Redalyc. Disponible en:

Transcripción

1 Redalyc Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Bouvet, Beatriz Reina;Paparella, Cecilia Vicenta;Feldman, Rodolfo Néstor Relacion del estrés oxidativo con la funcionalidad espermática en hombres con infertilidad idiopática Bioquímica y Patología Clínica, Vol. 71, Núm. 3, 07, pp Asociación Bioquímica Disponible en: Bioquímica y Patología Clínica ISSN (Versión impresa): info@aba-online.org.ar Asociación Bioquímica Cómo citar? Número completo Más información del artículo Página de la revista Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº 3 07 Trabajo: págs Pág 29 Relacion del estrés oxidativo con la funcionalidad espermática en hombres con infertilidad idiopática Beatriz Reina Bouvet 1 Cecilia Vicenta Paparella 1 Rodolfo Néstor Feldman 2 1 Bioquímica 2 Médico Endocrinólogo Andrólogo Lugar de Trabajo: Area Química Analítica Clínica, Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacia, Servicio de Reproducción Fac. Cs. Médicas. Universidad Nacional Rosario Enviar Correspondencia a: Beatriz Reina Bouvet Gabriel Carrasco Rosario Provincia de Santa Fe beatriz bouvet@arnet.com.ar RESUMEN La membrana espermática tiene alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados y es vulnerable al ataque de sustancias oxígeno reactivas. Un desbalance entre pro y anti oxidantes produce estrés oxidativo (EO) que altera estructuras esenciales para el proceso de fecundación. Nuestro objetivo fue estudiar en semen de hombres con infertilidad idiopática, el EO y su relación con funcionalidad de membrana, integridad del ADN y madurez nuclear. Se efectuó espermograma según normas OMS a 142 hombres infértiles, se seleccionaron 83 muestras sin aglutinación ni hiperviscosidad y con concentración espermática mayor de 5x10 6 /ml. Se estudió: membrana con el Test Hipoosmótico, cromatina con Azul de Anilina y ADN con Naranja de Acridina. El EO se evaluó con el Test MOST (modified sperm stress test), usando el valor 0. para separar las muestras en dos : MOST>0. (normal) y MOST < 0. (anormal). Cuando MOST era anormal, las tres variables estaban alteradas y la diferencia fue significativa (p<0.0021). El EO afecta estructuras esenciales y debe incorporarse como test de función espermática. Palabras claves espermatozoide, estrés oxidativo, ADN, membrana espermática, fertilidad masculina SUMMARY The sperm membrane has high content of unsaturated fatty acids and is vulnerable to the attack of reactive oxygen substances. The disbalance between pro and anti oxidants produces oxidative stress (OS) which alters essential structures for the process of fecundation. Our aim was to study in semen from infertile men, the OS and its relationship with the function of the membrane, integrity of DNA and nuclear maturity. 142 semen samples from infertile men were studied according to WHO; 83 samples without agglutination and hyperviscosity and with concentration of spermatozoids more of 5x10 6 /ml were chosen. The membrane was studied with the Hypoosmotic Test, the chromatin with Blue Aniline and nuclear DNA with Acridine Orange. The OS was evaluated with the MOST Test (modified sperm stress test) using the value 0. to separate the samples in two groups: MOST > 0. (normal) and MOST < 0. (abnormal). The three variables were altered when MOST was abnormal and the difference was significant (p<0.0021). The OS affects essential structures and must be included as sperm function test. Key words spermatozoid, oxidative stress, DNA, sperm membrane, male infertility Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN Código Bibliográfico: RByPC Trabajo Recibido: Aceptado:

3 Relacion del estrés oxidativo con la funcionalidad espermatica en hombres con infertilidad idiopatica INTRODUCCIÒN Un factor significativo en la etiología de la infertilidad masculina es la pérdida de la función espermática como consecuencia del estrés oxidativo (EO), que es generado por la excesiva producción de sustancias oxígeno reactivas. El metabolismo normal del oxígeno produce sustancias oxígeno reactivas (ROS) tales como: anión superóxido, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo, que afectan la función espermática. ( 1 ) La membrana espermática tiene alto contenido de fosfolípidos unidos a ácidos grasos insaturados que la hacen vulnerable a cambios peroxidativos. La acción de las ROS involucra la formación de hidroperóxidos en la membrana plasmática, alterando la fluidez de la misma y afectando profundamente el comportamiento espermático (migración, capacitación, unión y fusión de las gametas). La calidad de la membrana celular depende de su capacidad de permitir el transporte de determinados fluidos y ciertas moléculas a través de ella. Basándose en esta propiedad se desarrolló un test denominado Test Hipoosmótico, muy utilizado para determinar la integridad funcional de la membrana plasmática. (2) La producción de ROS se mide por diferentes métodos: bioquímicos, luminiscentes, enzimáticos, también estimando la resistencia a la lipoperoxidación por medio de bioensayos. Entre estos últimos el test de estrés espermático (MOST) evalua la disminución de motilidad causada por la producción endógena de peróxidos, al exponer los espermatozoides a temperaturas entre 24 y ºC. Un desbalance entre la generación de ROS y los mecanismos de defensa antioxidantes producen una situación de EO. El MOST es considerado un test predictor de capacidad fertilizante espermática. (3,4 ) La integridad del ADN espermático es fundamental en el proceso de fecundación y está protegido del EO por el alto empaquetamiento de su genoma y la presencia de antioxidantes a nivel celular y en el plasma seminal. La cromatina espermática es una estructura altamente organizada, compuesta por ADN y nucleoproteínas. Su insolubilidad y el alto grado de condensación protegen la integridad del genoma paterno durante el transporte del espermatozoide por el tracto reproductor masculino y femenino. Durante la espermatogénesis las histonas, proteínas clásicas de empaquetamiento del ADN en las células somáticas, son reemplazadas por proteínas de transición y posteriormente en un 85% por proteínas más pequeñas y altamente básicas llamadas protaminas. El EO altera estos procesos bioquímicos que se llevan a cabo durante la etapa de maduración espermática. El colorante Azul de Anilina tiñe selectivamente las histonas que son proteínas ricas en lisina y es utilizado para evidenciar núcleos espermáticos inmaduros.(5) El objetivo de este trabajo fue estudiar el estrés oxidativo en muestras seminales de hombres con infertilidad idiopática y su relación con la funcionalidad de la membrana, integridad del ADN y madurez de la cromatina espermática. MÉTODOS Pacientes: Se analizaron muestras de semen de 142 hombres de a 45 años de edad que consultaron por infertilidad en el Servicio de Reproducción del Hospital Provincial del Centenario desde mayo de 05 a junio de 07. Todos presentaban infertilidad primaria idiopática de al menos un año de duración. Las muestras seminales se recogieron por masturbación, con una abstinencia sexual de 3 a 5 días. Luego de la licuefacción y antes de la hora de eyaculación se efectuó espermograma y estudios funcionales espermáticos según normas OMS (6). Se seleccionaron 83 muestras, siendo el criterio de exclusión la concentración de espermatozoides móviles post swim-up menor de 5 x10 6 /ml, presencia de leucocitospermia, hiperviscosidad y/o aglutinación. Determinaciones: Prueba de estrés espermático modificado (MOST) (3) Para realizar esta prueba se separaron los espermatozoides móviles mediante la técnica de sobrenado (swimup) (7). Se tomó una alícuota de 10 ul de la parte superior y se realizó el estudio de motilidad, determinando el porcentaje de espermatozoides móviles traslativos (movilidad inicial). Se colocaron 0 ul, también de la parte superior en tubo Eppendorff y se incubó durante 4 hs a C en baño de agua. Finalizada la incubación se tomó una alícuota de 10 ul y se determinó nuevamente el porcentaje de espermatozoides con movimiento traslativo (movilidad final). El valor del MOST se calculó como el cociente entre movilidad final y movilidad inicial. Se consideró normal un valor de MOST mayor o igual a 0.. La integridad del ADN se estudió con Naranja de Acridina, el cual mide la susceptibilidad del ADN a la desnaturalización ácida inducida por el colorante, cuantificándolo mediante el cambio metacromático de color verde (ADN nativo) al anaranjado (ADN desnaturalizado) (8). La condensación de la cromatina se evaluó con Azul de Anilina que permite detectar el grado de madurez del núcleo espermático, demostrando alteraciones durante el desarrollo del proceso espermatogénico (9). La integridad anatómica y funcional de la membrana espermática se evaluó con el Test Hipoosmótico (TH), luego de incubar la muestra en medio hipoosmótico (150 mosm/l) los espermatozoides reactivos incorporan agua a nivel de la cola y/o del segmento intercalar (2-6). Análisis estadístico: Se aplico la prueba t Student para comparar los promedios de las variables entre ambos. Un valor de p<0.05 se consideró significativo. RESULTADOS El 62.6 % de las muestras seminales seleccionadas para este estudio presentaron valor de MOST alterado. Se clasificaron en dos de acuerdo al resultado obtenido en el test MOST, G1 formado por 31 muestras con MOST mayor o igual a 0. (normal) y G2 constituido por 52 muestras con valor de MOST menor a 0. (alterado). Al evaluar la cromatina se encontró marcada inmadurez en la muestras seminales con MOST alterado ( G1: /-13.1

4 REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 Nº 3 07 Trabajo: págs Pág 31 vs G2: /- 12.1). El estudio estadístico de los datos mostró diferencia significativa (p= ). Tabla 1 El estudio de la integridad del ADN mostró elevado porcentaje de espermatozoides con ADN desnaturalizado en las muestras con MOST alterado (G1: / vs. G2: /- 18.4). El análisis estadístico de los datos mostró diferencia significativa entre ambos (p= ). Tabla 1 En la evaluación de la membrana espermática se observó una marcada disminución en la funcionalidad de la misma en las muestras seminales con MOST alterado. (G1: / vs G2:.1 +/- 16.1). El análisis estadístico de comparación de los promedios mostró diferencia significativa entre los dos (p= ). Tabla 1 Tabla 1. : Valores de las variables y significado estadístico de la comparación de promedios entre ambos. Variables G1 : MOST 0. n = 31 DS: diferencia estadísticamente significativa MOST 0. = normal MOST < 0. = alterado DISCUSIÓN G2: MOST < 0. n = 52 Valor de p Integridad ADN (%) 89.2 ± ±18.4 P= DS Conden cromat (%) 73.9 ± ±12.1 P= DS Integ rmembran (%) 67.4 ± ± 16.1 P= DS Significado estadístico Las ROS se han detectado en el % de las muestras de semen de pacientes infértiles. Su presencia altera la calidad seminal y conduce a la pérdida de movilidad de los espermatozoides, seguida del envejecimiento y muerte celular. El EO, que genera la peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana plasmática, además de reducir la movilidad espermática, altera en forma significativa estructuras espermáticas esenciales como la membrana y el ADN, disminuyendo la capacidad fertilizante de los espermatozoides. Como se demostró en anteriores publicaciones, el EO está asociado con la alteración de la integridad anatómica y funcional de la membrana plasmática (10). El daño que el estrés oxidativo produce en la membrana espermática, se traduce en alteración de la integridad y funcionalidad de la misma, observándose resultados anómalos en el Test Hiposmótico. Fig 1 Figura 1. Integridad de la membrana espermática (TH). Espermatozoides reactivos en grupo 1:MOST normal grupo 2 : MOST alterado % espermatozoides con membrana funcional ,4,1 En las muestras seminales con elevado tenor de EO se observa una marcada alteración en la integridad de la cromatina, con incremento en el porcentaje de espermatozoides con ADN desnaturalizado (fig 2). Figura 2. Integridad del ADN espermático (NA) Espermatozoides con ADN nativo en grupo 1: MOST normal grupo 2: MOST % de espermato zoides ADN nativo ,2 58,1 El elevado EO de las muestras con MOST alterado se manifiesta en el porcentaje elevado de espermatozoides con núcleos reactivos al colorante Azul de Anilina, lo que sugiere la persistencia de proteínas ricas en lisinas debido a fallas en el proceso espermatogénico. Fig 3. Figura 3. Condensación de la cromatina (AA) Espermatozoides con cromatina madura en grupo 1: MOST normal grupo 2: MOST alterado % esperm c/nucleo maduro ,9 55,1 El EO puede provenir de una deficiencia del sistema de defensa antioxidante o de un incremento de la población de ROS cuya alta reactividad puede provocar peroxidación lipídica, dañando la membrana celular y el ADN espermático.(11) Otro factor asociado al EO es el tabaco. El aumento de ROS en hombres fumadores genera EO, con incremento de citoquinas proinflamatorias que alteran la regulación de la espermatogénesis, produciendo daño en el ADN espermático y un marcado aumento del arresto espermatogénico (12) (13). Debido a la importancia de la peroxidación lipídica en la alteración de la función espermática, considerada la causa principal de daño en el ADN espermático, la cuantificación de este proceso tiene gran relevancia clínica (14). El MOST es un bioensayo que evalúa la peroxidación lipídica espontánea que se produce al remover el plasma seminal y separar los factores antioxidantes protectores; como prueba de resistencia espermática a la lipoperoxidación forzada es sencillo, objetivo y de bajo costo, reuniendo las condiciones

5 Relacion del estrés oxidativo con la funcionalidad espermatica en hombres con infertilidad idiopatica suficientes para ser incorporado como un test evaluador de EO y predictor de fertilidad potencial. Todos los espermatozoides de un eyaculado no son iguales desde el punto de vista funcional, pero no se conoce cuáles son los atributos que diferencian un espermatozoide fértil de aquel que no lo es. Con el fin de lograr un enfoque andrológico más racional y eficiente es importante incorporar el estudio del EO al análisis del semen humano. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS stress in infertile men: a prospective study. Fertil. Steril. 02; 78 (3): Bouvet B. R., Paparella C. V., Feldman R. N. Efecto del tabaquismo sobre la espermatogénesis en hombres con infertilidad idiopática. Arch. Esp.Urol.07; ( 3 ): Tomlinson M.J., White A., Barratt C.L.R., Bolton A.E and Cooke I.D. The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? Human Reproduction. 1992; 7 (4) : Knoblovitz P., Rey Valzacchi G. Rol de las especies reactivas del oxígeno en el hombre infértil. Boletín Informativo de la Sociedad de Andrología. Afiliada a la International Society of Andrology. 1999; 8 (3): Jeyendran R., Van Der Ven H., Perez-Pelaez M., Crabo B. G., Zaneveld L. Development of ram assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. J. Reprod. Fert. 1984; 70: J.C Calamera, G. F. Doncel, S. Brugo Olmedo, P. Kolm and A.A Acosta. Modified sperm stress test: a simple assay that predicts sperm-related abnormal in-vitro fertilization. Hum. Reprod. 1998; 13 (9): Adel Zalata, Tarek Hafez and Frank Comhaire. Evaluation of the role of reactive oxygen species in male infertility. Hum. Reprod. 1995; 10 (6): Buffone M. G., Calamera J.C. Evaluación de la estructura e Integridad de la cromatina espermática humana en andrología. Rev. Arg. Soc. Andrología 04; 13 (1): World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm cervical-mucus interaction. Cambridge University Press. Cambridge Berger T., Marrs R. P. and Moyer D.L. Comparison of techniques for selection of motile spermatozoa. Fertil. Steril. 1985; 43: Tejada R.I., Mitchell J.C. Norman A., Marik J., Friedman S. A test for the practical evaluation of male infertility by acridine orange fluorescence. Fertil. Steril ; 42: Dadoune J.P., Mayaux M. J., Guildhard-Moscato. Correlation between defects of chromatin condensation of human spermatozoa stained by aniline blue and semen characteristics. Andrología. 1988; : Bouvet B. R., Brufman S., Paparella C. V., Gatti V. N., Feldman R. N., Solis E. A. Estrés espermático modificado. Respuesta inmune y funcionalidad de la membrana del espermatozoide humano. Arch. Esp. de Urol. 04; 57 (5): Barroso G., Morshedi M., Oehninger S. Analysis of DNA fragmentation, plasma membrane translocation of phosphtidylserine end oxidative stress in human spermtozoa. Human Reprod. 00; 15 (6): Saleh R.A., Ashok A., Sharma R., Nelson D., Thomas A. Effect of cigarette smoking on levels of seminal oxidative