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1 Bioquímica Experimental Inicio I Prefacio I ContenidoI Santa Rita Cruz Arroyo. ANTECEDENTES. El grado de ionización del agua es una propiedad reversible, se describe mediante una constante de equilibrio, al llevarse a cabo se obtiene un ión hidrógeno (protón) y un ión hidroxilo. H 2 O H + + OH - Cuando se disuelven en agua ácidos débiles, aportan H + por ionización; las bases consumen H + al protonarse. El ph de la solución es la concentración total de ión hidrógeno y se puede medir experimentalmente. Para determinar el estado de ionización de los solutos en agua se debe determinar la constante de equilibrio. Aunque el producto de disociación del agua es normalmente conocido como H +, los protones libres no existen en disolución, éstos iones hidrógenos son hidratados rápidamente a iones hidronio (H 3 O + ). La disociación de protones es instantánea debido a los puentes de hidrógeno que se forman entre las moléculas de agua. Existe un movimiento de los iones hidronio e hidroxilo en el campo eléctrico, esto debido al salto de protones, causando un movimiento neto de un protón a una gran distancia en un tiempo muy corto. Por la rápida movilidad del H + y del OH - (pero en dirección opuesta), las reacciones ácido-base en las disoluciones acuosas son en general rápidas. La importancia de lo anterior radica en las reacciones de transferencia de protón biológicas. El grado de ionización del agua en términos cuantitativos está determinado por constante de equilibrio (K eq ), misma que se ha definido en función de la concentración de los reactivos [A y B] y de los productos [C y D]. K eq = [C] [D] [A][B] La unidad de concentración que se utiliza en el cálculo del K eq es la molaridad. La constante de equilibrio es fija para cada reacción química a una temperatura dada, define la composición de la mezcla final, independiente de las cantidades iniciales de reactivos y productos. Por lo tanto K eq se puede calcular si se conocen las concentraciones en el equilibrio de todos los reactivos y productos. La constante de equilibrio para la ionización reversible del agua es: K eq = [H + ] [OH - ] [H 2 O] El resultado de ésta se denomina producto iónico del agua. Una solución está a un ph neutro cuando hay concentraciones idénticas de H + y OH - a este ph se puede calcular la concentración del H + y OH - a partir del producto iónico del agua: K w = [H + ] [OH - ] = [H + ] 2 [H + ] = K w = 1 x Μ 2 [H + ] = [OH - ] = 10-7 Μ Siempre que [H + ] sea mayor que 1 x 10-7 Μ, [OH - ] será menor que 1 x 10-7 Μ, y viceversa. Cuando la [H + ] es muy alta como en una solución de ácido clorhídrico, [OH - ] será muy 37

2 pequeña. A partir del producto iónico del agua se puede calcular [H + ] si conocemos [OH - ] o viceversa Escala de ph. Su base la constituye el producto iónico del agua, es una forma indicada de designar la concentración de H +, en una solución acuosa de 1.0 M de H + y 1.0 M de OH -. Se define ph de la siguiente manera: logaritmo negativo de la concentración del ión hidrógeno : ph = log 1 = -log [H + ] [H + ] Las soluciones que tienen un ph superior a 7 son alcalinas o básicas; la concentración de OH - es mayor que la de H +, las soluciones inferiores a ph 7 son ácidas. La escala de ph es logarítmica no aritmética, es decir cuando entre dos soluciones hay una diferencia de 1 unidad de ph, esto significa que una solución tiene una concentración de H + diez veces mayor a la otra. ÁCIDO NEUTRO ALCALINO ph [H + ] Moles X Litro [OH + ] La medición aproximada del ph de una solución acuosa, se puede realizar experimentalmente mediante colores indicadores como: tornasol, fenolftaleína y rojo fenol su actividad se debe a los cambios de color cuando el protón de la molécula del colorante se disocia. Se puede realizar también mediante un eléctrodo de vidrio permitiendo una mayor precisión, el potenciómetro amplifica la señal del electrodo de vidrio y se compara con la señal generada por una solución de un ph conocido con exactitud. Breviario clínico: El ph sanguíneo y de orina nos permiten ser un elemento auxiliar de diagnóstico en enfermedades como diabetes (al presentar acidosis ph inferior a 7.4); en otros padecimentos suele presentarse un signo contrario denominado alcalosis Ácidos y bases débiles. Los ácidos se definen como donadores de protones y las bases como aceptores de protones. Existen ácidos fuertes como son el clorhídrico, sulfúrico y nítrico, éstos están completamente ionizados en soluciones acuosas diluidas y las bases fuertes como el hidróxido de sodio y de potasio comparten la misma característica de ionización en soluciones acuosas. El término ácido y base débil se refiere a los que no están totalmente ionizados al disolverse en agua, su importancia biológica radica en el metabolismo y la regulación del mismo. Un par ácido-base conjugado lo forman un donador de protón y su correspondiente aceptor, 38

3 ejemplo de ello es el ácido acético (CH 3 COOH) como donador de protones y el anión acetato (CH 3 COO - ) como aceptor de protones. CH 3 COOH H + + CH 3 COO - HA H + + A - K eq = [H + ] [A - ] = K a [HA] Los ácidos pierden su protón en una solución acuosa, si éste es más fuerte, mayor es su tendencia a perderlo. La constante de equilibrio (K eq ) se define como la tendencia de cualquier ácido (HA) a perder un protón y formar su base conjugada (A - ). Constante de disociación o ionización (K a ), es así como más frecuentemente se denomina a las constantes de equilibrio de las reacciones de ionización. Los ácidos fuertes tienen una K a alta, y la de los débiles es más baja. Existen compuestos monopróticos (sólo ceden un protón) como el ácido acético; dipróticos (ceden dos protones) como la glicina y tripóticos (ceden tres protones) como el ácido fosfórico. Sus reacciones de disociación tienen lugar en un gradiene de ph, para cada una de éstas reacciones existe su constante de equilibrio o disociación (K a ) y su pk a (algoritmo negativo) es análogo al ph. pk a = log 1 = -log K a K a Cuando es más fuerte la tendencia a disociar un protón, más fuerte es un ácido y menor su pk a Titulación. Para determinar la cantidad de una ácido en una solución dada, se titula un volumen determinado de ácido con una solución base fuerte (hidróxido de sodio NaOH), de la cual conocemos su concentración, ésta base se va a ir agregando en pequeñas porciones hasta lograr neutralizar el ácido, de va determinando mediante un colorante indicador o un potenciómetro, es decir se calculó la concentración del ácido a partir del volumen y la concentración del NaOH agregado. Al principio del procedimiento, el ácido acético (sin haber agregado cantidad alguna de NaOH) ya está ligeramente ionizado. Después de ir incorporando en pequeñas cantidades NaOH, el OH - agregado se va a combinar con el H + libre en la solución para formar H 2 O, para lograr un equilibrio. Después de que se elimina H + libre, el HAc (ácido) se disocia más para satisfacer su propia constante de equilibrio. En el punto medio de la valoración, en el que se ha agregado exactamente 0.5 equivalentes de NaOH, se ha disociado la mitad del ácido acético original de modo que la concentración del donador de protones (HAc) es igual a la del aceptor de protones (Ac - ), en este punto medio existe una relación importante: el ph de la solución es igual al pk a del ácido acético. Continuando con la titulación, adicionando más cantidad de NaOH, el ácido acético seguirá disociándose y se convertirá en acetato. El punto final estará situado alrededor de un ph 7.0, entonces el ácido acético habrá perdido todos sus protones, donándolos al OH -, para formar H 2 O y acetato. Hay en toda la titulación una existencia compartida de equilibrios, cada una cumpliendo con su constante de equilibrio. Tampones biológicos La importancia del procedimiento de titulación, radica al evaluar el comportamiento gráfico de un ácido débil, porque muestra que éste y su anión, un par ácido base-conjugado pueden actuar como tampones. Los organismos multicelulares mantienen un ph citosólico específico y constante, que permite la opitimización de su funcionamiento, los fluídos extracelulares también deben estar equilibrados y regulados, la constancia de ph se consigue mediante tampones biológicos. 39

4 Tampón biológico: mezclas de ácidos débiles y bases conjugadas, sistemas acuosos, resisten cambios en su ph cuando se añaden cantidades pequeñas de ácidos o bases. Como se explicó anteriormente en el apartado de Titulación, una mezcla de igual concentración de ácido acético y de ión acetato, en el punto medio de su curva, cuando ph = pk a, es un sistema tampón. Breviario clínico: La principal función de la hemoglobina es transportar oxígeno desde los pulmones a los tejidos, una pequeña disminución del ph de los tejidos debido a la producción de dióxido de carbono y de hidrogeniones como resultado de la activa respiración hística, facilita la descarga del oxígeno cuando y donde se requiere. La descarga de oxígeno va acompañada de la incorporación de protones por parte de la hemoglobina, con lo que simultáneamente ayuda a tamponar el sistema. Ecuación Henderson-Hasselbalch. Para comprender la acción de los tampones y el equilibrio ácido-base en las reacciones fisiológicas, debemos comprender la ecuación de Henderson-Hasselbalch, es una forma más sencilla de la expresión de la constante de disociación de un ácido. Para el caso de una disociación de un ácido débil HA en H + y A -, la ecuación de Henderson- Hasselbach se deduce así: K a = [H + ] [A - ] [H A] 1. Se despeja [H + ] [H + ] = K a = [HA] [A - ] 2. Tomando el logaritmo negativo en ambos miembros: -log [H + ] = -log K a - log [HA] [A - ] 3. Sustituyendo -log [H + ] por -log K a por pk a ph = pk a - log [HA] [A - ] 4. Invirtiendo ahora - log (HA)/ (A - ), lo que implica cambiar su signo, se obtiene la ecuación de Henderson-Hasselbalch : ph = pk a + log [A - ] [HA] 5. Se enuncia en forma general: ph = pk a + log [aceptor de protones] [donador de protones] Esta se ajusta a la curva de valoración de todos los ácidos débiles. Muestra que el pk a de un ácido débil es igual al ph de la solución en el punto medio de su valoración. Es decir [HA] = [A - ] y de ahí: ph = pk a + log 1.0 = pk a + 0 = pk a 40

5 La ecuación de Herdenson- Hasselbalch permite 3 cosas importantes: 1. Calcular el pk a a partir del ph y la relación molar entre donador y aceptor de protones. 2. Calcular el ph a partir del pk a y la relación molar entre donador y aceptor de protones. 3. Calcular la relación molar entre donador y aceptor de protones, conocidos el ph y el pk a Ejemplo para la utilización de la ecuación de Henderson-Hasselbalch. Calcular el pk a del ácido láctico, si su concentración en forma libre es de M y la concentración de lactato es de M, con un ph de ph = pk a + log [lactato] [ácido láctico] pk a = ph - log [lactato] [ácido láctico] = 4.80 log = 4.80 log 8.7 = = 3.86 PROTOCOLO. Para la realización de la segunda práctica de laboratorio de la asignatura de Bioquímica, Titulación Ácido-Base es importante el conocimiento de las medidas de seguridad requeridas antes, durante y después de su realización. La bata en el laboratorio es imprescindible para evitar deterioros en la ropa por quemaduras, manchas, etc. Deberá ir siempre abrochada. Las quemaduras por ácidos o bases concentrados se tratan lavando la zona afectada con agua durante 3-4 minutos, pudiéndose aplicar después una disolución diluida de bicarbonato sódico o ácido acético, respectivamente. No deben olerse directamente los vapores desprendidos No fumar ni comer en el laboratorio. No introducir pipetas, varillas de vidrio ni cualquier otro objeto en los frascos de los reactivos, porque se contaminan. No depositar en ningún caso papeles o productos sólidos a las tarjas. Una vez terminada la práctica deje el lugar ocupado perfectamente limpio. Antes de abandonar el laboratorio, compruebe que el agua y el gas están completamente cerrados. Al abandonar el laboratorio se lavarán las manos. 41

6 HIPÓTESIS. DISCUSION. Si el ácido acético es una ácido débil entonces su constante de disociación es muy alta. Si el ácido acético no es un ácido débil entonces su constante de disociación no es muy alta. Si el punto medio de la titulación del ácido acético se logra al haber añadido.5 equivalentes de hidróxido de sodio (NaOH) entonces se ha disociado la mitad de éste por lo tanto la concentración del donador de protones es igual a la del aceptor de protones. Si el punto medio de la titulación del ácido acético no se logra al haber añadido 0.5 equivalentes de NaOH entonces no se ha disociado la mitad de éste, por lo tanto la concentración del donador de protones no es igual a la del aceptor de protones. Si el par ácido-base conjugado como ácido acético-acetato tienden a resistir un cambio en el ph cuando se añaden cantidades pequeñas de la base logrando el restablecimiento de su equilibrio de disociación, entonces el par ácido acéticoacetato actúa como sistema tampón. Si el par ácido-base conjugado como ácido acético-acetato no tienden a resistir un cambio en el ph cuando se añaden cantidades pequeñas de la base logrando el restablecimiento de su equilibrio de disociación, entonces el par ácido acéticoacetato no actúa como sistema tampón. En la práctica las disoluciones tampón generalmente consisten en una mezcla de un ácido o base débil y su sal, ejemplo de esto es el ácido acético y el acetato sódico que a decir de la nomenclatura de Brönsted y Lowry es una mezcla de un ácido y base débiles conjugados. En esta disolución del ácido débil que se representa como (HA) y de su sal (A - ), los iones hidrógeno añadidos son neutralizados por los aniones de la sal, la cual va a actuar por lo tanto como una base débil y a la inversa, los iones hidroxilo (OH) que se fueron añadiendo gradualmente resultan eliminados por neutralización del ácido. De todo lo anterior resulta claro que la capacidad de tamponamiento de una determinado ácido y su base conjugada será máxima cuando sus concentraciones sean iguales, esto es, cuando el ph es igual al pk a del ácido, reportado en la literatura que el cumplimiento de esta situación es a un pk a igual a 4.76 del ácido acético. La capacidad de tamponamiento dependerá de la concentración total, así como de la relación entre el ácido y la sal, es decir cuanto mayor sea la concentración total, mayor será la capacidad de tamponamiento. La concentración usual del ácido y de la sal en las disoluciones tampón se ha reportando que se ubica en el orden de molxdm -3 y generalmente la mezcla posee una capacidad de tamponamiento aceptable dentro del rango ph = pk a +1. Existen criterios acerca de las amortiguadores o tampones adecuados para que éstos puedan o no ser utilizados como parte de un procedimiento en la investigación bioquímica, se citan a continuación: - Deben poseer la adecuada capacidad de tamponamiento en al gama de ph requirido (6.0 a 8.0) - Deben ser asequibles con una alto grado de pureza. - Deben ser muy solubles en el agua e impermeables a las membranas biológicas. - Deben ser enzimática e hidrolitícamente estables. 42

7 - Su ph debe ser minímamente influenciable por su concentración, por su temperatura y por la composición iónica o efecto salino del medio. - No deben ser tóxicos ni inhibidores biológicos. - Sus complejos con los cationes deben ser solubles. - No deben absorber luz de las regiones visibles y ultravioletas. Es importante el reconocimiento de que no todas las sustancias amortiguadores o los tampones, cumplen con estas condiciones, los fostatos, precipitan los cationes polivalentes y actúan como metabolitos o inhibidores en algunos sistemas; el Tris suele ser tóxico o ejerce también acciones inhibitorias. El HEPES y el PIPES actualmente satisfacen las condiciones requeridas. La ionización de los ácidos y bases débiles es de una importancia crucial en bioquímica, debido que la mayoría de los procesos relevantes van a tener lugar en una intervalo de ph de 6.5 y 8.0 que algunos autores llaman margen fisiológico. El par ácido acético-acetato bibliográficamente ha reportado su equilibrio de disociación en un ph de 7.0, logrando situarse, entonces en el llamado margen fisiológico. La importancia de saber aplicar correctamente la ecuación Henderson-Hasselbalch es que nos permite obtener la relación de proporcionalidad entre la base conjugada/ácido no disociado con el ph y el pk a definiendo así el comportamiento de los ácidos débiles y bases conjugadas. En el desarrollo de la práctica es importante observar que la curva par el HCl es muy diferente a las observadas en los ácidos débiles., las curvas de la mayoría de los ácidos débiles tienen formas muy similares, como era de esperarse por la ecuación, su diferencia está en que se encuentran a distintos niveles en la escala de ph, la posición de la escala ocupada por la curva de ácido dado está determinada por el valor del pka del ácido, como el pk de un ácido representa el ph de una solución que contiene sal y ácido en concentraciones iguales, es evidente que pk representa el ph al cual el ácido esta a la mitad de su titulación. La mayor parte de la curva de titulación de un ácido débil se extiende por un intervalo de 4+ unidades de ph. Si una ácido tiene un valor de pk 6 se titulará poco a poco por debajo de ph 4 y estará titulado hasta la mitad a ph 6 y se habrá convertido en sal o base a un ph de 8 o por encima de él; pero si un ácido tiene un pk de 10 empieza a formar una sal a un ph cercano a 8 está titulado a la mitad en un ph 10 y se convertirá en sal a un ph de 12. Las curvas de titulación de los ácidos débiles o también en la literatura denominadas curvas de amortiguadores se interrumpen completamente cerca de ambos extremos y son relativamente planas en las secciones centrales. Decimos que una solución esta mal titulada cuando las concentraciones de base y ácido son muy diferentes y bien amortiguadas o tituladas cundo sus concentraciones se acercan en su valor, por lo anterior podemos darnos cuenta al observar nuestra curva de titulación y escoger las concentraciones de base y ácido que tendrán buena capacidad amortiguadora. La importancia del uso de indicadores que cambian de color alrededor de ph 4.5 puede usarse cuando se trata de un ácido fuerte como el HCl porque éste, esta convertido en base a ese ph, no así en el caso del ácido acético porque esta solución esta fuertemente amortiguada y el cambio del indicador es gradual a causa del cambio lento en el ph, por lo que no puede definirse con exactitud un punto final de titulación. Experimentalmente esto lo pudimos comprobar en el desarrollo de la práctica al añadir gradualmente NaOH y registrar los cambios observados en el viraje del color del indicador y sus correspondencia inmediata con el ph también registrado. Las curvas de titulación que se llevan a cabo como base del procedimiento experimental de ésta práctica muestran que el cambio de ph con la adición de un ácido o una base es más gradual en el margen cercano al pk a del ácido, este es el fundamente para la preparación de las soluciones amortiguadoras. Las curvas de titulación son reversibles de ahí que si tomáramos la solución final, a un ph alto y empezamos a añadir un ácido fuerte como el HCl se traza la misma curva pero en sentido opuesto, ese es su fundamento. 43

8 MATERIAL DIDÁCTICO. PII. TITULACIÓN ÁCIDO-BASE BIBLIOGRAFÍA. Williams L. Byron. Keit Wilson. Principios y técnicas de Bioquímica Experimental. Ediciones Omega. Barcelona Nelson L.D. Cox M.M. Claudi M.C. Lehninger. Principios de Bioquímica. Ediciones Omega. Barcelona Mathews K. C. Bioquímica. 3a.ed. Pearson Educación. Madrid Staunton West. Bioquímica Médica. 4a.ed. Interamericana. México CUESTIONARIO. 1. Iones hidrógeno e iones hidroxilo, son productos de ionización del? a) Ácidos b) Bases c) ácidos y bases débiles d) ácidos y bases fuertes e) agua 2. Se define en función de la concentración de los reactivos y de los productos? a) Ionización b) ph c) constante de equilibrio d) titulación e) pka 3. Representa el logaritmo negativo de concentración del ión hidrógeno? a) pka b) Kw c) Keq d) ph e) ionización 4. Un donador de protón y su correspondiente aceptor forman? a) par ácido-base conjugado b) ácido c) base d) ácidos y bases débiles e) ácidos y bases fuertes. 5. Las constantes de equilibrio de ionización se denominan frecuentemente? a) Keq b) pka c) ph d) constante de disociación e) ionización 6. En la titulación del CH 3 COOH, su pka es de? a) 3.76 b) 5.76 c) 4.67 d) 4.76 e) El pka es análogo al? a) Kw b) Keq c) Ka d) ph e) Ka 8. Son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios en su ph? a) ácidos b) bases d) par ácido-base e) tampones f) ácidos y bases fuertes 9. De acuerdo a la respuesta anterior, ejemplo de ellos son? a) ácido acético b) sistema del fosfato y bicarbonato c) ácidos y bases fuertes d) el plasma sanguíneo e) ventilación pulmonar 10. En la práctica de titulación ácido-base, el azul de bromotimol, es un ejemplo de? a) solución ácida b) solución básica c) solución indicadora de ph d) amortiguador e) bases fuerte 11. Nos permite calcular que el pka de una ácido débil es igual al ph de la solución en el punto medio de su valoración a) ph b) Keq c) Kw d) log Ka e) ecuación de Herderson-Hasselbalch 12. Muestra gráficamente el pka de un ácido débil. a) escala de ph b) salto de protones c) sistema de tamponamiento d) ionización e) curvas de titulación 44

9 MATERIAL DIDÁCTICO. 1/11 TITULACIÓN ÁCIDO-BASE 2/11 INTRODUCCIÓN Un par ácido-base conjugado lo forman un donador de protón y su correspondiente aceptor, ejemplo de ello es el ácido acético (CH 3 COOH) como donador de protones y el anión acetato ( CH 3 COO - ) como aceptor de protones. CH 3 COOH? H + + CH 3 COO - HA? H + + A - K eq = [H + ] [A - ] = K a [HA] 45

10 3/11 Titulación. Para determinar la cantidad de un ácido en una solución dada, se titula un volumen determinado de ácido con una solución base fuerte (hidróxido de sodio NaOH), de la cual conocemos su concentración, ésta base se va a ir agregando en pequeñas porciones hasta su totalidad y lograr neutralizar el ácido, de va determinando mediante un colorante indicador o un potenciómetro, es decir se calculó la concentración del ácido a partir del volumen y la concentración del NaOH agregado. 4/11 Tampón biológico: mezclas de ácidos débiles y bases conjugadas, sistemas acuosos, resisten cambios en su ph cuando se añaden cantidades pequeñas de ácidos o bases. Como se explicó anteriormente en el apartado de Titulación, una mezcla de igual concentración de ácido acético y de ión acetato, en el punto medio de su curva, cuando ph = pk a, es un sistema tampón. 46

11 TITULACIÒN ÁCIDO-BASE OBJETIVO: 5/11 Realizar una curva de titulación de un ácido fuerte y una base débil 6/11 MATERIAL POR EQUIPO 47

12 7/11 SOLUCIONES O.1 M ÁCIDO ACÉTICO O.1 M GLICINA O.1 M DE NaOH ÁCIDO CLORHÍDRICO? AZUL DE BROMOTIMOL 1% 48

13 10/11 DATOS ACIDO CLORHÍDRICO ACIDO ACÉTICO ph NaOH ml Color ph NaOH ml Color 49

14 GRAFICAR RESULTADOS 11/11 50

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