TÉCNICAS POLAROGRÁFICAS: DETERMINACIÓN DE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN SUSPENSIONES CELULARES DE CIANOBACTERIAS

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1 TÉCNICAS POLAROGRÁFICAS: DETERMINACIÓN DE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN SUSPENSIONES CELULARES DE CIANOBACTERIAS 1. BASES TEÓRICAS MEDIDA DE LOS INTERCAMBIOS DE OXÍGENO EN FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN MEDIANTE UN ELECTRODO DE OXÍGENO. En la fotosíntesis, la energía de la luz se absorbe por la clorofila y se usa para reducir el CO 2 a carbohidratos, desprendiéndose además O 2. Por lo tanto, si a una suspensión celular de cianobacterias se la ilumina y se la suministra CO 2 o bicarbonato, se desprenderá oxígeno que nos permitirá valorar el proceso fotosintético. El proceso respiratorio, por el contrario, da lugar a un consumo de oxígeno en la oscuridad. El oxígeno que se acumula durante la fotosíntesis o el que se consume durante la respiración se puede detectar polarográficamente por un electrodo tipo Clark. La versión Hansatech del típico electrodo Clark consiste en un cátodo de platino y un ánodo de Ag-AgCl (entre los cuales se establece un voltaje constante de V) inmersos en una solución saturada de KCl y separados de la solución problema por una membrana de teflón permeable al oxígeno, que se reduce en el cátodo. La membrana también atrapa una pequeña capa del electrolito sobre la superficie de los electrodos. Un papel espaciador se coloca por debajo de la membrana para proveer una capa uniforme de electrolito entre el ánodo y el cátodo. La intensidad de la corriente generada entre los electrodos es proporcional a la concentración de oxígeno en la solución. La corriente generada se convierte en una señal externa de voltaje por la caja de control en la que se sitúa el electrodo. La señal de medida es lo suficientemente grande para poder medirse en el rango de 1 voltio. La caja de control está, a su vez, conectada a un registrador u ordenador Diseño del electrodo La figura 1 muestra un diagrama del electrodo de Clark. El sensor (disco del electrodo) está localizado en la parte inferior de una cámara de reacción termostatizada por agua circulante. Un pequeño imán que agita la mezcla de reacción, rota directamente sobre el electrodo de platino cubierto con una membrana. La cámara de reacción se cierra con un émbolo que se puede ajustar a cualquier volumen entre 0.2 y 2.5 ml. Con una microjeringa se pueden añadir o eliminar soluciones desde la mezcla de reacción sin producir perturbaciones en el trazo del registrador. El disco del electrodo se puede quitar fácilmente para cambiar la membrana. Figura 1. Esquema del electrodo de oxígeno tipo Clark 1

2 Preparación y ensamblaje del electrodo Sobre el disco del electrodo limpio (la limpieza se lleva a cabo periódicamente frotándolo con una solución muy densa de óxido de aluminio) se añade una gota de electrolito (2.4 M KCl). Se coloca un papel espaciador de aprox. 2 cm 2 sobre el electrodo empapado de electrolito. Este papel espaciador (generalmente papel de fumar) se utiliza para proveer una capa uniforme de electrolito entre el ánodo y el cátodo. Figura 2. Ensamblaje del electrodo Sobre el papel de fumar, se coloca un trozo de membrana PTFE de aprox. 2 cm 2 y se asegura la membrana y el papel de fumar en su posición correcta mediante un anillo de goma que sirve para este propósito (Figura 2). Se debe revisar que la membrana no presente pliegues, arrugas, roturas o burbujas. En cualquiera de estos casos, se debe de retirar dicha membrana y comenzar el proceso de nuevo. Una vez que se ha preparado el electrodo, éste se inserta y ajusta en el fondo de la cámara de reacción. Tanto el electrodo como la caja de control y el registrador se han de encender 30 min antes de las medidas para que se estabilicen. Durante las medidas, la suspensión celular se mantiene en agitación y se controla la temperatura de la cámara de reacción mediante un baño de agua termostatizada Calibración rutinaria previa a la medida. El electrodo produce una corriente proporcional a la concentración de O 2. Para relacionar la lectura en mv de la caja de control con la concentración de O 2 (en micromoles), es necesario calibrar el electrodo: a. Ajuste a los niveles de saturación de O 2 en agua destilada: Para ajustar el electrodo a los niveles de saturación de O 2 del agua destilada a una determinada temperatura, se añade a la cámara del electrodo agua destilada que ha sido 2

3 agitada al aire y mantenida a la temperatura deseada durante unos minutos (agua saturada de O 2 ). Se observa que la lectura en mv se incrementa hasta que se estabiliza. b. Ajuste del cero eléctrico: Se añade agua destilada al electrodo y mientras se mantiene en agitación, se gasea con argón que desplaza el oxígeno del agua. Se observa que la lectura de la caja de control comienza a bajar rápido y después de 2 ó 3 min, la lectura se estabiliza en un valor que prácticamente coincide con el cero eléctrico del registrador. La tabla que aparece debajo muestra los niveles de saturación de O 2 en agua destilada a distintas temperaturas. Temperatura O 2 (ppm) O 2 (μmol/ml) 0 14,16 0, ,37 0, ,92 0, ,76 0, ,84 0, ,11 0, ,52 0, ,02 0,219 3

4 2. PRÁCTICA La práctica consiste en medir la actividad fotosintética (total y de cada uno de los fotosistemas) y actividad respiratoria, así como el contenido en pigmentos fotosintéticos (clorofila a y ficobiliproteínas) de cultivos de la cianobacteria filamentosa Anabaena sp. PCC7120. La práctica se llevará a cabo en dos sesiones (en días consecutivos) en grupos de 2-3 alumnos: I. Sesión 1: Se medirá la actividad fotosintética de los cultivos de Anabaena sp. utilizando distintas calidades de luz. Se medirá la actividad respiratoria de los mismos cultivos. Se determinará el peso seco de los cultivos. Se realizará la extracción de la clorofila a Se realizará la extracción y cuantificación de la ficobiliproteína ficocianina. Se realizarán espectros in vivo de los cultivos de las cianobacterias. II. Sesión 2: Se medirá el contenido de clorofila a extractos realizados en la sesión 1. Se medirá la actividad de cada uno de los fotosistemas de los cultivos de Anabaena sp. PCC7120. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA La actividad fotosintética se determina como desprendimiento de O 2. Una vez calibrado el electrodo, podemos medir el desprendimiento de O 2 de suspensiones celulares de cianobacterias: 1. Se añaden 2 ml del cultivo a la cámara del electrodo y se gasea con argón para bajar la saturación del O La medida se inicia iluminando la muestra con luz saturante (300 μe m -2 s -1 ) a partir de una fuente de luz fría; por lo general, el CO 2 en la muestra es saturante pero si es preciso se añade bicarbonato sódico ó potásico a una concentración final de 20 mm (añadir 40 μl de la solución de bicarbonato 1 M a la muestra en la cámara del electrodo). 3. Se sigue la evolución del desprendimiento de O 2 al menos durante 5-10 min. El electrodo da los valores como una tasa expresada en nmoles de O 2 /minuto. 4. La tasa fotosintética se expresa como μmoles de O 2 desprendidos por mg de clorofila y por hora. MEDIDA DE LA FOTOSÍNTESIS CON DISTINTAS CALIDADES DE LUZ. Se determinará la actividad fotosintética siguiendo el protocolo descrito en el apartado 2.1. utilizando, en lugar de luz blanca, luz roja y luz de 620nm (naranja)(figura 3) utilizando filtros específicos que se situarán en la fuente de luz fría. Las cianobacterias tienen dos complejos antena, uno para el fotosistema I y otro para el fotosistema II. El complejo antena del fotosistema I está compuesto fundamentalmente por clorofila a que absorbe la luz roja (665 nm) y la luz azul (435 nm) (Figura 4). El complejo antena del fotosistema II está compuesto por los ficobilisomas, formados por pigmentos (ficobilinas: aloficocianina, ficocianina y ficoeritrocianina) asociados a proteína (ficobiloproteinas) acopladas como se aprecia en figura 5; los máximos de absorción de la ficobiliproteinas también se muestran en la figura 4: nm (aloficocianina), nm (ficocianina) y 565 nm (ficoeritrocianina). 4

5 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD RESPIRATORIA La actividad respiratoria se determina como consumo de O 2. Las medidas se realizan de manera análoga a las de desprendimiento de O 2 pero la cámara del electrodo se mantiene en oscuridad. Los datos obtenidos se expresan como μmoles de O 2 consumidos por mg de clorofila y por hora. Filtro rojo Filtro 620nm Figura 3. Espectros de transmitancia de los filtros de la fuente de luz. Figura 4. Espectros de absorción de clorofilas (A), ficobiliproteínas y carotenoides (B) A B Figura 5. Disposición del ficobilisoma en la membrana tilacoidal (A) y la composición y distribución de las ficobiliproteínas dentro del ficobilisoma (B). 5

6 DETERMINACIÓN DEL TRANSPORTE ELECTRÓNICO FOTOSINTÉTICO: MEDIDAS DE LAS ACTIVIDADES DE LOS FOTOSISTEMAS I Y II EN CÉLULAS INTACTAS DE CIANOBACTERIAS Las membranas tilacoidales de cloroplastos de plantas, algas verdes y cianobacterias, pueden llevar a cabo las reacciones de oxido-reducción fotosintéticas, si están en presencia de aceptores y donadores de electrones, que tienen como misión la transferencia de electrones al NADP +, utilizando la energía de dos cuantos de luz por electrón. Los electrones son "activados" mediante dos fotorreacciones, sensibilizadas por los fotosistemas I y II (PS I y PS II), que están conectados por una cadena de transportadores electrónicos. El uso de diversos compuestos artificiales (aceptores y donadores de electrones) que son capaces de interaccionar a distintos niveles con la cadena de transporte de electrones fotosintética, nos permitirá separar las dos fotorreacciones citadas (Fig. 6). DCMU Figura 6. Esquema de las reacciones de oxido-reducción fotosintéticas en el que aparecen los algunos de los muchos inhibidores que afectan a la cadena fotosintética de electrones (PBQ: p-benzoquinona, DCMU: diclorometilurea, Asc: Ascorbato sódico, DPIP: diclorofenol-indofenol y MV:metilviológeno) Para la realización de las medidas de ambos fotosistemas, se necesita concentrar las células hasta conseguir µg de clorofila por ml de cultivo y para esta parte del experimento se van a necesitar 10 ml de cultivo concentrado ( µg de clorofila totales). Para ello, conociendo la concentración de clorofilas del cultivo, se realiza el cálculo pertinente y se toman los mililitros necesarios de éste para obtener la cantidad de clorofila indicada, se centrifuga a la máxima velocidad durante minutos y se resuspende en tampón Hepes 25 mm ph 7.5 hasta los 10 ml finales necesarios. 6

7 Actividad del Fotosistema I (PS I) En este caso, se utiliza como donador artificial de electrones al fotosistema I el par Ascorbato (Asc)-diclorofenol-indofenol (DPIP), y como aceptor final de electrones el metilviológeno, produciéndose consumo de oxígeno. Para inhibir el Fotosistema II, se añade el inhibidor específico DCMU; de este modo, esta reacción es dependiente de la cadena transportadora de electrones íntimamente asociada con el PS I (Fig. 6). La estimación del consumo de O 2 se realiza polarográficamente en el electrodo de O 2, situando 3 ml de mezcla de reacción (indicada en la tabla I) en la cámara del electrodo modelo Clark (Hach) a temperatura constante de 30 ºC, en agitación e iluminación saturante continua. Protocolo: 1. A un tubo de ensayo añadir 2.5 ml de las células previamente concentradas. 2. Añadir el DCMU, el Hepes y el KCl y mezclar bien. 3. Añadir a la mezcla celular del tubo de ensayo, el metilviológeno y la solución de DPIP y ascorbato y agitar. 4. Encender inmediatamente la luz y comenzar a registrar el consumo de O 2. El consumo de O 2 se estima como μmol de O 2 consumido x mg Cl -1 x h -1. Tabla I. Compuestos y cantidades utilizados para la medida de la actividad del PS I [Stock] [Final] Volumen Final (3ml) Células (10-15 µg clorofila/ml) 2.5 ml DCMU 0.6 mm 10 μm 50 µl Hepes ph M 25 mm 150 μl KCl 1.5 M 50 mm 100 μl Metilviológeno 2.5 mm 83 μm 100 μl DPIP 1.5 mm y Ascorbato Na 150 mm 50 μm/ 5 mm 100 μl Actividad del Fotosistema II (PS II) Se utiliza como donador de electrones el agua y como aceptor artificial la quinona p- benzoquinona (PBQ). Se añade ferricianuro potásico para tener a la quinona en la forma oxidada. La reducción de la quinona junto con la liberación de oxígeno es absolutamente dependiente del PS II, no mostrando ningún requerimiento del PS I o de un acoplamiento redox entre los dos fotosistemas (Fig. 6). Se estima la actividad del PS II como desprendimiento de O 2 utilizando el electrodo de O 2; para ello, se sitúan 3 ml de mezcla de reacción (indicada en la tabla II) en la cámara del electrodo modelo Clark (Hach) a temperatura constante de 30 ºC, en agitación e iluminación continua. La liberación de O 2 se estima como μmol de O 2 liberado x mg Cl -1 x h -1. 7

8 Protocolo: 1. A un tubo de ensayo añadir 2.5 ml de las células previamente concentradas. 2. En el tubo de ensayo mezclar (muy bien) las células con el Hepes y el KCl. 3. Poner esta mezcla celular en la cámara del electrodo, gasear con argón para disminuir los niveles de O Añadir en la cámara el ferricianuro y en último lugar la PBQ. 5. Inmediatamente, encender la luz y comenzar a registrar el desprendimiento de O 2. Tabla II. Compuestos y cantidades utilizados para la medida de la actividad del PS II. [Stock] [Final] Volumen Final (3ml) Células (10-15 μg clorofila/ml) 2.5 ml Hepes ph M 25 mm 150 μl KCl 1.5M 50 mm 100 μl Ferricianuro K 25 mm 0.42 mm 50 μl PBQ 30mM 2mM 200 μl *La solución de ferricianuro se prepara en el momento en agua. La solución de PBQ (metanol) y la de DPIP y ascorbato (agua) también se preparan en el momento. 8

9 CÁLCULO DEL PESO SECO Se mide la densidad óptica del cultivo a 750 nm y se aplica la siguiente fórmula: mg Peso Seco/ml = X DO 750nm EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Determinación del contenido en clorofilas Se centrifuga 1 ml de cultivo en una centrífuga eppendorf durante 10 min a máxima velocidad. Se descarta el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 1 ml de metanol puro. Se agita bien la mezcla y se mantiene 24 h a 4ºC en oscuridad. Tras ello, se centrífuga 5 min a la máxima velocidad y se recoge el sobrenadante. Se mide la D.O. del sobrenadante a 665 nm en un espectrofotómetro, usando como blanco metanol. Para calcular la concentración de clorofila, se aplica la fórmula de Marker, midiendo la concentración de clorofila en µg/ml a partir de la siguiente ecuación: µg Clorofila/ml = X DO 665nm Determinación de la ficobiliproteína ficocianina 1. Se parte de un volumen inicial de 1,5 ml de cultivo. 2. Se centrífuga 10, y se retira todo el sobrenadante. 3. Resuspender las células en 1,5 ml de agua destilada. 4. Añadir 50 μl de tolueno. 5. Agitar vigorosamente en vortex durante al menos. 6. Dejar reposar un tiempo mínimo de 30 en oscuridad. 7. Se centrífuga 10, se observa el sedimento, el sobrenadante y una fase superior de tolueno con algunos restos celulares. 8. Se recoge 1 ml del sobrenadante con las ficocianinas (color azulado), procurando no coger ni sedimento ni la fase superior de tolueno para evitar restos celulares (utilizar una punta de pipeta por muestra). 9. Se mide en el espectro, tomando como blanco agua destilada. 10. La concentraciones de la ficocianina se obtendrá de la siguiente fórmula: µg Ficocianina/ml = 135 x DO 620nm Obtención de espectros in vivo Se recogerán 3 ml de cultivo y se realizará, usando un espectrofotómetro, un barrido de longitudes de onda desde 400nm hasta 750 nm para determinar el espectro de acción de las diferentes cepas de cianobacterias debido a la presencia de los pigmentos fotosintéticos. 9

10 Figura 7. Esquema resumen de los transportes electrónicos fotosintéticos lineal y cíclico en cianobacterias (adaptado de 10

11 Figura 8. Esquema de los transportes electrónicos fotosintético y respiratorio en Synechocystis sp. PCC 6803 (adaptado de Pils y Schmetterer, 2001). Se encuentran representados los lugares de acción de los inhibidores HQNO (2-heptyl-4-hydroxy-quinoline-N-oxide), PCP (pentaclorofenol), CN (KCN) y Azida. MP (membrana plasmática), MT (membrana tilacoidal). 11

12 MEDIDAS DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO MEDIDAS DE CONTENIDO CELULAR DE PIGMENTOS A.PESO SECO mg PS/ml B.CLOROFILAS μg Cla/ml C.FICOCIANINAS μg FC/ml D.CONT. CLOROFILAS μg Cla/ mg PS E.CONT. FICOCIANINAS μg FC /mg PS F.CONT. FICOCIANINAS μg FC / μg Cla 0,396xDO 750nm -0,004 13,14xDO xDO 620 B/A C/A C/B 12

13 CÁLCULOS TASA FOTOSINTÉTICA, RESPIRATORIA, FOTOSISTEMA I Y FOTOSISTEMA II G.TASA DE O 2 BRUTA nmol O 2 /ml min H. TASA DE O 2 BRUTA nmol O 2 /ml h I. CLOROFILAS mg Cla/ml J.TASA FOT, RESP, FSI, II nmol O 2 /mg cl h K.TASA FOT, RESP, FSI, II μmol O 2 /mg cl h Dato electrodo Gx60 Bx10-3 H/I J/10 3 FOTOSÍNTESIS LUZ BLANCA FOTOSÍNTESIS LUZ ROJA FOTOSÍNTESIS LUZ 620 nm RESPIRACIÓN *FOTOSISTEMA I *FOTOSISTEMA II 13