DISFUNCIÓN TELOMÉRICA ASOCIADA A INESTABILIDAD CROMOSÓMICA EN CÉLULAS EPITELIALES MAMARIAS HUMANAS

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1 DISFUNCIÓN TELOMÉRICA ASOCIADA A INESTABILIDAD CROMOSÓMICA EN CÉLULAS EPITELIALES MAMARIAS HUMANAS Investigadora principal: Dra. Laura Tusell Padrós Facultat de Ciències UAB Duración: 3 años 1

2 1. Resumen La mayoría de los cánceres en la población humana adulta son carcinomas de origen epitelial, los cuales usualmente presentan inestabilidad cromosómica (CIN), mostrando tanto anomalías estructurales como numéricas. Se ha establecido que la CIN en células epiteliales proliferantes depende del acortamiento telomérico que sufren las células al dividirse, junto con deficiencias de control del ciclo celular. Nuestra propuesta se ha centrado en el estudio de células epiteliales mamarias humanas (HMEC) derivadas de reducciones mamarias estéticas. Estas células, cuando se cultivan in vitro en un medio sin suero, exhiben una fase inicial de proliferación seguida de una primera barrera de crecimiento en la que la mayor parte de las células deja de dividirse por estrés en cultivo. Pese a ello, algunas células son capaces de seguir proliferando in vitro, con una longitud telomérica crítica, gracias a que se hipermetila el promotor del gen que codifica p16 INK4a (Romanov et al., 2001). Este proyecto pretende investigar en primer lugar la evolución cariotípica de HMEC derivadas de donantes de diferentes edades para determinar si la generación de CIN depende de la edad de la donante. Esta relación podría depender de la longitud telomérica inicial que presentan las HMEC en la glándula mamaria antes de establecerse el cultivo de las células. De ser así, las HMEC de donantes de edad avanzada tendrían una longitud telomérica menor que las células de una donante joven. De confirmarse estos resultados, podría relacionarse la longitud telomérica, y por lo tanto también la edad de la donante, con el inicio de la carcinogénesis y así entender por qué razón la incidencia de carcinomas en humanos aumenta exponencialmente con la edad de los individuos. Por otro lado, un estudio en ratones mterc -/- concluyó que la radiosensibilidad celular referida al total de anomalías cromosómicas radioinducidas era mucho mayor que en células con telómeros erosionados que en células con una longitud telomérica normal. Así pues, también se 2

3 perseguía conocer si las células con telómeros erosionados presentan mayor sensibilidad a la radiación ionizante que las células con una longitud telomérica normal. De ser así, será de vital importancia reevaluar los riesgos de las mamografías atendiendo al factor edad. 2. Resultados Durante la vigencia del proyecto se han estudiado células derivadas de reducciones mamarias estéticas de cuatro donantes sanas de diferentes edades: AG11132 (16 años), AG11137 (32 años), HMEC 830 (50 años) y HMEC 219/7 (58 años). Con respecto al estudio de la evolución cariotípica de HMEC para determinar si la disfunción telomérica es un factor de riesgo en la generación de inestabilidad cromosómica (primer objetivo), podemos concluir que: a) El grupo de cromosomas que presentan preferentemente acortamiento telomérico varía entre individuos. El estudio de los cromosomas de las diferentes donantes mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) con una sonda pantelomérica y posterior análisis del patrón de bandas permitió identificar, en cada una de las donantes, cuáles eran los extremos cromosómicos que presentaban menor longitud telomérica. La ausencia de señal telomérica no implica forzosamente que el extremo cromosómico sea disfuncional, pero cuando la tasa relativa de acortamiento telomérico (pérdida telomérica por metafase) de cada brazo cromosómico se sitúa alrededor de un 40%, se observan anomalías cromosómicas para estos cromosomas. El análisis de la tasa relativa de acortamiento telomérico en cada brazo cromosómico, y en todas las donantes analizadas, permitió concluir que el conjunto de cromosomas que presentan preferentemente acortamiento telomérico varía entre individuos. 3

4 b) Los cromosomas que presentan acortamiento telomérico son susceptibles de sufrir fenómenos de fusión El análisis citogenético exhaustivo de los cromosomas metafásicos de las HMEC permitió también identificar cuáles eran los cromosomas implicados en anomalías cromosómicas. Este estudio demostró que el conjunto de cromosomas implicados en reorganizaciones cromosómicas coincidía con el conjunto de cromosomas con mayor erosión telomérica. Así pues, cada una de las donantes presentaba un conjunto específico de cromosomas reorganizados. Se observaron tanto anomalías cromosómicas primarias como secundarias; las primeras son aquellas que implican la fusión de dos extremos teloméricos desprotegidos. El tipo más frecuente de anomalía primaria fue la fusión de dos cromosomas diferentes, formando cromosomas dicéntricos. También se observó algún cromosoma en anillo. Con respecto a las anomalías cromosómicas secundarias, éstas se originan a partir de la entrada de las primarias en ciclos de puente-rotura-reunión (BFB cycles). Los cromosomas dicéntricos, si sufren una torsión intercentromérica, son tensados hacia polos opuestos del huso y forman un puente cromatínico que, al romperse, se puede reorganizar de nuevo con otros extremos cromosómicos rotos o desprotegidos, generando nuevas reorganizaciones cromosómicas. Además de translocaciones no recíprocas y deleciones cromosómicas, una parte de las aberraciones secundarias que aparecieron eran amplificaciones de porciones de cromosomas que no derivan de la entrada en ciclos BFB de fusiones entre cromosomas diferentes, sino de la fusión posreplicativa de las dos cromátidas hermanas (SCF: sister chromatid fusion) de un mismo cromosoma. Estas amplificaciones parciales de cromosomas afectaban en cada donante únicamente al primer cromosoma que había quedado desprotegido durante el cultivo de las HMEC. 4

5 c) No existe relación entre el momento en que se inicia la inestabilidad cromosómica y la edad de la donante También se ha podido determinar que, a medida que las HMEC proliferan, aumenta la erosión telomérica y, además, ésta está ligada a un incremento en la frecuencia de anomalías cromosómicas. A pesar de ello, nuestros resultados parecen indicar que no existe relación alguna entre la edad de la donante y el momento en que se inicia la inestabilidad cromosómica. Si existiera una relación entre ambos parámetros, las donantes jóvenes deberían presentar disfunción telomérica a PD (population doublings) más avanzados; por el contrario, las mujeres de edad avanzada deberían mostrar disfunción telomérica a PD mucho más iniciales. Los resultados mostraron que la donante de menor edad presenta cromosomas desprotegidos a PD52 y que la donante de edad avanzada inicia la disfunción telomérica a PD29. No obstante, las donantes de edades intermedias muestran disfunción telomérica a PD iniciales, incluso más inicial que en la donante de mayor edad. Estudios recientes han demostrado la presencia de foci de células epiteliales con hipermetilación del promotor de p16 INK4a en la glándula mamaria de mujeres de diferentes edades. Esta ausencia de correlación entre la inactivación de p16 INK4a y la edad de las mujeres explica también la carencia de correlación entre la edad, la disfunción telomérica y el inicio de la inestabilidad cromosómica. d) La inestabilidad cromosómica en las HMEC puede cuantificarse mediante el análisis de anomalías morfológicas nucleares El análisis de HMEC binucleadas demostró la presencia de tres tipos de morfologías nucleares anómalas (ANM): puentes cromatínicos (NPB), protuberancias nucleares (B) y micronúcleos (MN), las cuales incrementaban con los PD a medida que incrementaba también la disfunción telomérica. Mientras que la frecuencia de NPB y de B incrementó con los PD de forma significativa, el recuento de MN, indicador de genotoxicidad, no mostró un incremento significativo con el incremento de disfunción telomérica. Así pues, se puede concluir que, en un ambiente con disfunción 5

6 telomérica, únicamente los recuentos de NPB y de B son un buen indicador de la inestabilidad cromosómica que sufren estas células. A su vez, los resultados del análisis en tiempo real de la resolución de puentes cromatínicos durante la anafase, así como la observación de que los B y MN se localizaban preferentemente de forma interna respecto a los núcleos de las células binucleadas, evidencia un origen común para los tres tipos de ANM. En conclusión, la disfunción telomérica daría lugar a fusiones cromosómicas que podrían formar un puente cromatínico durante la anafase que sería visualizado como un NPB. Entonces, la tensión ejercida desde los dos polos del huso mitótico provocaría la rotura del NPB, el cual originaría preferentemente un B en cada una de las células hijas y, en menor medida, en MN. e) Los cromosomas con telómeros excesivamente cortos muestran patrones de segregación aberrantes Nuestros resultados implican que los cromosomas con acortamiento telomérico también se encuentran más frecuentemente implicados en anomalías cromosómicas numéricas (aneuploidías). El estudio de los patrones de hibridación en HMEC binucleadas con sondas centroméricas permitió evaluar la segregación de 3 cromosomas diferentes, dos con disfunción telomérica y uno con perfil telomérico normal. Este estudio demostró que el número de células aneuploides para estos cromosomas aumentaba con los PD, a la vez que demostró una implicación desigual en aneuploidías de los diferentes cromosomas analizados. Los cromosomas con una longitud telomérica crítica se encontraban más frecuentemente involucrados en anomalías cromosómicas numéricas que los cromosomas con una longitud telomérica normal. Por último, la utilización de HMEC binucleadas permitió determinar que la pérdida y/o ganancia de cromosomas se producía preferentemente por no-disyunción de las cromátidas dicéntricas y no por pérdida anafásica de cromosomas enteros. Así pues, nuestros resultados sugieren que la disfunción telomérica es un 6

7 factor importante en la generación de aneuploidías en células epiteliales derivadas de la glándula mamaria normal. Respecto al segundo objetivo del proyecto, si la disfunción telomérica en estas células es un factor que contribuye a la radiosensibilidad celular, los resultados finales obtenidos se resumen a continuación: a) En HMEC existe una mayor radiosensibilidad a mayor disfunción telomérica El estudio de HMEC derivadas de dos donantes a dos PD diferentes (el primero con erosión telomérica moderada y el segundo más pronunciada), permitió establecer una correlación entre la disfunción telomérica y el incremento de anomalías cromosómicas tras la exposición a radiación ionizante (RI). El análisis citogenético de las HMEC tras la exposición a RI demostró que los PD más avanzados mostraban una radiosensibilidad superior que los PD iniciales. Tras la irradiación se observó un incremento tanto en la frecuencia de metafases aberrantes como de aberraciones por metafase en ambos PD. Entre todos los tipos de aberraciones cromosómicas presentes, los cromosomas dicéntricos fueron los más numerosos. Sin embargo, este tipo de anomalía (cromosomas dicéntricos solos) no puede utilizarse como un indicador de radiosensibilidad en las HMEC. La progresiva erosión telomérica da lugar a cromosomas dicéntricos, los cuales son indistinguibles de los formados por la exposición a RI, salvo que estos últimos suelen presentar fragmentos acéntricos acompañantes. En las HMEC, la frecuencia de cromosomas dicéntricos solos era similar en células controles e irradiadas para cada PD, demostrándose que este parámetro no es un buen indicador de la radiosensibilidad en estas células. Por el contrario, la frecuencia de dicéntricos acompañados de fragmentos acéntricos (dic+ace), parámetro ampliamente utilizado en dosimetría biológica para determinar la dosis de exposición accidental u ocupacional a RI, sí parecía ser un indicador del daño radioinducido, ya que mostraba un incremento con la dosis de irradiación. Además, este daño no parecía ser el 7

8 mismo a lo largo del cultivo de las HMEC. Con la misma dosis de RI, las células de PD más avanzado, y por tanto con telómeros más erosionados, mostraron una radiosensibilidad 2,7 veces mayor que las células de PD inicial. b) Los telómeros disfuncionales en las HMEC se unen a roturas cromosómicas radioinducidas Con el fin de determinar qué tipos concretos de reorganizaciones cromosómicas eran las causantes de la hipersensibilidad a RI, éstas se clasificaron en tres categorías: telómero-telómero (tel-tel), telómero-dsb (tel-dsb) y DSB-DSB. Tras la RI, en ambos PD analizados el tipo principal de anomalía encontrado fueron las aberraciones tel-dsb, y su frecuencia incrementaba en mayor medida en las células de PD más avanzados. Concretamente, la inducción de aberraciones de tipo tel-dsb tras la RI fue 2,8 veces mayor a PD43 que a PD29. Es, por tanto, la inducción de este tipo de aberraciones la responsable en mayor medida de la hipersensibilidad de las HMEC de PD avanzados. Además, en las HMEC irradiadas a PD43 se observó que la mayor parte de los extremos cromosómicos involucrados en este tipo de aberración coincidían con aquellos que mostraban una mayor frecuencia de erosión telomérica. Estos extremos cromosómicos constituían casi el 73% del total de extremos erosionados involucrados en las aberraciones de tipo tel-dsb, mientras que si esperáramos una participación al azar de todos los extremos del genoma, ésta tendría que ser sólo del 17%. Así pues, la participación preferencial de los extremos cromosómicos con mayor erosión telomérica en anomalías tel-dsb, muestra claramente que son aquellos cromosomas portadores de los telómeros más cortos los que generan el incremento de anomalías de tipo tel-dsb en HMEC irradiadas a PD avanzados y, por lo tanto, los responsables de su mayor radiosensibilidad. 8

9 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Con referencia a nuestros estudios sobre inestabilidad cromosómica, es bien sabido que la mayoría de cánceres en humanos son carcinomas, es decir de origen epitelial, y afectan a la población adulta. Más del 85% de los carcinomas presentan CIN y ésta se manifiesta con la presencia de anomalías cromosómicas tanto estructurales como numéricas (aneuploidías). En los últimos años se ha avanzado enormemente en el conocimiento de los mecanismos que generan CIN durante la carcinogénesis. Se ha establecido que el acortamiento telomérico en las células epiteliales proliferantes, junto con deficiencias en el control del ciclo celular, es capaz de generar anomalías cromosómicas estructurales. Debe destacarse que nuestros estudios han permitido determinar que la disfunción telomérica no sólo es capaz de generar anomalías cromosómicas estructurales, sino que también es causante de anomalías numéricas. La comprensión de los mecanismos que originan las aneuploidías en relación con la carcinogénesis es uno de los objetivos principales de la investigación biológica, puesto que se sabe que, junto con las anomalías cromosómicas estructurales, las aneuploidías generan desequilibrios en las dosis génicas que se encuentran en la base de los procesos de carcinogénesis. En las HMEC, los puentes anafásicos que se forman en las células proliferantes por la fusión de dos cromosomas con disfunción telomérica pueden resultar no sólo en la fragmentación del puente (causa de inestabilidad cromosómica estructural), sino también en una tensión mecánica que libera una o ambas cromátidas de su unión a uno de los polos del huso, dando lugar a la pérdida de cromosomas enteros. Recientemente se ha propuesto que las células aneuploides también pueden aparecer mediante un intermediario tetraploide (4N). Las células tetraploides aparecerían en los estadios iniciales del proceso neoplásico y posteriormente darían lugar a poblaciones aneuploides genéticamente 9

10 inestables que precederían al cáncer. La presencia de células con un cariotipo casi tetraploide es una característica habitual de las células tumorales. Poblaciones celulares con un contenido en cromosomas de entre 42 y 95 es frecuente en adenocarcinomas de próstata, páncreas, ovario, hígado, intestino, riñón o mama, así como en carcinomas uterinos de células escamosas. Además, esta condición se ha observado frecuentemente en lesiones primarias de carcinoma cervical (Olaharski et al., 2006) o en lesiones premalignas de esófago de Barrett, donde la aparición de células tetraploides previa a la aparición de aneuploidía se ha correlacionado con la pérdida del gen supresor de tumores p53 (Barrett et al., 2003; Maley, 2007). La demostración directa que la tetraploidía tiene una significación importante en la tumorigénesis, procede de un estudio en células epiteliales mamarias de ratones en un ambiente defectivo en p53 (Fujiwara et al., 2005). El bloqueo artificial de la citocinesis en estas células produjo una población tetraploide que presentaba un número de anomalías cromosómicas mayor que las células con un contenido diploide de DNA. Además, las células tetraploides fueron las únicas en mostrar in vitro transformación celular tras ser tratadas con agentes carcinógenos, y todavía más importante, fueron capaces de formar tumores en ausencia del carcinógeno cuando fueron inyectadas subcutáneamente a ratones inmunodeprimidos. Dado que la disfunción telomérica es una fuente de generación de anomalías en la estructura y en el número de cromosomas, es de vital importancia determinar si también podría estar implicada en la generación de cambios en la ploidía de las células. Los puentes anafásicos podrían provocar una tensión capaz de abortar la citocinesis, originando células 4N. Entonces, estas células tetraploides, con un número extra de centrosomas, organizarían husos mitóticos aberrantes, originando múltiples aneuploidías en las células hijas resultantes. En cualquier caso, el acoplamiento de los puentes anafásicos a la regresión del anillo contráctil proporcionaría una explicación para la prevalencia de células con múltiples 10

11 anomalías estructurales, un número hiperdiploide de cromosomas y con amplificación de centrosomas observada en muchos tipos de carcinomas. Por otra parte, la idea emergente de nuestros estudios sobre disfunción telomérica y radiosensibilidad es que los telómeros críticamente cortos actúan como si fueran verdaderas roturas del DNA capaces de activar las vías de respuesta al daño en el genoma. Esta conclusión queda reforzada por estudios que demuestran que factores de respuesta al daño en el DNA forman foci sobre los telómeros erosionados en células fibroblastos senescentes (d Adda di Fagagna et al., 2003). A partir de los resultados obtenidos hemos propuesto un modelo para explicar la elevada radiosensibilidad de las células con telómeros disfuncionales. Suponiendo una rotura radioinducida en un cromosoma, la probabilidad de reunión correcta de los extremos generados es radicalmente diferente en células con longitud telomérica normal, por un lado, y en células con telómeros críticamente cortos, por el otro. En el primer caso, cada extremo cromosómico roto sólo puede unirse a otro extremo roto, haciendo que la probabilidad de reconstitución del cromosoma original sea alta si el número de roturas inducidas es bajo. Por el contrario, en células con telómeros cortos disfuncionales, los extremos rotos pueden unirse, además de los DSB, a otros extremos cromosómicos desprotegidos por disfunción telomérica, disminuyendo así la fidelidad de la reparación de las roturas generadas. Desde el punto de vista de protección radiológica, es importante resaltar que los telómeros se acortan en la glándula mamaria normal con los sucesivos ciclos de proliferación celular que tienen lugar con la edad en cada ciclo menstrual. Además, el silenciamiento del gen de p16 INK4a es común en células epiteliales de la glándula mamaria normal (Holst et al., 2003). Aproximadamente un 40% de las muestras de glándula mamaria de mujeres sin cáncer de mama ni predisposición al mismo presentan foci de 11

12 células con hipermetilación del promotor de p16 INK4a. Es más, estos foci coinciden con áreas de células con longitud telomérica inferior a las vecinas (Tlsty et al., 2004). Todo ello, junto con los resultados expuestos anteriormente, imprime una dimensión temporal a la radiosensibilidad: en la población adulta, la radiosensibilidad de las personas de mayor edad puede estar incrementada por la presencia de telómeros erosionados en las células envejecidas. Una de las consecuencias que puede predecirse de estos resultados es que los riesgos de exposición a rayos-x por mamografía pueden no ser los mismos para todas las edades. Así pues, en términos de protección radiológica, es importante investigar los efectos de las bajas dosis de rayos-x utilizados en mamografías sobre células epiteliales mamarias humanas y la influencia del envejecimiento celular en estos efectos. 4. Publicaciones A. Genescà, M. Martin, L. Latre, D. Soler, J. Pampalona, L. Tusell Telomere dysfunction: a new player in radiation sensitivity. BioEssays 28: , 2006 L. Tusell, D. Soler, M. Agostini, J. Pampalona, A. Genescà The Number of Dysfunctional Telomeres in a Cell: One Amplifies; More than One Translocate Cytogenetics and Genome Research 122: , 2008 D. Soler, J. Pampalona, L. Tusell, A. Genescà Radiation Sensitivity increases with proliferation-associated telomere dysfunction in nontransformed human epithelial cells Aging Cell 8: ,

13 J. Pampalona, D. Soler, A. Genescà, L. Tusell Telomere dysfunction and chromosome structure modulate the contribution of individual chromosomes in abnormal nuclear morphologies Mutation Research 683:16-22, 2010 J. Pampalona, D. Soler, A. Genescà, L. Tusell Whole chromosome loss is promoted by telomere dysfunction in primary cells Genes, Chromosomes & Cancer 49: , 2010 D. Soler, J. Pampalona, M. Ribas, L. Tusell, A. Genescà Los telómeros, un nuevo factor modulador de la radiosensibilidad celular (pp.71-87) En: Avances en Radiobiología. Madrid: CIEMAT, 2007 L. Tusell, D. Soler, M. Martín, L. Latre, J. Pampalona, M. Terradas, A. Genescà Chapter 2: When chromosomes become uncapped: Telomere dysfunctiondriven chromosomal instability in carcinogenesis (p.27-42) En: Multiple pathways in cancer development. Kerala: Transworld Research Network,