PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, TABEBUIA BILLBERGII (BIGNONIACEAE), A PARTIR DE EXPLANTES OBTENIDOS DE PLÁNTULAS IN VITRO

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1 6 PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, TABEBUIA BILLBERGII (BIGNONIACEAE), A PARTIR DE EXPLANTES OBTENIDOS DE PLÁNTULAS IN VITRO IN VITRO PROPAGATION OF BLACK GUAYACÁN, TABEBUIA BILLBERGII (BIGNONIACEAE), OBTAINED FROM EXPLANTS OF IN VITRO PLANTLETS Julia Minchala Patiño 1* Víctor Hugo Eras Guamán 1 Ruth Poma Angamarca 1 Magaly Yaguana Arévalo 1 Luis Muñoz Chamba 1 Guillermo Delgado Paredes 2 1. Laboratorio de Micropropagacion vegetal. Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Universitaria. Loja-Ecuador. jeminchala@gmail.com 2. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Lambayeque, Perú. * Autor para correspondencia Resumen Para la propagación in vitro de guayacán negro, Tabebuia billbergii (Bureau & K. Scum) Standl., especie forestal endémica del bosque seco de la costa del Ecuador y Perú, se realizaron ensayos de elongación del brote y enraizamiento de ápices caulinares y segmentos nodales, partiendo de plántulas in vitro, por lo cual no fue necesario desinfectar el material vegetal. El medio de cultivo basal estuvo conformado por las sales minerales de Murashige y Skoog (MS) más vitaminas y sacarosa. En la fase de elongación del brote el medio basal se suplementó con las citocininas benzilaminopurina (BAP), kinetina (KIN) y 2iP (N6-[2- Isopentil]adenine); además, de sustancias citocínicas como sulfato de adenina y agua de coco. En la fase de enraizamiento se utilizó ácido indolbutírico (AIB). Los explantes fueron incubados en condiciones ambientales controladas de luz y temperatura. La mejor respuesta en elongación del brote se observó con KIN 1,0 mg L -1 más sulfato de adenina 25 mg L -1, en tanto que la mejor respuesta en el enraizamiento se observó con AIB 1,0 mg L -1. Palabras claves: ácido indolbutírico, ápices caulinares, cultivo de tejidos, kinetina, segmentos nodale, sulfato de adenina. Abstract For the in vitro propagation of black guayacán, Tabebuia billbergii (Bureau & K. Scum) Standl, forest endemic species to the dry forests of the coast of Ecuador and Peru, tests were performed bud elongation and rooting of shoot tips and nodal segments, starting from seedlings in vitro, therefore it was not necessary disinfest plant material. The culture medium consisted of the basal mineral salts of Murashige and Skoog (MS) more vitamins and sucrose. In the shoot elongation phase of the basal medium supplemented with cytokinins benzylaminopurine (BAP), kinetin (KIN) and 2iP (N6-[2-isopentyl] adenine); Also citocínicas substance as adenine sulfate and coconut water. In the rooting phase was used indole butyric acid (IBA). The explants were incubated under controlled environmental conditions of light and temperature. The best bud elongation response was observed with KIN 1.0 mg L -1 over adenine sulfate 25 mg L -1, while the best rooting response was observed with IBA 1.0 mg L -1. Keywords: adenine sulfate, indole butyric acid, kinetin, nodal segments, tissue culture, shoot apex. Recibido: abril 14 de 2014 Aprobado: junio 08 de 2014

2 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii 7 Introducción Las Bignoniáceas comprenden lianas, arbustos y árboles, reunidos en 120 géneros y alrededor de 800 especies distribuidas en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. El género Tabebuia Gomes ex DC. es el mayor y más importante con aproximadamente 100 especies (Gentry, 1992). En el Ecuador el género Tabebuia está representado por 8 especies: T. billbergii (Bureau & K. Scum.) Standl., T. chrysantha (Jacq.) G. Nicholson, T. donnell-smithii Rose, T. incana A.H. Gentry, T. ochracea (Cham.) Standl., T. palustris Hemsl., T. rosea (Bertol.) DC. y T. serratifolia (Vahl) G. Nicholson (Jørgensen y León-Yánez, 1999). Tabebuia billbergii (Bureau & K. Scum.) Standl., es un árbol caducifolio, de tamaño mediano que alcanza hasta 14 metros de altura. Se distribuye en los valles secos de 0 a 500 msnm. Su madera dura y pesada es cotizada en Ecuador para artesanía y carpintería, por el contraste en el color entre la albura clara y el duramen muy oscuro. En el Perú su madera es usada para fabricación de parquet y en construcciones rurales. Sus hojas sirven como forraje (INRENA, 2002). Al igual que otras especies como Prosopis limensis (algarrobo/fabaceae), Capparis scabridae (Zapote/Capparaceae), Loxopterigium huasango (hualtaco/ Anacardiaceae) y Bursera graveolens (palo santo/burseraceae), T. billbergii es una especie representativa del bosque estacionalmente seco (BES), un ecosistema muy frágil que se extiende desde la península de Santa Elena, en el sur del Ecuador, hasta el noroeste del Perú, comprendiendo la costa de las regiones Tumbes, Piura, Lambayeque y el norte de La Libertad así como el piso inferior del valle del Marañón; estas dos áreas se comunican a través del Paso de Porculla, una depresión de m de elevación, considerada la más baja de los Andes peruanos (Brack y Mendiola, 2004). El BES es considerado una zona de importancia biológica por ser un ecosistema singular, muy amenazado y poco conocido, con presencia de especies endémicas y un importante grado de diversidad local y regional en una superficie relativamente reducida; por esta razón ha sido recientemente incluido entre los puntos calientes o hotspots del mundo, para su estudio y conservación (Rasal et al., 2011; Mittermeier et al., 2005). A pesar que, el cultivo de tejidos vegetales, ha tenido grandes progresos en investigación, habiéndose desarrollado diversos protocolos en propagación in vitro de especies nativas en países como Cuba, Colombia, Perú y Argentina, lo que ha permitido contribuir con el rescate de las especies en peligro de extinción (FAO, 1993), en la actualidad son limitados los avances en especies del bosque seco. Se debe considerar entre los principales problemas que dificultan el establecimiento de los cultivos in vitro la contaminación por bacterias y hongos endógenos, la secreción de sustancias tóxicas como fenoles y sustancias volátiles, y la escasa respuesta en la inducción de procesos morfogénicos (organogénesis y embriogénesis somática). (George, 1993). Particularmente, el enraizado de brotes es un proceso crítico en la propagación in vitro puesto que en la mayoría de los sistemas estudiados sólo con un óptimo desarrollo radicular es posible la aclimatación y el establecimiento exitoso de plántulas en condiciones de invernadero, como fase previa al establecimiento en campo (Minchala J. 2011). En los últimos años la información bibliográfica sobre trabajos la propagación in vitro de especies forestales se ha incrementado significativamente; sin embargo, en guayacán negro no se conocen trabajos al respecto, reportándose apenas la obtención de plantas in vitro de Tabebuia rosea, seleccionadas de plantas élites, para el establecimiento de una plantación de origen in vitro, a utilizar en ensayos de propagación vegetativa y análisis de pruebas clonales y moleculares (Schuler et al., 2005), así como el reporte de Suárez et al. (2006), utilizando explantes obtenidos de plantas de 2 a 3 años, establecidas en condiciones de invernadero. En Tabebuia donnell-smithii,

3 8 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii se reportó la obtención de plántulas a partir de semillas y varetas injertadas de árboles seleccionados (Ramírez et al., 2009) y la inducción de brotes adventicios a partir de tejidos adultos (González-Rodríguez et al., 2010). Recientemente, Minchala J. (2011) informó sobre el establecimiento de ápices caulinares, brotamiento y enraizamiento in vitro de ápices caulinares obtenidos de plántulas provenientes de la germinación in vitro de semillas. El objetivo del presente trabajo fue inducir la elongación de brotes, el brotamiento múltiple y el enraizamiento de ápices caulinares y segmentos nodales, removidos de plántulas obtenidas por germinación de semillas in vitro del guayacán negro Tabebuia billbergii (Bignoniaceae). Materiales y métodos La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Micropropagación Vegetal del Área Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables de la Universidad Nacional de Loja, como parte del Proyecto de Investigación Generación de protocolos para la propagación in vivo e in vitro de genotipos élites de especies forestales nativas y promisorias para la reforestación en la Región Sur del Ecuador, con el financiamiento de la Universidad Nacional de Loja. El laboratorio se encuentra ubicado a 3 km de la Ciudad de Loja, en los LS y LO. Material vegetal El material vegetal estuvo conformado por semillas colectadas de frutos maduros próximos a la dehiscencia, en los meses de enero a febrero del 2012, provenientes de plantas en las mejores condiciones morfológicas, fisiológicas y fitosanitarias, en las localidades de cabeza de Toro, cantón zapotillo, provincia de Loja-Ecuador. Ese año fue particularmente difícil en la colecta de semilla de buena calidad, sana y abundante. Cultivo y germinación de semillas Las semillas que presentaron las mejores condiciones morfológicas fueron desinfestadas con alcohol etílico 70% e hipoclorito de sodio (CLOROX 5.25% de cloro activo), en tratamientos sucesivos y con 1 3 enjuagues con agua destilada esterilizada, antes de cultivarlas en el medio de cultivo formulado para tal fin. De la germinación de semillas in vitro, se obtuvo plántulas de 3 a 5 cm de altura con uno nudo y sus correspondientes hojas cotiledonarias, que en cámara de flujo laminar de aire esterilizado y utilizando cajas de Petri, pinzas y bisturí esterilizados, se obtuvo los ápices caulinares y segmentos nodales que fueron utilizados en los ensayos de brotamiento y enraizamiento. No fue necesaria la desinfección del material vegetal por tratarse de material aséptico. Formulación y preparación del medio de cultivo El medio de cultivo basal, estuvo constituido por las sales minerales MS de (Murashige y Skoog, 1962), las vitaminas tiamina HCl 1 mg/l y mio-inositol 100 mg/l, sacarosa 2% y agar 0,6%. En la fase de brotamiento, el medio de cultivo basal se suplementó con citocininas y sustancias orgánicas complejas con aditivos citocínicos (Cuadro 1) y en la fase de enraizamiento con ácido indolbútirico (AIB) 0,5 y 1,0 mg/l. El ph de los medios de cultivo se ajustó a 5.8 ± 0.2 con HCl o NaOH 1N. Posteriormente, se distribuyó 30 ml de medio de cultivo en frascos de vidrio transparente tipo compota y en tubos de ensayo de 150 x 20 mm, antes de esterilizarse en autoclave a 120 ºC de temperatura y 15 kg/cm2 de presión, durante 20 minutos. Inoculación La inoculación in vitro de los explantes, se realizó en condiciones asépticas en la cámara de flujo laminar. Tanto en los ensayos sobre brotamiento como de enraizamiento, en cada tratamiento se inocularon 14 explantes, a razón de dos explantes por frasco, lo que hizo un total de 126 explantes, para brotamiento y en tubos

4 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii 9 de ensayo a razón de un explante por tubo lo que hizo un total de 28 explantes, para enraizamiento. Se hace la salvedad que el enraizamiento fue de novo, es decir, los ápices caulinares fueron removidos de las plántulas y cultivados en el medio de cultivo formulado para tal fin. Citocininas (mg/l) Sustancias orgánicas complejas Tratamiento Sulfato de adenina Agua de coco BAP KIN 2iP (mg L -1 ) (%) T1 1,0 5,0 T2 1,0 5,0 20,0 T3 1,0 25,0 T4 1,0 25,0 20,0 T5 1,0 5,0 T6 1,0 5,0 20,0 T7 1,0 25,0 T8 1,0 25,0 T9 1,0 25,0 20,0 Cuadro 1. Efecto de la interacción citocininas sustancias orgánicas complejas citocínicas en la elongación de brotes, de Tabebuia billbergii. Condiciones ambientales de incubación Los frascos de vidrio y tubos de ensayo inoculados se mantuvieron en incubación en el cuarto de luces a una temperatura de 23 ± 2 C y un fotoperiodo de 16-8 horas, luz-oscuridad. La fuente de luz estuvo conformada por lámparas fluorescentes de 40 W, proporcionando una irradiancia de 8 10 W.m-2. Las semillas fueron germinadas entre 1-5 W.m-2 de irradiancia. Parámetros evaluados La evaluación se realizó por observación directa, cada 5 días, iniciándose el tercer día después de la inoculación. Se evaluó hasta 90 días después del cultivo. Los parámetros evaluados fueron: contaminación, fenolización, mortalidad, altura de la plántula, número de nudos, número de brotes, número de hojas, número de raíces, longitud de brotes y longitud de raíces, tasa de supervivencia, así como algunos parámetros fisiológicos. Resultados Germinación de semillas La tasa de contaminación de las semillas fue 30%, generalmente por bacterias y hongos ambientales, en tanto que la tasa de germinación fue 65%, la que se inició después de 6 días del cultivo. Una vez germinadas las plántulas iniciaron un crecimiento y desarrollo armónico. Fase de elongación de brotes De acuerdo al análisis estadístico, los tratamientos T7 y T9 (Cuadro 2 y Figura 1) presentaron diferencias significativas (prueba de Tukey p<0,05) entre tratamientos, en lo relacionado a altura de plántulas y longitud de los brotes y en el caso del número de nudos formados, los tratamientos T4 y T7 presentaron diferencias significativas en relación a los demás tratamientos. En el tratamiento T7 las plántulas alcanzaron una altura de 64,0 mm con 6 nudos, un brote de 5,0 cm de longitud promedio, 12 hojas y 2 raíces de 6,0 cm de longitud en promedio.

5 10 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii TRAT. Altura (mm) Número de nudos Número de brotes Longitud del brote T1 47,2 + 4,51 5,3 + 0,33 1,2 + 0,16 2,9 + 0,15 T2 35,5 + 2,43 3,7 + 0,33 1,0 + 0,0 2,5 + 0,26 T3 45,6 + 6,30 5,3 + 0,75 1,3 + 0,25 3,3 + 0,62 T4 50,6 + 5,03 6, 2 + 0,66* 1,2 + 0,14 3, T5 45,7 + 2,97 4,4 + 0,48 1,0 + 0,0 2,8 + 0,40 T6 38,3 + 4,41 4, 0 + 0,63 1,0 + 0,0 2,5 + 0,51 T7 64,0 + 4,40* 6,0 + 0,30* 1,0 + 0,0 5,0 + 0,45* T8 59,2 + 7,35 5,7 + 0,62 1,2 + 0,16 4,6 + 0,67 T9 63,1 + 4,62* 5,8 + 0,37 1,0 + 0,0 4,8 + 0,53* * Diferencia significativa entre tratamientos al nivel de significancia 0,05 (prueba de Tukey p<0,05) Cuadro 2. Efecto de varias citocininias y sustancias orgánicas complejas en la elongación de brotes in vitro de Tabebuia billbergii. En la fase de elongación de brotes la contaminación de los explantes fue 35 a 40 %, debido a la proliferación de bacterias y hongos endógenos. No se observó fenolización, por lo que no fue necesario incluir al medio de cultivo antioxidantes. La tasa de mortalidad fue baja, entre 7 a 14%. Figura 1. Elongación de brotes in vitro de plantas de T. billbergii en el tratamiento T7 (KIN 1,0 mg/l y sulfato de adenina 5,0 mg/l). Fase de enraizamiento De acuerdo al análisis estadístico, no hubo diferencias significativas (prueba de Tukey p>0,05) entre tratamientos, en lo relacionado a altura de plántulas, número de nudos y número de raíces formadas, así como en longitud de raíces.

6 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii 11 Cuadro 3. Efecto del AIB en enraizamiento in vitro de T. billbergii. TRAT. Altura (mm) Número de nudos Número de raíces Longitud de raíces T1 71,4 ± 8,52 6,5 ± 0,56 8,4 ± 1,47 3,1± 0,14 T2 60,4 ± 10,89 5,5 ± 0,60 15,3 ± 2,77 2,7 ± 0,39 En la fase de enraizamiento, la contaminación de los explantes fue de 5 a 25%, no presentándose fenolización; la mortalidad fue baja, entre 5 y 10%. En el tratamiento T1, que contenía AIB 0,5 mg/l tal como se observa en la figura 2, las plantas alcanzaron una altura de 71,4 mm y la formación de 6 nudos y 8 raíces de 3,1 cm de longitud promedio; la formación de raíces se inició a los 15 días de establecido el ensayo y la tasa de enraizamiento fue 100 %. Con el tratamiento T2, que contenía AIB 1,0 mg/l, de acuerdo a lo observado en la figura 3, las plantas alcanzaron una altura de 60,4 mm y la formación de 5 nudos, 9 hojas y 15 raíces de 2,7 cm de longitud en promedio, y, al igual que en el tratamiento anterior, la formación de raíces se inició a los 15 días de establecido el ensayo con una tasa de enraizamiento de 81%. En general, tanto en el proceso de elongación de brotes como en el enraizamiento in vitro, las plantas mostraron una óptima condición fisiológica, expresada en tallos y hojas verdes, expandidas y raíces muy vigorosas. Figura 2. Enraizamiento in vitro de plántulas de T. billbergii en el tratamiento T1 (AIB 0,5 mgl -1 ). Figura 3. Enraizamiento in vitro de plántulas de T. billbergii en el tratamiento T2 (AIB 1,0 mg L -1 ).

7 12 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii Discusión Germinación de semillas Como suele ocurrir en el bosque estacionalmente seco, las fluctuaciones anuales y estacionales de temperatura, disponibilidad de agua, fotoperiodo, entre otros factores, determinan que la floración y la fructificación, y consecuentemente, la producción de semilla, sean, también, muy variables. En algunos años ésta se produce de manera abundante, con buenas características fisiológicas y estado fitosanitario óptimo, en cambio en otros años, como lo ocurrido en el año que se colectó la semilla utilizada en el trabajo que se presenta, ésta fue muy escasa, con baja tasa de germinación y contaminada por diversos patógenos endógenos y exógenos. Es por ello que muy poca semilla fue aprovechada en la germinación in vitro y la obtención de explantes para el establecimiento de los ensayos sobre brotamiento (elongación de brotes) y enraizamiento. Elongación de brotes En cultivo de tejidos la presencia de contaminantes tanto externos como internos afectan el desempeño de los explantes una vez establecidos en condiciones in vitro, haciendo indispensable el uso de técnicas que permitan la detección de patógenos sistémicos y su desinfección superficial (Leifert y Cassels, 2001; Suárez et al., 2005), en el presente trabajo de investigación la contaminación de los explantes fue del 35 al 40 %, quizá por la presencia de patógenos endógenos o por la manipulación de los explantes al momento de la inoculación, porcentaje que es aceptable si consideramos que en propagación in vitro la contaminación puede incluso ser mayor al 90%, según lo reportado por Abdelnour y Muñoz, (1997), en explantes caoba y cedro. De acuerdo a los resultados obtenidos en el tratamiento T7, se observó que la altura de las plántulas, número de nudos formados y longitud de los brotes, a los tres meses de evaluación, fue mayor en presencia de KIN 1,0 mg/l más sulfato de adenina 25,0 mg/l, lo que demuestra que hubo un efecto de los reguladores de crecimiento, aun cuando los resultados observados en el tratamiento T9, que incorporó 2iP 1,0 mg/l, suplementado con sulfato de adenina 25,0 mg/l y agua de coco 20% fueron muy similares. En los otros tratamientos ensayados la respuesta fue significativamente menor, incluso en los tratamientos que incorporaron BAP, una citocinina tradicionalmente utilizada en le inducción de múltiples brotes y elongación de los mismos. Según Castillo, (2004), durante esta la fase de brotamiento se espera que los explantes originen brotes axilares con varios nudos y hojas, En el trabajo que se presenta, sin embargo, los ápices caulinares cultivados en el tratamiento T7 (KIN 1,0 mg/l más sulfato de adenina 25,0 mg/l), a tres meses de evaluación, si bien las plántulas alcanzaron una superior a de 64,0 mm con seis nudos formados, en promedio, apenas pudo inducirse la formación de un solo brote. Este resultado fue menor si se compara con los obtenidos en Cedrela montana (cedro blanco), que utilizando BAP 2,0 mg/l, se obtuvo un número promedio de tres brotes por explante, de 6,0 mm (Díaz, 2011). De igual forma en Cedrela salvadorensis se obtuvo un número promedio de dos brotes por explante utilizando concentraciones de BA 0; 0,5; 2,5 y 3,5 5mgL-1. (Soto-Vargas et al., 2010). En Tabebuia rosea, una de las escasas especies del género hasta ahora con resultados publicados, utilizando explantes obtenidos de plantas de 2 a 3 años establecidas en condiciones de invernadero, se alcanzó la mejor tasa de multiplicación in vitro en medio de cultivo con BAP 17.8 μm. (Suárez et al., 2006). Asimismo, en Tabebuia donnell-smithii se alcanzaron tasas elevadas de multiplicación en medio de cultivo suplementado con AG3 0,47 µm y KIN 6,04 µm (Ramírez et al., 2009).

8 Minchala et al. (2014); PROPAGACIÓN IN VITRO DE GUAYACÁN NEGRO, Tabebuia billbergii 13 Enraizamiento En numerosos trabajos sobre enraizamiento in vitro fue necesario el suplemento al medio de cultivo de las auxinas AIA (ácido incol- 3-acético), ANA (ácido naftaleneacético) o AIB (Murashige, 1974). En el trabajo que se presenta los resultados obtenidos en enraizamiento en ápices caulinares y segmentos nodales, suplementando al medio de cultivo MS, ácido indolbutírico 1,0 mg/l, se alcanzó la formación hasta de 15 raíces por explante con una tasa de enraizamiento de 80%. Estos resultados fueron superiores respecto a lo reportado en Tabebuia chrysantha donde se obtuvo en promedio 4 a 6 raíces por explante utilizando la misma concentración de AIB, (Minchala J. 2011). En Tabebuia rosea el enraizado de brotes se obtuvo utilizando las sales minerales MS suplementadas con carbón activado 2 g/l y sacarosa 1,5%, en un lapso de días, no necesitándose suplemento alguno de auxinas enraizadoras (Schuler et al., 2005). Por otro lado, González, et al (2010), trabajando en brotes adventicios obtenidos de vitroplantas de Tabebuia donnell-smithii, a partir de brootes de estacas se observó enraizamiento en medio de cultivo suplementado con AIB 20 µm (4 mg L-1). Asimismo, en Tabebuia rosea, utilizando explantes obtenidos de plantas de 2 a 3 años de edad, establecidas en condiciones de invernadero, la mayor tasa de enraizamiento ocurrió en presencia de ANA 5.37 μm (Suárez et al., 2006). En otros sistemas estudiados, como en Cedrela fissilis, se alcanzó 87 a 100% de enraizamiento de brotes con AIB 2,5 µm (0,5 mg/l) (Costa et al 2002); en Cedrela odorata, obtuvieron 70% de enraizamiento de brotes con AIB 1,0 mg/l (Valverde-Cerdas et al., 2008) y en Cedrela montana se reportó el enraizamiento de ápices caulinares utilizando AIB 1,0 mg/l, obteniendo en promedio 2,4 raíces de 30,5 mm de longitud, por explante, y en segmentos nodales 1,4 raíces de 26,0 mm de longitud, por explante (Díaz, 2011). Por los antecedentes anotados, se puede señalar que las concentraciones de AIB 1,0 mg/l ensayadas dieron resultados satisfactorios, Así mismo, se puede manifestar que es necesario el uso de auxinas en el enraizamiento de explantes de especies forestales, confirmando de esta manera lo manifestado por Castillo (2004), quien afirme que para enraizar los explantes se requiere un medio que contenga auxinas. Conclusiones La contaminación de los explantes provenientes de vitroplantas fue mayor en la fase de elongación del brote que en la fase de enraizamiento hasta los treinta días de evaluación. La adición de Kinetina 1 mg/l + Sulfato de Adenina 25 mg/l al medio de cultivo MS, permitio obtener los mayores resultados en altura de plántulas y elongación del brote, a los 90 días de evaluación. La presencia de AIB 1 mg/l en el medio de cultivo, fue necesaria para aumentar el número de raíces y la tasa de enraizamiento de los explantes inoculados en el medio de cultivo MS, a los 90 días de evaluación. Agradecimientos El presente investigación se desarrolló con el apoyo institucional y financiero de la Universidad Nacional de Loja y la Dirección de Investigación, por lo que los autores expresan su especial agradecimiento. Referencias bibliográficas Abdelnour, E. y A. Muñoz Micropropagación de especies forestales. X Congreso Forestal Nacional de Especies Forestales, San José de Costa Rica

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