórmula del medio y pesar la cantidad indicada en una balanza con un error permisible de hasta +/- 0.1% del peso a medir y una sensibilidad de 0.1 g. Colocar la mitad del volumen de agua a preparar en un contenedor de al menos el doble del volumen solicitado. Adicionar el polvo y mezclar. Dejar reposar de 10 a 15 minutos para su completa humectación. Se puede utilizar un agitador magnético. Adicionar el resto de agua y mezclar procurando que el resto del polvo adherido a las paredes del recipiente, se resbale e integre al resto del medio Calentar con agitación continua, en el caso de los medios con agar es necesario alcanzar la ebullición para asegurar su completa disolución, evitando que el medio se derrame o se pegue al recipiente por calentamiento excesivo. La disolución total se reconoce cuando al agitar el medio no se adhieren partículas en las paredes y el medio es transparente. Todo medio es sensible al calentamiento, por ese motivo no debe calentarse más de lo necesario. 4. Medición de ph En general los medios deben tener una variación de ± 0.2 unidades de ph después de la esterilización. Medir el ph del medio con un potenciómetro previamente calibrado y verificado antes de su uso. Los medios y las soluciones de referencia deben estar a temperatura ambiente, ya que de lo contrario las lecturas serán imprecisas. Los medios comercialmente fabricados pueden mostrar cambios significativos de ph antes y después de la esterilización. Sin embargo, si la calidad del agua utilizada en su preparación es la adecuada, los ajustes de ph antes de la esterilización no son necesarios. 5. Envasado de los medios de cultivo preparados. Envasar en tubos, frascos o matraces la cantidad necesaria del medio de cultivo limitando el volumen a las ¾ partes de la capacidad del recipiente. 6. Esterilización Esterilizar el medio el día de su preparación. Para la esterilización seguir las instrucciones de preparación de la etiqueta del medio de cultivo. Se recomienda que los medios se esterilizen en volúmenes no mayores a un litro. Se debe tener atención a lo señalado en el punto 6.6 de la NOM- 210-SSA Después del calentamiento, es necesario que el medio se enfríe de tal manera que se prevenga el sobrecalentamiento. Esto es particularmente importante para medios con contenido de azúcares, ya que puede producir oscurecimiento del medio de cultivo (Reacción de Maillard). 7. Almacenamiento y vida de anaquel de los medios de cultivo Una vez que se prepara un medio de cultivo se debe considerar que su vida de anaquel es diferente de acuerdo al tipo de medio. Se deben verificar y documentar las condiciones de almacenamiento, cada laboratorio debe especificar y justificar estas condiciones. Medios preparados comercialmente disponibles: Seguir las instrucciones del fabricante sobre las condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y uso. Medios preparados por el laboratorio: Si los medios se refrigeran no se deben almacenar por más de 2 a 4 semanas para placas y de 3 a 6 meses en botellas y tubos cerrados, a menos que se especifique otra cosa en las normas y/o por el fabricante. Si el laboratorio requiere aumentar el Página 9 de 35

10 tiempo de almacenamiento se deberá realizar un protocolo para evaluar la vida de anaquel de cada medio. Almacenamiento de medios en cajas Petri: En general no se recomienda un almacenamiento prolongado de los medios de cultivo, estos deben utilizarse inmediatamente o almacenar las placas invertidas en refrigeración y condiciones que prevengan el deterioro, deshidratación y apartadas de la luz. Los medios deben almacenarse dentro de contenedores como bolsas de plástico, papel o celofán. La refrigeración favorece la deshidratación del medio por lo que antes de su uso se debe observar si existe evidencia de deshidratación. Se debe evitar el agua de condensación ya que el depósito de gotas puede causar la alteración del medio, para minimizar las placas deben ser templadas antes de ser colocadas en bolsas. Almacenar hasta que no se observe agua de condensación. Etiquetar las placas en la base o en el canto con la identificación incluyendo fecha de caducidad. Alternativamente se puede usar algún sistema de identificación documentado. 8. Incubación de medios de cultivo Incubar en pilas de hasta 6 cajas para permitir una buena penetración del calor sin pérdida de humedad. Adicionalmente la humedad en incubadoras de convección, puede incrementarse colocando un contenedor de agua en el fondo de la incubadora. El agua debe ser cambiada y los contenedores desinfectarlos frecuentemente para evitar contaminación por hongos. Durante la incubación, el agar puede perder humedad, bajo algunas circunstancias esto puede afectar el crecimiento de los microorganismos. Los factores que pueden influenciar en la pérdida de agua, es la cantidad de medio en la placa, el tipo de incubadora (si está equipado con ventiladores), la humedad de la atmósfera en la incubadora, la posición, el número de placas y la temperatura de incubación. Página 10 de 35

11 SECCIÓN II. Recomendaciones generales para la preparación y uso de medios. 1. Distribución de medios de cultivo. La distribución de los medios después de la esterilización debe realizarse bajo flujo de aire unidireccional para minimizar la posibilidad de contaminación ambiental. Esto debe considerarse como un requisito mínimo para los medios que se usan en ensayos de productos estériles, e incluye el enfriamiento de los medios, ya que las tapas de los envases necesitarán ser retiradas durante el enfriamiento para prevenir la condensación. 2. Fundido de agares Fundir el medio en baño de agua hirviendo o cualquier otro proceso por el que se obtengan resultados idénticos, como el vapor fluyente a través de la autoclave. Nunca fundir el agar más de una vez. Se debe evitar sobrecalentamiento de los medios de cultivo. Una vez fundidos retirar de la fuente de calor. Colocar el matraz a temperatura ambiente por 2 minutos antes de colocarlo en baño de agua con temperatura controlada entre 44 C y 47 C. El tiempo necesario para alcanzar esta temperatura depende del tipo de medio, del volumen y del número de unidades en el baño. El medio fundido se debe usar tan pronto como sea posible y no usarse después de 4 horas Nunca fundir el agar más de una vez. Permitir que el agar se enfríe y se solidifique colocando las placas con las tapas puestas en una superficie horizontal y fría. 4. Preparación de placas para inoculación. Al solidificar el agar permitir el secado colocando las placas destapadas en un Módulo de flujo laminar por 30 a 60 minutos o toda la noche a temperatura ambiente con las tapas en su lugar, se debe tener especial cuidado que la superficie sea horizontal. No se deben mover las placas hasta que solidifiquen. Se debe tener la precaución de evitar la formación de burbujas en la superficie del agar. Una vez que las placas están solidificadas mantener en posición invertida. Antes de la inoculación en medio de cultivo sólido en superficie, se debe verificar que la superficie del agar esté seca, esto puede lograrse colocándolas con el agar hacia abajo y las tapas abiertas a una temperatura entre 25 C y 50 C. 5. Trazabilidad Documentar cada una de las etapas, desde la recepción de los medios deshidratados, incluyendo equipos, cepas utilizadas, resultados de crecimiento de cepas, etc., hasta el desecho de los mismos. 3. Preparación de medio de cultico en placas Petri. Vaciar el agar fundido en caja Petri hasta obtener al menos 3 mm de espesor (para cajas Petri de 90 mm de diámetro, normalmente se requiere de 18 a 20 ml de agar). 6. Desecho de medios Medios contaminados o no usados, se deben desechar de acuerdo con lo descrito en la Norma Oficial Mexicana, NOM-087-SEMARNAT-SSA Protección ambiental-salud ambientalresiduos peligrosos biológico infecciosos- Clasificación y especificaciones de manejo. Página 11 de 35

12 SECCIÓN III. CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 1. Muestreo La cantidad de muestras a seleccionar para realizar las pruebas de control de calidad y evaluación de desempeño, debe ser por lo menos el 5% (FAO) o lo indicado en otra norma de muestreo para completar todas las determinaciones. 2. Evaluación Física. En cada lote de medio de cultivo preparado por el laboratorio, se deberá verificar en forma visual la apariencia y el color característico, en los caldos no debe haber turbiedad o material precipitado. En el caso de medios de cultivo con dextrosa, se debe tener en cuenta que el sobre calentamiento de los medios produce una reacción de Maillard, es decir oscurecimiento del medio por sobrecalentamiento. Los agares deben tener una consistencia firme, de color característico y no presentar agua de condensación. En general el volumen de medio de cultivo dosificado en placas Petri, debe ser de aproximadamente de ml para evitar la rápida deshidratación del medio, favorecer su uso y cumplir con los requisitos del método de prueba. Los volúmenes de los medios líquidos que se utilicen para realizar diluciones de métodos cuantitativos deberán verificarse con una probeta. Registrar datos en el formato correspondiente. 3. Prueba de esterilidad. Un adecuado control de calidad depende del tamaño del lote del medio de cultivo. El criterio de aceptación debe estar escrito y justificado. Incubar el medio a las condiciones de incubación que indique el método de prueba. Observar si los medios presentan algún signo de contaminación o cambio en su evaluación física. Cuando exista duda en la interpretación de contaminación, se deberán realizar resiembras a medios no selectivos como AST, para descartar el desarrollo microbiano. Descartar el lote si está contaminado. Mantener registros. 4. Determinación de ph. El ph de los medios de cultivo sólidos debe ser medido utilizando un electrodo plano, el uso de otros electrodos diseñados para la lectura de ph en medios líquidos pueden no ser adecuados debido a que los iones H+ no migran fácilmente del medio sólido a través de la membrana, cuando no se disponga de electrodos planos, otros electrodos pueden ser utilizados siempre que se tomen precauciones para evitar errores en la medición o daños al electrodo Determinar el ph en los medios de cultivo preparados con un potenciómetro calibrado como lo describe el procedimiento o instructivo del equipo. Registrar los resultados. Los cuales deben estar dentro del intervalo indicado en el marbete del medio. Descartar el lote si no se cumple con esta determinación. Mantener registros. Realizar la medición del ph, cuando el medio de cultivo ha alcanzado la temperatura ambiente. Página 12 de 35

13 SECCIÓN IV. CRITERIOS PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO. 1. Criterios de selección del método de evaluación de medios de cultivo. La evaluación del desempeño que se realice a un medio de cultivo deberá considerar los siguientes puntos: El propósito de uso, es decir, si el medio de cultivo va a ser utilizado en pruebas cuantitativas, cualitativas o ambas, diluyente, medio de transporte, etc. Cuando se realice un cambio de marca o se empiece el uso de un nuevo medio de cultivo, debe hacerse la evaluación del desempeño por métodos cuantitativos, con el propósito de contar con más información que soporte el cambio. frecuencia debe ser documentada por el laboratorio. Si considerando lo anterior se cuenta con un alto nivel de aseguramiento, la frecuencia puede ser en cada lote de polvo o cada determinado número de lotes de medio de cultivo preparado. Esta decisión debe ser documentada por el laboratorio. Cuando se tenga evidencia de modificación o alteración de los sistemas del laboratorio, por ejemplo: resultados atípicos en la evaluación de desempeño de los medios de cultivo, problemas en el sistema de producción de agua, cambio de marca de los medios de cultivo se deberá aumentar la frecuencia de la evaluación de desempeño de los medios de cultivo. 2. Frecuencia de la evaluación del desempeño. La frecuencia de la evaluación del desempeño no debe ser considerada como una política inamovible, esta frecuencia debe ser modificada cuando hay algún cambio en el sistema del laboratorio, por ejemplo cuando se cambia de marca, o las alertas del equipo de agua se activan, también debe considerar el nivel de aseguramiento de calidad del laboratorio, por lo que se deberá tener en cuenta todos los aspectos de aseguramiento incluyendo: Calificación del personal, Equipo adecuado (uso de autoclaves), Equipos calificados, Instrumentos calibrados/verificados, Equipos de producción de agua, Controles ambientales, Calidad comprobada de la marca de medios de cultivo empleados. Cuando el aseguramiento de calidad en el laboratorio no sea tan estricto como lo indicado en el párrafo anterior se debería realizar la evaluación de desempeño a cada lote de medio de cultivo. Esta decisión o el cambio en la Se pueden distinguir tres niveles de evaluación del desempeño: Para medios de referencia. Para la evaluación de estos medios de cultivo, se deberá hacer una evaluación usando métodos cuantitativos y las cepas descritas en los anexos E y F de la norma ISO 11133, adicionalmente deben evaluarse por métodos cualitativos cada uno de los microorganismos de prueba que serán utilizados en la evaluación del desempeño de los medios, siempre que estén disponibles utilizar materiales de referencia. Evaluación inicial. Esta deberá realizarse utilizando preferentemente métodos cuantitativos, cuando se esté iniciando la evaluación de un medio de cultivo, o cuando se realicen cambios de marca y dependiendo del nivel de aseguramiento en el laboratorio, cada laboratorio deberá justificar la frecuencia con la que realizará esta evaluación, la cual puede hacerse con el cambio de lote del fabricante, con la apertura de cada frasco, a la recepción de una remesa de medio de cultivo, cada determinado número de lotes de preparación, etc. Página 13 de 35

14 Coeficiente de productividad Factor de selectividad Prueba de productividad y especificad Prueba de selectividad Método cuantitativo Método cualitativo Método cualitativo por turbidez Método para diluyentes Evaluación rutinaria. Medios sólidos para pruebas cuantitativas Medios Solidos para pruebas cualitativas Medios líquidos Medios sólidos para pruebas cuantitativas Medios sólidos para pruebas cualitativas Caldos para NMP por ejemplo CMM, CLT Caldos Selectivos por ejemplo RVS, MKTTn, Fraser Caldos no selectivos por ejemplo CL Diluyentes por ejemplo buffer de fosfatos 1 1 De acuerdo a lo indicado en la Norma de referencia, algunos medios de cultivo como RVA o ABP requieren que adicionalmente se determine la prueba de especificidad. Página 14 de 35

15 3. Evaluación de vida de anaquel. La vida de anaquel para el almacenamiento de los medios, debe ser verificada cada determinado número de lotes preparados, se deben revisar al menos las siguientes características: Color Humedad ph Volumen Presencia de precipitados o flóculos Evaluación de desempeño La fecha de caducidad debe estar basada en el tiempo en el cual, todas las características descritas continúen siendo aceptables. El grado de humedad en el medio de cultivo es importante para un óptimo crecimiento de las bacterias, esta depende de las condiciones sobre y dentro del medio de cultivo. Una excesiva pérdida de humedad, puede incrementar las concentraciones de inhibidores en medios de cultivo selectivos y reducir el crecimiento en la superficie del medio. La pérdida de humedad puede observarse a simple vista como cambio de color del medio, perdida del brillo y la aparición de cuarteaduras entre el medio de cultivo y la placa de agar. 4. Condiciones de incubación. Las condiciones de incubación para la evaluación del desempeño de los medios de cultivo, deben ser las indicadas en los métodos de prueba en el cual se usa el medio a ser evaluado. Página 15 de 35

16 SECCIÓN V. MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO. 1. Preparación y cuantificación del inóculo. Alternativamente a lo indicado en este numeral se pueden usar métodos nefelométricos o espectrofotométricos para el ajuste del inóculo de las cepas. En caso de cepas liofilizadas, seguir las instrucciones de uso del fabricante. En general para cada una de las cepas control, realizar lo siguiente: A partir de los cultivos desarrollados en agar soya tripticasa (AST) de 24 horas a 34 C entre 38 C +/- 1 C, transferir una colonia a 10 ml de caldo BHI incubar 18 horas a 35 C 36 C +/- 1 C. Tomar 1 ml del cultivo anterior y realizar diluciones decimales en 9 ml de solución peptona salina, ( ), hasta obtener una densidad microbiana de entre 100 y 150 UFC / ml. Sembrar 1 ml de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en placa en AST o tomar 0.1 ml y sembrarlo por extensión en placa en AST por duplicado. Incubar las cajas invertidas a entre 34 C y 38 C durante 24 horas. Contar las colonias para establecer en qué dilución se encuentra el inóculo deseado. Realizar este procedimiento varias veces hasta obtener resultados repetibles. Una vez establecida la dilución, inocular el medio de cultivo a probar incubando bajo las condiciones establecidas en el método. Página 16 de 35

17 2. Medios Sólidos para pruebas Cuantitativas Coeficiente de productividad Seleccionar dos placas sin agua de condensación del medio a probar y 2 placas del medio de referencia. Inocular por separado 1 ml de cada suspensión de los microorganismos de prueba (Seleccionar los microorganismos de prueba indicados en los anexos E y F de la ISO 11133, y preparar una suspensión de microorganismo como se indica en 9 en concentración adecuada de menos de 100 UFC del microorganismo blanco.) y sembrar por duplicado el medio de referencia y el medio a probar, inoculando 1 ml si es por vaciado en placa, o bien, 0.1 ml si es por extensión. Incubar en las condiciones de prueba. Contar las colonias y reportar el promedio en cada medio de cultivo. Aplicar la siguiente fórmula: Cálculo del Coeficiente de productividad PR = (Ns / No) Dónde: PR = Coeficiente de productividad Ns = Es la cuenta total obtenida del medio de cultivo a probar No = Es la cuenta total obtenida del medio de referencia y debe ser entre 80 y 120 UFC / ml Interpretación de resultados Para agares no selectivos: se considera aceptable si el coeficiente de productividad es de 0.7. Para agares selectivos: se considera aceptable si el coeficiente de productividad es de 0.5. Cuando se supere un PR de 1.4 se deberá investigar la causa de este resultado. Factor de selectividad. Para esta evaluación, inocular por duplicado todas las diluciones desde 10-1 hasta una dilución más de la que se cuentan no más de 150, de microorganismo no blanco en el medio selectivo a evaluar y el medio no selectivo de referencia, incubar en las condiciones de prueba y calcular el factor de selectividad Fs mediante la siguiente fórmula: Cálculo del Factor de selectividad Fs=Do-Ds Dónde: Fs = es el factor de selectividad. Do = es la dilución más alta que muestra desarrollo en un medio no selectivo de referencia. Ds = es la dilución más alta en el medio de prueba que muestra desarrollo comparable con el medio de referencia. Fs, Do y Ds son expresados en unidades logarítmicas base 10 (log) Interpretación de los resultados El factor de selección debe ser de por lo menos 2 cuando se inocula el microorganismo no blanco. Cuando no se encuentre crecimiento del microorganismo no blanco en ninguna de las diluciones se deberá reportar como inhibición total. Criterios de Validez. Los resultados serán aceptados como válidos si se cumplen las siguientes condiciones: Los duplicados de cada dilución del microorganismo de prueba, deben tener crecimiento en ambas placas. Cada concentración individual de los microorganismos de prueba, se debe encontrar dentro del intervalo de lectura para el análisis (por ejemplo hasta 100 colonias para método por filtración, hasta 150 colonias para método de siembra en superficie y vaciado en placa). Página 17 de 35

18 Ejemplo: Evaluación del desempeño de Agar rojo violeta bilis: Preparar un inóculo de entre 80 y 120 UFC de Escherichia coli (microorganismo blanco), como lo indica el inciso "Preparación y cuantificación del inóculo". Inocular con 1mL cuatro placas, verter por separado a dos placas ARVB y a dos placas el medio de referencia AST. Homogeneizar e incubar a 35 C por 24 h +/- 2 h. Contar las colonias y hacer el cálculo de UFC de los microorganismos probados en cada medio de cultivo. Si se obtienen los siguientes resultados: N Medio Placa 1 Placa 2 UFC (promedio) PR = (Ns / No) Criterio de aceptación Interpretación Ns ARVB No AST PR= Cumple Preparar una serie de diluciones de Enterococcus faecalis hasta una dilución más de la que se cuentan menos de 150 UFC, inocular por vaciado en placa las últimas tres diluciones usando AST, e inocular por vaciado en placa las primeras diluciones usando ARVB, incubar a 35 C por 24 h +/- 2 h y leer D FS Interpretación AST -- >250/ > / 106= D 0=7 ARVB Ds= 1 Inhibición total Cumple Conclusión: El medio de cultivo es adecuado para su uso. Página 18 de 35

19 Selectividad Productividad y especificidad 3. Medios Sólidos para Pruebas Cualitativas Prueba de productividad y especificidad Preparar cultivos de trabajo como se describe en el punto "Preparación y cuantificación del inóculo", para tener concentraciones aproximadas de 100 UFC / ml Para la prueba de productividad y especificidad, utilizar placas del medio a probar estriando (estría cruzada) con asa para cada microorganismo de prueba de manera que se obtengan colonias aisladas. Prueba de selectividad. Estriar usando un asa de 1 µl para cada microorganismo de prueba con una sola línea recta en la misma placa paralelamente sin que se crucen las estrías. Deben ser distinguibles para permitir la observación morfológica típica y tamaño de la colonia. Incubar las placas bajo condiciones definidas en los métodos de prueba correspondientes. Interpretación de resultados El crecimiento de las placas se evalúa como sigue: 0 Corresponde a nulo crecimiento, completamente inhibido, 1 Corresponde a crecimiento débil (aun cuando se reduzca el crecimiento o el tamaño de la colonia), parcialmente inhibido. 2 Corresponde a buen crecimiento La calificación del microorganismo blanco debe ser 2 y tener apariencia, tamaño y morfología colonial (especificidad) típica. Para las pruebas de selectividad dependerá del grado de inhibición y de tipo de medio. El crecimiento para microorganismos no blanco deber ser parcialmente inhibidos o completamente inhibidos. Ejemplo: Evaluación de desempeño de agar XLD Preparar suspensiones de aproximadamente 100 UFC como se indica en "Preparación y cuantificación del inóculo" de los siguientes microorganismos Salmonella Typhimurium, E. coli y Enterococcus faecalis Estriar de la suspensión de Salmonella Typhimurium una placa de XLD por estría cruzada. En otra placa de XLD inocular E. coli utilizando un asa de 1 µl haciendo una línea recta, inocular Enterococcus faecalis con otra asa de 1 µl haciendo otra línea recta paralela a la primera. Incubar a 36 C +/- 1 C por 24 h +/- 2 h y leer los resultados. Prueba Microorganismo Criterio Resultado Interpretación Salmonella Typhimurium E. faecalis 0 E. coli Colonias con centro negro y halo transparente, y vire del medio. (2) Buen crecimiento colonias típicas (0) Inhibición total (1) Inhibición Cumple Cumple Cumple Página 19 de 35

20 4. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método Cuantitativo. Método adecuado para caldos selectivos o no selectivos. También es adecuado para evaluar el desempeño de medios de cultivo empleados en la metodología de NMP. Para medios de cultivo de doble o triple concentración, se debe adicionar el volumen de agua estéril necesario para que los medios queden en concentración simple. Preparación de las diluciones. Preparar el inóculo de acuerdo al punto "Preparación y cuantificación del inóculo" 2. Sembrar 1 ml de las diluciones apropiadas para obtener el inóculo deseado por vaciado en placa o 0.1 ml por extensión en placa en un medio de referencia. Incubar las cajas invertidas a 36 C +/- 1 C, durante 24 horas. Contar las colonias para conocer en qué dilución se encuentra el inóculo deseado, mantener registros. Para microorganismo blanco el inóculo debe ser de entre 100 y 150 UFC. El volumen de inoculo en los medios de cultivo líquidos no deberá ser mayor del 10% del volumen del medio de cultivo Para microorganismos no blanco 1000 UFC Desarrollo Una vez establecida la dilución para ambos microorganismos, inocular un número de tubos equivalente a las diluciones a probar, para el microorganismo no blanco, puede ser suficiente solo la dilución 10-1 y 10-2, y para el microorganismo blanco, una o dos diluciones más altas a la seleccionada. Incubar bajo las condiciones establecidas en el método de prueba. Después de la incubación, estriar ambas series de tubos en un medio no selectivo previamente aprobado, utilizando una asa de 10 µl para tener colonias aisladas. Incubar en condiciones adecuadas para el microorganismo. Interpretación de resultados Productividad Se considera que el medio de cultivo tiene buena productividad cuando al estriar 10 µl del medio de cultivo inoculado con UFC, crecen al menos 10 UFC, en un medio no selectivo previamente aprobado. Selectividad Calcular la Selectividad como Fs, restando la dilución más alta en la que se observa buen crecimiento del microorganismo blanco (Do), menos la dilución más alta donde se encuentra crecimiento o no del microorganismo no blanco(ds). Fs=Do-Ds Dónde: Fs es el factor de selectividad. Do es la dilución más alta que muestra buen crecimiento del microorganismo blanco. Ds dilución más alta donde se encuentra crecimiento del microorganismo no blanco. Fs, Do y Ds son expresados en unidades logarítmicas base 10 (log) Ejemplo: 2 Para el uso de inóculos de cepas liofilizadas, seguir las instrucciones de uso del fabricante; si este es el caso no se debe realizar la extinción del inóculo. Se desea realizar la evaluación inicial del desempeño de un nuevo lote del medio de cultivo Caldo MM. Se prepara una suspensión de E. coli, en la dilución 10-7 se cuentan 120 UFC/mL y se suspende una asada E. faecalis en 9 ml de diluyente, esta se considera la dilución 10-1 y se Página 20 de 35

21 hace una dilución decimal más. Se inoculan dos tubos de Caldo MM, con 1mL de las diluciones 10-7, 10-8 de E. coli y dos más con un 1mL de las diluciones 10-1 y 10-2 de la suspensión de E. faecalis. En el momento de inocular los caldos se verifica el inóculo por vaciado en placa. Se incuban los cuatro tubos a 36 ºC +/- 1 ºC, por 24h. Después del tiempo de incubación, de cada tubo de caldo MM, usando una asa de 10 µl, se estrían placas de AST y se incuban a 36 ºC por 24h, se cuentan las colonias en las placas y se observa que en la dilución 10-8 se cuentan más de 10 UFC, mientras que no se observa crecimiento en ninguno de los caldos inoculados con E. faecalis. Microorganismo Dilución seleccionada UFC inoculadas Crecimiento en el caldo UFC en AST Cálculos de FS Productividad E. coli E. faecalis >25000 Crecimiento y vire sin crecimiento Incontables más de =7 Inhibición total Cumple Cumple. Na Página 21 de 35

22 General. 5. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo para los medios líquidos selectivos. Este método utiliza el microorganismo blanco, el microorganismo no blanco, y la mezcla de los microorganismos en un tubo cada uno. Procedimiento Seleccionar un número de tubos de 10mL (Si se usan volúmenes mayores de medio de cultivo, se deben hacer los ajustes para alcanzar resultados equivalentes.) o frascos con 100mL de cada lote a ser probado, siguiendo las recomendaciones de los anexos E y F de la ISO Para la preparación del inóculo siga con lo indicado en el punto "Preparación y cuantificación del inóculo" de este documento. Inoculación del microorganismo blanco: Inocular un tubo del medio de cultivo a evaluar con un inóculo menor de 100 UFC del microorganismo de prueba, homogeneizar. (tubo A) Inoculación del microorganismo no blanco: Inocular un tubo del medio de cultivo a evaluar con más de 1000 UFC del microorganismo interferente, homogeneizar. (tubo B) Inoculación de la mezcla de microorganismos: Cuando sea requerido en los Anexos E y F, cuando se trate de medios nuevos, o cuando se evalúe una marca o fabricante. Inocular un tubo del medio de cultivo a evaluar con menos de 100 UFC del microorganismo blanco y más de 1000 UFC del microorganismo no blanco, homogeneizar. (tubo C) Incubar los tubos a las condiciones especificadas en el método de prueba. De cada tubo inocular usando un asa de 10 μl placas de agar como se indica a continuación. Incubar a las condiciones indicadas en el método de prueba. Cálculos e interpretación de los resultados. Productividad: Se considera como resultado satisfactorio si hay buen crecimiento del microorganismo blanco (al menos 10 UFC o una línea confluente de crecimiento) en el medio no selectivo. Selectividad: Tubo Microorganismo Agar Prueba Valor esperado A Blanco No selectivo Productividad Crecimiento B No blanco No selectivo Selectividad Sin crecimiento Se considera como resultado satisfactorio cuando no hay crecimiento (menos de 10 UFC) del microorganismo no blanco en el medio no selectivo. C Mezcla Diferencial Selectividad Crecimiento del microorganismo blanco. Página 22 de 35

23 General. 6. Métodos para evaluar el desempeño de medios líquidos. Método cualitativo por turbidez. Este método es adecuado para la evaluación de desempeño de medios de cultivo líquidos no selectivos y selectivos, utilizados para pruebas de confirmación, por ejemplo, caldo verde brillante bilis lactosa. El método es sólo cualitativo por tanto, sus resultados son sólo indicativos, por lo que la turbidez en el medio debe ser confirmada en un medio sólido para demostrar el crecimiento. Para medios translúcidos, es utilizada la siguiente notación: 0 indica sin turbidez; 1 indica una ligera turbidez; 2 indica una buena turbidez. Procedimiento. Medios de pre-enriquecimiento Seleccionar una cantidad de tubos conteniendo 10mL o porciones de 10mL de cada lote de medio. microorganismo, el tamaño de inóculo debe ser de <100 UFC. Incubar el medio a 36 C +/- 1 C como lo indican los métodos de prueba por 24h, después de la incubación registrar la presencia de turbidez y resembrar en medios diferenciales adecuados, en este caso puede usarse agar XLD para Salmonella spp. y agar MacConkey para E. coli. Medio de confirmación Usando un asa de 1μL, inocular el medio de confirmación con una suspensión de > 106 UFC/mL (también puede inocularse una asada directa) Incube los tubos bajo las condiciones definidas en el método de prueba. Si el medio antes de inocular es turbio subcultivar a un medio sólido según se indica en las condiciones de prueba y examinar el crecimiento. Interpretación de los resultados Para la evaluación de un medio de pre enriquecimiento, ej. agua de peptona amortiguada, inocular el medio a probar con un volumen adecuado de una suspensión que contenga 100 UFC del microorganismo de interés, el cual es definido considerando las pruebas para las que el medio de cultivo será utilizado como pre enriquecimiento. Para la preparación del inóculo ver el punto "Preparación y cuantificación del inóculo". La evaluación cualitativa se efectuará visualmente buscando una buena turbidez 3, vire o reacción positiva característica del medio que representa un buen crecimiento. Para medios turbios se considera buen crecimiento cuando hay crecimiento en el medio sólido. Incubar el tubo en las condiciones especificadas en el método de prueba. Examinar el medio de crecimiento. Por ejemplo, un lote específico de agua peptonada amortiguada puede ser preparado para servir como pre enriquecimiento de los métodos descritos en el apéndice A, I y J de la NOM-210- SSA1-2014, por lo que para su evaluación deberán usarse cepas de Salmonella spp. y E. coli. Preparar inóculos independientes de cada 3 A veces las células pueden estar sedimentadas en el fondo del tubo, por lo que puede ser necesario agitar los tubos cuidadosamente para poder hacer una correcta interpretación. Página 23 de 35

24 General. 7. Método para la evaluación del desempeño de diluyentes. El método determina la capacidad del diluyente para mantener vivos a los microorganismos sin multiplicarse o reducirse durante un periodo de contacto hasta antes de que sean inoculados en agar o medio líquido. Procedimiento Realizar las diluciones y cálculos necesarios para obtener un inóculo adecuado que permita que después de inocular una porción del diluyente y sembrar 0.1mL por extensión en el agar de referencia se obtengan cuentas de aproximadamente 100 UFC. Por ejemplo: Inocular un tubo con 9mL del diluyente con 1mL de una suspensión del microorganismo conteniendo aproximadamente 10,000 UFC, homogeneizar. Inmediatamente tomar por duplicado 0.1mL del diluyente inoculado y sembrar por extensión en placa por duplicado sobre la superficie en agar de referencia (como AST) identificar las placas como t0 (La cuenta de UFC en la placa debe ser aproximadamente 100 UFC). Mantener el diluyente inoculado a temperatura ambiente por el tiempo especificado en el método de prueba empleado, entre la preparación de la suspensión inicial y el momento cuando el inóculo está en contacto con el medio de cultivo (normalmente 45 minutos). Mezclar y tomar el mismo volumen (0.1mL) e inocular por duplicado las placas de medio de referencia identificar como t1. Incubar los medios de referencia a una temperatura y tiempo apropiadas como 36 C +/- 1 C por 24 h. Lectura e interpretación de datos Después de la incubación contar las colonias en las placas a tiempo t0 y t1 y realizar los promedios de los duplicados. El número de microorganismos, t1, después de la incubación del diluyente debe estar dentro de ±30% de la cuenta inicial t0. FÓRMULA: (t 1 - t 0 )/t0 X 100 Donde: t 1= Promedio de la cuenta al tiempo final t 0=Promedio de la cuenta al tiempo inicial Página 24 de 35

25 8. Evaluación de desempeño de los medios de cultivo que se utilizan en los métodos de V. cholerae y V. parahaemolyticus. Los procedimientos que se describen a continuación están basados en los métodos antes descritos. Se describen en este apartado para dar mayor claridad a los usuarios sobre la evaluación particular de los medios de cultivo para la identificación o aislamiento de cepas de Vibrio. Y se contemplan algunos de los medios que se mencionan en los siguientes documentos: NOM-242-SSA B.19 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA INVESTIGACIÓN DE Vibrio cholerae y su Modificación del BAM Chapter 9, V. parahaemolyticus. B. Biochemical identification of isolates. Preparación de los cultivos. Por los propios requerimientos de los Vibrios es necesario considerar lo siguiente, las cepas pueden ser conservadas en BAB a temperatura ambiente. Cuando sea necesario a partir de estos cultivos de conservación inocular placas de agar T1N3 e incubar entre 35 C y 37 C entre 18 h y 24 h, utilizar estos cultivos como cepas de trabajo. Método para la evaluación de los Caldos triptona (T1Nx) Seleccionar una cantidad de tubos, inocular los caldos a evaluar con una asada de un cultivo de 24h (V.1 Preparación y cuantificación de medios de cultivo). Incubar los tubos de 35 C a 37 C por 18 h a 24 h. Examinar el crecimiento en el medio. El medio de cultivo pasa la prueba si se cumplen los siguientes criterios. V. cholerae T1NO positivo / turbidez T1N3 positivo / turbidez T1N6 negativo / sin cambio T1N8 negativo / sin cambio V. parahaemolyticus T1NO negativo / sin cambio T1N3 positivo / turbidez T1N6 positivo / turbidez T1N8 positivo / turbidez Método para la evaluación de los Agares T1Nx A Partir de cultivos de 24 h (V.1 Preparación y cuantificación de medios de cultivo), inocular en una placa del medio con cada microorganismo de prueba mediante estría de una sola línea recta, todos los cultivos pueden hacerse en la misma placa paralelamente sin que se crucen las estrías. Las estrías deben ser distinguibles para permitir la observación morfológica típica y tamaño de la colonia. Incubar de 35 C a 37 C por 18 h a 24 h. Examinar el crecimiento. El medio de cultivo pasa la prueba si se cumplen los siguientes criterios. V. cholerae T1N1 positivo / crecimiento T1N3 positivo / crecimiento V. parahaemolyticus T1N1 negativo / sin crecimiento T1N3 positivo / crecimiento. Página 25 de 35

26 9. Guía para la elaboración del Procedimiento de Preparación del Medio de Referencia (PMR). Introducción La preparación de medios de cultivo es un paso fundamental para asegurar la confiabilidad de los resultados del análisis microbiológico, la evaluación del desempeño de los medios de cultivo en general se realiza por comparación contra un medio de cultivo de referencia. La preparación del medio de cultivo de referencia, debe ser descrita en un procedimiento particular y es específica para cada laboratorio, por lo que en esta sección sólo se proveerán algunas guías o recomendaciones que permitirán a los laboratorios elaborar su propio procedimiento. Formulación del medio de cultivo de referencia. El medio de cultivo de referencia generalmente es un medio no selectivo como Agar Soya Tripticasa (BBL(MR) Cat , / Bioxon(MR) , Merck(MR) ), en el PMR se deberá indicar la marca(s) de medio de cultivo que utilice cada laboratorio. El laboratorio debe considerar que este medio de cultivo debe ser adecuado para recuperar todos los microorganismos que se utilicen para evaluar los medios de cultivo. Es recomendable que en medida de lo posible, siempre se utilice el mismo medio a lo largo del tiempo. Formulación típica del medio de referencia AST. Formulación (g/l) Digerido pancreático de caseína (tripticasa) 15 g Digerido papaico de soya (Phytone) 5 g Cloruro de sodio 5 g Agar 15 g ph final 7.3 ± 0.2 a 25 C Preparación La preparación del medio de cultivo se debe realizar siguiendo las instrucciones de preparación del fabricante. Sin embargo en el PMR se debe describir específicamente las actividades a realizar, indicando en la medida de lo posible, materiales y equipos a utilizar, con el propósito de reducir las variaciones entre lote y lote de preparación, debidas a la propia preparación del medio. Cuando se utilicen medios preparados en polvo, se debe considerar las instrucciones del fabricante para redactar el PMR. El siguiente texto es un ejemplo para la redacción para esta sección en el PMR. El procedimiento debe considerar que aquellos elementos que causan variación o alteración en el medio de cultivo, deben ser controlados específicamente; ya sea indicando sus características o señalando marcas, catálogos o números de identificación. Se deben considerar como puntos críticos los siguientes: Agua desionizada. Marca y catálogo de medio de cultivo. Tiempo y temperatura de calentamiento para disolver el agar. Recipiente en el que prepara el medio de cultivo. El autoclave. La marca y catálogo de las placas petri. El volumen de llenado. El material de empaque. Las condiciones de almacenamiento. El tiempo que se deja enfriar las placas. El agua de condensación (el cual se debe reducir). El ph final del medio de cultivo. Página 26 de 35