ACTIVIDADES DE LOS LABORATORIOS DE LA S.G. DE SANIDAD E HIGIENE ANIMAL Y TRAZABILIDAD DURANTE EL AÑO 2014

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1 ACTIVIDADES DE LOS LABORATORIOS DE LA S.G. DE SANIDAD E HIGIENE ANIMAL Y TRAZABILIDAD DURANTE EL AÑO 2014 Desde la Coordinación General de Laboratorios se gestionan los laboratorios adscritos a la Subdirección General de Sanidad e Higiene Animal y Trazabilidad: Laboratorio Central de Veterinaria (LCV), sito en Algete (Madrid), que incluye el Servicio de Garantía de Calidad y QUE está dividido en dos grandes áreas: Sanidad Animal y Genética Molecular Laboratorio Central de Sanidad Animal, sito en Santa Fe (Granada) A) LABORATORIO CENTRAL DE VETERINARIA (LCV) 1. SERVICIO DE GARANTIA DE CALIDAD (GC) Introducción El LCV está Acreditado en base a la Norma UNE/EN-ISO Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración, desde enero de Asimismo el LCV mantiene implantado un sistema de gestión medioambiental desde el año 2002 en base a la Norma ISO Sistemas de Gestión Ambiental. En noviembre de dicho año se certificó el sistema por AENOR como entidad certificadora. Para una gestión más eficiente de las certificaciones y acreditaciones el LCV mantiene un Sistema Integrado de Gestión que incluye la gestión de calidad, gestión ambiental y gestión en PRL. El Sistema Integrado de Gestión (SIG) del LCV se mantiene activo diariamente, lo cual implica, además de la elaboración y revisión de los textos, una actividad constante coordinando el trabajo de GC con los diferentes departamentos del LCV y con la Dirección Desde el Servicio de Garantía de Calidad se elaboran y revisan para mantener actualizados en todo momento, tanto el Manual del Sistema Integrado de Gestión (MSIG), como los Procedimientos Generales del Sistema Integrado de Gestión (PGSIG); Instrucciones de Carácter General (ISIG); y Procedimientos de Mantenimiento/Verificación/Calibración (PCSIG). Asimismo se revisan los procedimientos normalizados de trabajo de los departamentos del LCV implicados en procesos de gestión de calidad. Siempre buscando una mejora continua del SIG el LCV establece todos los años objetivos y metas para trabajar sobre aspectos significativos de su sistema, tanto a nivel medioambiental como de calidad o de bioseguridad. En 2014 se establecieron 5 objetivos. Principales logros alcanzados en 2014 El LCV ha conseguido el alcance flexible para dos categorías de ensayo. En octubre de 2014 AENOR ha renovado el Certificado de Gestión Ambiental en base a la Norma , tras la Auditoría recibida en septiembre. 1

2 La responsable del SIG ha impartido charlas en 2014 sobre los Sistemas Integrados de Gestión y la Bioseguridad en Laboratorios (Congreso nacional de AEBioS, Jornada interministerial PRL). TÉCNICAS ACREDITADAS EN EL LCV POR LA NORMA UNE/EN-ISO ENSAYOS CERRADOS ALCANCE FLEXIBLE (2 CATEGORÍAS DE ENSAYO) Área Sanidad Animal Área Genética y Control AREA DE SANIDAD ANIMAL En virtud de la legislación europea y nacional (legislación marco: Ley 8/2003 de sanidad animal y Reglamento (CE) 882/2004 sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificación del cumplimiento de la legislación en materia de piensos y alimentos y la normativa sobre salud animal y bienestar de los animales), el LCV- Sanidad Animal tiene conferidas las funciones de laboratorio nacional de referencia para numerosas enfermedades de los animales, zoonosis y agentes zoonóticos, así como laboratorio de referencia europeo y de la OIE (Organización Mundial de la Sanidad Animal) para Peste equina africana. Entre las enfermedades animales, zoonosis y agentes zoonóticos de las que el laboratorio es referencia es posible destacar (lista no exhaustiva): Fiebre aftosa, Enfermedad vesicular porcina, Estomatitis vesicular, Lengua azul, Leucosis bovina enzoótica, Peste porcina clásica, Peste porcina africana, Enfermedad de Aujeszky, Salmonelosis animales, Campilobacteriosis, E. coli verotoxigénico, Yersiniosis, vigilancia de resistencias antimicrobianas en producción primaria, Listeriois, Leptospirosis, Tularemia, Influenza aviar y Enfermedad de Newcastle, Mixomatosis y Enfermedad hemorrágica del conejo, Enfermedades de los caballos, Enfermedades de los peces y crustáceos, Varroosis y otras enfermedades de la abejas Las tareas y responsabilidades como laboratorio de referencia incluyen: asesoramiento técnico especializado de los servicios veterinarios oficiales, en particular de las unidades técnicas del MAGRAMA cooperación y colaboración con los respectivos laboratorios de referencia de la UE (LR-UE) para la armonización del diagnóstico en los Estados miembros de la UE, en particular mediante la participación en ensayos de aptitud, ensayos colaborativos y asistencias a reuniones técnicas anuales cooperación y colaboración con los laboratorios de las CC.AA para garantizar la armonización del diagnóstico en todos los territorios del Estado, en particular mediante la organización de ensayos de aptitud, elaboración y distribución de material de referencia y organización de reuniones técnicas. 2

3 realización de diagnóstico de confirmación de las enfermedades animales, zoonosis y agentes zoonóticos, y caracterización molecular de agentes patógenos control de las importaciones/exportaciones de animales, en particular équidos (animales vivos y esperma) desarrollo y valoración de técnicas de diagnóstico; seguimiento de los kits y reactivos de diagnóstico utilizados en la vigilancia y control de enfermedades, y mantenimiento de banco de cepas/sueros Principales logros y metas alcanzados Se han implantado los métodos de análisis filogenético del virus de la Peste porcina africana. En el ámbito de la implantación de sistema de calidad según la Norma ISO 17,025, se han validado nuevos métodos de PCR para ser incluidos en la Lista de Ensayos Bajo Acreditación (LEBA) asociada al alcance flexible para la categoría de ensayo (NT18 de ENAC) para la categoría Detección e identificación mediante PCR de virus de interés veterinario. En el ámbito las referencias internacionales, el laboratorio ha liderado la organización de un ensayo colaborativo entre laboratorios de referencia de la OIE para evaluar los métodos de PCR para la rápida detección de brotes y para el control del comercio internacional de équidos. Por último, cabe destacar la realización de una prueba de inmunoprotección con la vacuna comercial inactivada frente a la Enfermedad hemorrágica del conejo bajo los criterios de la Farmacopea Europea, con el objetivo básico de confirmar de manera independiente la eficacia de la misma. Resumen de los análisis realizados En 2014 se realizaron más análisis cuyo detalle por enfermedades y patógeno por método empleado pueden consultarse en el gráfico y la tabla siguientes: Análisis realizados por enfermedad/patógeno animal 3

4 Análisis realizados por método de laboratorio Tipo de diagnóstico Subtotal %* Tipo de diagnóstico Subtotal %* Diagnósticos bacteriológicos ,2 Diagnósticos virológicos ,6 Aislamiento por cultivo ,9 Aislamiento viral en cultivo celular 13 0,0 Aislamiento viral en huevo Aislamiento por cultivo e identificación ,6 embrionado ,5 Bioensayo 170 0,3 Detección por PCR convencional ,2 Caracterización molecular 10 0,0 Detección por PCR en tiempo real ,6 Detección por PCR convencional ,9 Secuenciación ,8 Detección por PCR en tiempo real ,1 Técnicas serológicas (VNT) ,8 Secuenciación 170 0,3 Técnicas serológicas (ELISA) ,1 Serotipado ,2 Técnicas serológicas (IBT) 241 0,4 Técnicas serológicas (Aglutinación) 901 1,5 Técnicas serológicas (Inmunodifusión) ,5 Técnicas serológicas (Fijación del Técnicas serológicas (IPT) 37 0,1 complemento) 947 1,5 Diagnósticos parasitológicos ,4 Técnicas serológicas (NPLA) 278 0,4 Detección por PCR convencional 850 1,4 Técnicas serológicas clásicas (IHA) ,3 Técnicas serológicas (ELISA) 538 0,9 Diagnóstico de micoplasmas aviares ,0 Técnicas serológicas (Fijación del Secuenciación 16 0,0 complemento) 736 1,2 Detección de resistencias Técnicas serológicas (aglutinación) 21 0,0 antimicrobianas 517 0,8 Técnica de microdilución en caldo para Técnicas serológicas (ELISA) ,9 la determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) 517 0,8 (*)Porcentaje calculado sobre el total de análisis realizados Total ,0 Ensayos de Intercomparación En su labor de coordinación de los laboratorios de la CC.AA. se han organizado un total de 14 ensayos de aptitud de métodos serológicos, de aislamiento y de detección de ácido nucleico por PCR para el diagnóstico de laboratorio de algunas de las enfermedades/patógenos de mayor relevancia sanitaria: Lengua azul, Peste porcina africana, Enfermedad vesicular porcina, Influenza aviar y Enfermedad de Newcastle, Enfermedad de Aujeszky, Leucosis enzoótica bovina, Schmallenberg, y Salmonella. Por otra parte, la armonización del diagnóstico con los laboratorios de referencia internacional (UE, OIE) se ha garantizado mediante la participación en 88 ensayos de aptitud de métodos serológicos, virológicos, bacteriológicos y de detección por PCR para el diagnóstico de laboratorio de Fiebre aftosa, Estomatitis vesicular, Enfermedad vesicular porcina, Peste porcina clásica, Peste porcina africana, Lengua azul, Influenza aviar, Enfermedad de Newcastle, Peste equina, Anemia infecciosa equina, Muermo, Resistencias a antimicrobianos, Salmonella spp., Listeria spp., E.coli VTEC, Campylobacter spp., enfermedades de los peces y enfermedades de las abejas (Loque). Finalmente, el laboratorio organizó como Laboratorio de Referencia de la UE de Peste equina africana un ensayo de aptitud (ELISA, PCR) en el que participaron 24 laboratorios nacionales de referencia de la UE y otros 7 laboratorios expertos de Reino Unido, Suiza, Turquía, Marruecos, Túnez, México y Singapur, además del ya 4

5 mencionado ensayo colaborativo entre laboratorios de referencia de la OIE para la evaluación de los métodos de detección por PCR. 3. AREA DE GENÉTICA MOLECULAR Y CONTROL El Laboratorio de Genética Molecular y Control está compuesto por: Departamento de Genotipado ovino del gen prnp; Dpto. de Identificación Genética; Dpto. de Organismos Genéticamente Modificados (OMG); Dpto de Encefalopatía Espongiforme Transmisible (EET); Dpto de Control de Reactivos de Diagnóstico; Dpto de Histopatología y Animalario. Y es Laboratorio Nacional de Referencia para: Análisis del gen prnp Encefalopatías Espongiformes Transmisibles Genética animal. Enfermedades de los Crustáceos Muestras analizadas durante el año 2014: Genotipado ovino del gen prnp: Durante el año 2014 participaron 30 razas puras de ovino en el programa de selección. El total de muestras analizadas para el análisis del gen prnp fue de muestras 5116 muestras 212 muestras Erradicación de foco Ganado no selecto Programa de selección Identificación Genética: Se han analizado marcadores moleculares microsatélite de muestras repartidas en: Número de razas por especie: Número de muestras por especie: 13 6 EQUINO EQUINO OVINO OVINO CAPRINO CAPRINO 3 15 BOVINO BOVINO Además se ha realizado la detección de SNPs por microarrays 50K de Illumina en 264 muestras provenientes de la asociación AGRAMA y la Universidad de Córdoba. El número de solicitudes durante el año 2014 ha sido de procedentes de 6 razas de equino, 12 de ovino, 3 de caprino y 5 de bovino Nº solicitudes Filiación Genotipado Identificación

6 OMG: Se han realizado un total de 1416 análisis para OMG para la Subdirección General de Acuerdos Sanitarios y Control en Fronteras (SGASCF) y Oficina Española de Variedades Vegetales (OEVV) Nº muestras cribado Muestras identificadas OEVV SGASCF Control de Reactivos de Diagnostico: Controles de lotes de Kits de las enfermedades objeto de campañas de erradicación Controles para Registro/ Modificación /Renovación de productos Zoosanitarios Se han realizado controles de calidad de 230 kits de reactivos para enfermedades animales en un total de análisis. EET: Se han recibido 765 muestras y realizado un total de 921 análisis Confirmación Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) Confirmación Scrapie Diagnóstico de Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) Diagnóstico de Scrapie Discriminación cepas EEB Discriminación cepas Scrapie Histología: Se han analizado por histología convencional 102 muestras de EET y 195 por inmunohistoquímica.también se han realizado 95 estudios histológicos de muestras procedentes de otros departamentos del LCV para enfermedades diferentes de las EET. Animalario: Se ha realizado la cria y mantenimiento de gallos, gallinas, ovejas, cabras, conejos, cerdos y ratones para la producción de 102 reactivos de diagnostico para su uso en métodos de ensayo del LCV. Paralelamente, se mantienen 3 procedimientos de larga duración con animales de experimentación transgénicos y 2 se han comenzado y finalizado en el año

7 Ensayos interlaboratoriales: Nº Ensayos Organizados Departamento 2 EET Nº Ensayos como participante Departamento Organizador 1 Genotipado EURL 5 Id. Genética ISAG 2 OMG LNR / GIPSA 6 EET EURL 1 Genotipado EURL 5 Histología EURL Ponencias / trabajos presentados a reuniones. 3 Participaciones como profesorado en cursos / másteres. 2 Ponencias en congresos/jornadas. 5 Trabajos presentados en congresos/reuniones científicas. B) LABORATORIO CENTRAL DE SANIDAD ANIMAL (LCSA) Es Laboratorio Nacional de Referencia de numerosas enfermedades, muchas de ellas zoónoticas: Brucelosis, Tuberculosis, Carbunco, Estafilococos coagulasa positivo, Fiebre Q, Rabia, Leishmaniosis Equinococosis, Triquinosis, Criptosporiodiosis, Cisticercosis, Toxoplasmosis, Tripanosomiasis, Anisakiasis y otras parasitosis., Perineumonía Contagiosa Bovina y otras micoplasmosis animales Así mismo es Laboratorio Nacional de Referencia de Residuos de Medicamentos Veterinarios: Grupo A: Sustancias con efecto anabolizante y sustancias no autorizadas: A2: antitiroideos y A6: nitroimidazoles y clorpromazina Grupo B: B2a (antihelmínticos) B2b (coccidiostáticos, B2c (carbamatos y piretroides), B2d (tranquilizantes), B2e (antiinflamatorios no esteroideos), B2.f.: otras sustancias que ejerzan una actividad farmacológica, excepto corticosteroides carbadox y olaquindox) y B3f Además de los análisis relacionados con sus referencias, el LCSA ha realizado: PRODUCCIÓN DE MATERIALES DE REFERENCIA: ANTÍGENOS DOSIS BRUCELOSIS Rosa Bengala FC PCB FC EPIDIDIMITIS OVINA

8 Volumen de sueros control producidos: 1.174ml ENSAYOS INTECOMPARACIÓN ORGANIZADOS POR EL LCSA Brucelosis Intercomparativo Rosa de Bengala, RFC y ELISA Aislamiento e identificación por técnicas microbiológicas y de biología molecular. Técnicas de aislamiento e identificación de Brucella spp Identificación de Brucella por RT-PCR. B. ovis Serodiagnóstico por RFC de Epididimitis Ovina TB Diagnóstico histopatológico de TB Inmunodiagnóstico de TB por gamma-interferón PTB Serodiagnóstico de PTB por ELISA PCB Ensayo de intercomparación para el serodiagnóstico de PCB por celisa Residuos M. V. Residuos de Tireostáticos en Orina Residuos de AINEs en Músculo Residuos de Tireostáticos en Orina ENSAYOS INTECOMPARACIÓN EN LOS QUE HA PARTICIPADO EL LCSA Brucelosis TB MRSA PCB Equinococosis Rabia Residuos M. V. Proficiency Ring Trial Control de Antígeno (RB) Proficiency Ring Trial Aglutinación (RB), RFC y ELISA. Ensayo intercomparativo de potencia de PPD bovina. Bacteriological culture and direct detection of TB from clinical tissue samples Evaluation of the analytical sensitivity of PCR assays for the detection of MCT. Mycobacteria Recovery from Different Culture Media. Identification and typing of Methicilin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Susceptibilidad antimicrobiana de estafilococos Ensayo de intercomparación para el serodiagnóstico de PCB por celisa Detección de Echinococcus spp. adult forms in the intestinal mucosa. Seroneutralización del Virus Rábico por anticuerpos fluorescentes Pesticides in Liquid Whole Egg Test Material Proficiency test antihelmintics and coccidiostats in compound feed at carry over level Antihelmintics residues in bovine milk Avermectins Corned Beef Coccidiostats in Chicken (Hens) Eggs Nitroimidazoles in Chicken (Hens) Eggs Pesticide Residues in Milk Powder NSAIDs in Bovine Kidney Coccidiostats in food 8