Hacia las plantaciones de quercíneas en alta densidad: Clonación de encinas adultas mediante embriogénesis somática

Transcripción

1 6CFE01-211

2 2/9 Hacia las plantaciones de quercíneas en alta densidad: Clonación de encinas adultas mediante embriogénesis somática BARRA JIMÉNEZ, A. 1, RUIZ GALEA, M. 1, CELESTINO MUR, C. 1, TORIBIO IGLESIAS, M. 1, ARRILLAGA MATEOS, I. 2, ALEGRE ÁLVARO, J. 1 y PEÑUELAS RUBIRA, J.L. 3 1 Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA). Finca El Encín. Apdo Alcalá de Henares, Madrid. 2 Dpto. Biología Vegetal. Facultad de Farmacia. Universidad de Valencia Burjassot, Valencia. 3 Centro Nacional de Recursos Genéticos Forestales "El Serranillo", Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. Apdo Guadalajara. Resumen La bellota es un producto de la dehesa esencial para la actividad ganadera y en especial para el desarrollo del cerdo ibérico. Su producción es irregular y en ocasiones escasa. El establecimiento de plantaciones de quercíneas mediterráneas en alta densidad para la producción de fruto, se plantea como una actividad adecuada para el desarrollo rural. Para establecer dichas plantaciones productivas es necesario disponer de diferentes técnicas de propagación vegetativa que permitan la clonación de material genético valioso, por ejemplo como portainjertos. Nuestro equipo ha establecido una metodología para inducir embriogénesis somática en tegumentos de óvulos de encina en desarrollo. El objetivo del presente trabajo fue la regeneración de plantas a partir de embriones somáticos. Para ello se utilizaron embriones de maduración espontánea obtenidos de tres líneas embriogénicas, una de ellas procedente de una encina seleccionada para la producción de bellota. Los embriones se cultivaron en un medio con carbón activo y se sometieron a dos meses de tratamiento en frío. A las ocho semanas de ponerlos en condiciones de germinación, las frecuencias de embriones que emitieron exclusivamente su raíz variaron según los genotipos entre el 52 y el 58%, y las de los que germinaron completamente (emitiendo raíz y tallo) entre el 15 y 29%. La frecuencia de germinación de uno de los genotipos evaluados se incrementó hasta el 41% cuando se incorporaron reguladores de crecimiento al medio de cultivo. Palabras clave Biotecnología, bellotas, micropropagación, plantaciones forestales, propagación vegetativa, Quercus ilex. 1. Introducción La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies leñosas más importantes en el ecosistema mediterráneo, que junto con el alcornoque (Q. suber) y el quejigo (Q. faginea) conforma las dehesas. Además de su gran importancia ecológica, esta especie juega un papel relevante en el desarrollo rural al resultar una especie de interés económico tanto como productor principal de bellota, que sirve de alimento del cerdo de raza ibérica, como por las relaciones que establece con algunos hongos micorrizógenos comestibles, siendo la trufa negra (Tuber melanosporum Vitt.) el más apreciado, entre otros. Por otra parte, la supervivencia de las especies de quercíneas se encuentra amenazada principalmente por las condiciones climáticas variables, los incendios forestales, el abandono de las prácticas agrícolas y la enfermedad de la seca. En las últimas décadas el cerdo ibérico se ha convertido

3 3/9 en el protagonista de la actividad económica de la dehesa y ha revalorizado la bellota como parte imprescindible de su alimentación, cuando se quieren lograr productos de la máxima calidad. Sin embargo, la obtención de productos ibéricos de alta gama, está limitada por la superficie disponible para la montanera y por la producción de bellota. El futuro del cerdo ibérico, al menos el futuro de la producción más cualificada, se vincula a la reforestación, al cuidado de las superficies arboladas y a la disponibilidad de bellota (RAMÍREZ LOZANO y GÓMEZ NIEVES, 2001). La producción de bellota es vecera, lo que en muchas ocasiones conduce a su escasez. Por otra parte es difícil precisarla, entre otras razones porque la producción de fruto por árbol es muy variable. DAZA (2001), citando datos de Espárrago et al, afirma que la producción oscila entre 0 y más de 100 kg/árbol con valores medios de 8 a 20 kg/árbol. Por ello las plantaciones de quercíneas en alta densidad gestionadas para producción intensiva de bellotas pueden constituirse en un cultivo con alto valor productivo (PEÑUELAS, 2013). En la gestión intensiva de plantaciones juega un papel esencial la calidad genética del material a establecer. De acuerdo con la revisión realizada por DEY (1995) en las especies del género Quercus la producción de bellota tiene un considerable control genético existiendo buenos y malos productores de bellota, lo que justifica acometer programas de mejora genética para este carácter. En un programa de mejora la decisión sobre la técnica de propagación a aplicar es fundamental, condicionando los resultados que se obtendrán. Cuando el control genético sobre los caracteres a mejorar presenta un bajo componente de la varianza genética de tipo aditivo, la propagación por semilla proporcionará bajas ganancias genéticas. La propagación asexual o vegetativa (clonación), al aprovechar el componente no aditivo de la variación genética, transfiere a la descendencia la totalidad del potencial genético de los individuos seleccionados, al tiempo que la confiere uniformidad. En particular para la mejora de especies del género Quercus, la necesidad de disponer de protocolos de propagación vegetativa se considera prácticamente ineludible (SAVILL & KANOWSKI, 1993). La razón fundamental, aparte de la ventaja de la captura de todo el potencial genético de los parentales antes mencionada, reside en los problemas que presentan los huertos semilleros de estas especies, entre ellas la incompatibilidad del injerto a largo plazo, que no llegan a satisfacer las demandas de material para la reforestación (KLEINSCHMIT, 1986). El problema de la incompatibilidad de los injertos en quercíneas es importante si se pretenden establecer plantaciones injertadas para acortar la duración de la fase juvenil y conseguir una rápida entrada en producción. Por ello el desarrollo de patrones clonales que aparte de conferir uniformidad minimicen los problemas de rechazo, es de gran interés. La encina se considera una especie recalcitrante a la propagación vegetativa por métodos tradicionales. Sin embargo, actualmente se están acometiendo estudios para aplicar la biotecnología de la regeneración a la propagación de esta especie, con el objetivo de la mejora de la producción de bellota y de producción de planta para micorrización (LIÑÁN et al, 2011). La regeneración clonal de plantas por embriogénesis somática (ES) está considerada como una de las principales herramientas de la biotecnología vegetal integrada en programas de propagación a gran escala y en la conservación y mejora de los recursos genéticos, especialmente en el caso de lo genotipos selectos (HERNÁNDEZ et al, 2011). En los últimos años la ES se ha desarrollado como método para la regeneración de plantas en diferentes especies de quercíneas, pudiéndose clonar tanto individuos muy juveniles como árboles adultos, fundamentalmente en los casos de alcornoques y robles (VIEITEZ et al, 2012). La iniciación de los procesos de ES a partir de explantos juveniles tales como embriones cigóticos no entraña tantos problemas como la inducción en tejidos de árboles ya

4 4/9 adultos, cuya dificultad se ve incrementada al tratarse las quercíneas de las especies más recalcitrantes. No obstante, los tejidos que permanecen en las yemas, los brotes epicórmicos y tejidos cercanos a células implicadas en la reproducción sexual pueden llegar a conservar un cierto nivel de caracteres juveniles, lo cual posibilita que los tejidos sean reactivos a los procedimientos de ES (BONGA et al, 2010). La encina ha sido objeto de programas de micropropagación durante años. Un estudio preliminar comunicó la inducción de ES, aunque en baja frecuencia, a partir de tejidos de individuos adultos sin embargo, no fue posible la regeneración de plántulas a partir de dichos cultivos (FÉRAUD-KELLER & ESPAGNAC, 1989). Algunos años más tarde, se obtuvieron embriones somáticos (MAURI & MANZANERA, 2003) a partir de embriones cigóticos con los que fue posible estudiar los procesos de maduración y germinación. Recientemente, nuestro equipo ha logrado la inducción de ES a partir de tegumentos de óvulos en desarrollo, tomados de varios árboles en dos años sucesivos (BARRA et al, 2010; BARRA et al, 2011), y aunque las frecuencias de obtención de embriones somáticos son muy reducidas, ha sido posible el mantenimiento de líneas embriogénicas con resultados muy prometedores en cuanto a la producción de plántulas in vitro. 2. Objetivos Determinar la capacidad de germinación de embriones somáticos de tres líneas embriogénicas procedentes de tejidos de individuos adultos de encina, y obtener plántulas clónicas de dichos árboles in vitro. Evaluar el efecto de la adición al medio de reguladores de crecimiento sobre la germinación los embriones somáticos. 3. Metodología Los embriones somáticos empleados para la regeneración proceden de la inducción de los procesos de embriogénesis a partir de los tejidos de tres encinas adultas diferentes, cada una de ellas situada en una localidad geográfica: B6 (Los Santos de la Humosa, Madrid), E2 (El Encín, Madrid), y Q8 (Quintos de Mora, Toledo). Siendo esta última un genotipo selecto, es decir, un individuo seleccionado para la producción de bellota. La inducción de embriogénesis somática se llevó a cabo a partir de tegumentos de óvulos de encina en desarrollo, según un procedimiento descrito previamente (Barra et al, 2010; Barra et al, 2011), y las líneas embriogénicas se mantuvieron en fase proliferativa en oscuridad a 25 ±2 ºC, subcultivándolas cada 4 semanas en un medio de mantenimiento (SH) compuesto por los macronutrientes del medio SH (SCHENK & HILDEBRANDT, 1972), suplementado con micronutrientes, vitaminas y Fe-EDTA del medio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), 30 gl -1 de sacarosa y 6 gl -1 de agar (Plantagar S1000, B&V) dispensado en envases de tipo potito de 62 mm de diámetro x 66 mm de altura (Sigma; St. Louis, MO). Al cabo del tiempo de subcultivo se extrajeron los embriones somáticos cotiledonares individualizados de tres de las líneas mantenidas y se colocaron en medio de maduración durante otras 4 semanas en oscuridad y 25±2ºC, después de las cuales fueron almacenados durante 8 semanas en oscuridad a 4 ºC. Dicho medio de maduración, estaba compuesto por macronutrientes del medio descrito por SOMMER et al (1975), micronutrientes, vitaminas y Fe-EDTA del medio MS, 30 gl -1 de sacarosa, 0,02 gl -1 de ácido ascórbico, 10 gl -1 de carbón activo y 6 gl -1 de agar (Duchefa ), dispensado en los mismos envases de tipo potito utilizados en la fase de proliferación.

5 5/9 Posteriormente, se seleccionaron aquellos embriones que habían aumentado de tamaño hasta al menos 1-1,5 cm, de color marfileño opaco, con cotiledones prominentes y redondeados y poca o ninguna proliferación embriogénica adherida. Dichos embriones se transfirieron a medio de germinación, donde fueron mantenidos 2 meses a 25±2ºC con un fotoperiodo de 16h de luz proporcionada por tubos fluorescentes Sylvania Gro-Lux y Philips cool-white ( μm m -2 s -1 ). El medio de germinación estaba compuesto por medio basal SH antes descrito, y en el caso del ensayo de germinación suplementado con reguladores de crecimiento se añadieron 0.11 µm de bencilamino-purina (BAP) y 0,25 µm de ácido indolbutírico (IBA). La evaluación de la capacidad germinativa de los embriones se llevó a cabo durante dos meses, contabilizando durante las semanas 4ª y 8ª el número de embriones sin respuesta, con emisión exclusivamente de tallo, exclusivamente de raíz (germinación) y los que germinaron completamente, emitiendo tallo y raíz. 4. Resultados Durante las subsiguientes 8 semanas después de su selección, se evaluó la respuesta de los embriones somáticos cultivados procedente de las tres líneas embriogénicas (B6, E2 y Q8), anotándose la reacción obtenida al término de las semanas 4ª y 8ª. Aunque la disponibilidad de embriones iniciales se encuentra supeditada a las características intrínsecas de cada genotipo, siendo el genotipo Q8 con gran diferencia sobre los otros dos el más productivo, fue posible la obtención de un cierto número de ellos procedentes de varias líneas embriogénicas para poder confirmar la capacidad de regenerar plantas de dichas líneas. La respuesta de los embriones somáticos al cabo de cuatro semanas en condiciones de germinación varió según el genotipo. Entre el 16 y el 31% de los embriones no generaron ningún tipo de respuesta, y entre el 13 y el 25% habían germinado completamente (emitieron raíz y tallo). Por otra parte, en los tres genotipos la frecuencia de embriones que habían emitido sólo la raíz fue muy similar, en torno al 56% (Tabla 1). Sólo en embriones de dos de las líneas (B6 y Q8) se produjo de forma puntual, la emisión de tallo. Tabla 1. Respuesta de los embriones somáticos al cabo de 4 semanas en medio de germinación. Genotipo Nº ES Solo Raíz Solo Tallo Sin respuesta Germinación completa B (54%) 1 12 (31%) 5 (13%)* E (58%) 0 2 (17%) 3 (25%) Q (58%) 1 48 (16%) 78 (25%)* Fisher s exact test *P=0.055 A término de las ocho semanas de cultivo en condiciones de germinación, prácticamente se mantuvieron las mismas diferencias entre genotipos observadas tras cuatro semanas. Entre el 14 y el 31% de los embriones no mostraron ningún tipo de respuesta, y germinaron completamente entre el 15 y el 29%. Como en el recuento anterior, la frecuencia

6 6/9 de embriones que habían emitido sólo la raíz fue muy similar en los tres genotipos, en torno al 55% (Tabla 2). Entre los genotipos más extremos, B6 y Q8, las frecuencias de germinación completa fueron significativamente diferentes, prácticamente el doble una que otra. Tabla 2. Respuesta de los embriones somáticos al cabo de 8 semanas en medio de germinación. Genotipo Nº ES Solo Raíz Solo Tallo Sin respuesta Germinación completa B (52%) 1 12 (31%) 6 (15%)* E (58%) 0 2 (17%) 3 (25%) Q (57%) 1 42 (14%) 89 (29%)* Fisher s exact test *P=0.048 En la evaluación del efecto de los reguladores de crecimiento sobre el tipo de respuesta morfogénica de los embriones somáticos procedentes de la encina Q8, se observó que al cabo de las primeras cuatro semanas de cultivo en condiciones de germinación no había diferencias por el hecho de aplicar o no reguladores sobre la frecuencia de embriones que dieron algún tipo de respuesta, respondiendo el 85% (Tabla 3). Hubo diferencias muy significativas por el hecho de aplicar reguladores sobre las frecuencias de germinación completa, al germinar el 35% de los embriones en medio con reguladores frente al 20% que lo hizo en medio carente de ellos. Tabla 3. Respuesta de los embriones somáticos del genotipo Q8 después 4 semanas en medio de germinación en ausencia de reguladores de crecimiento (SH-) y en presencia de ellos (SH+). Medio Nº ES Solo Raíz Solo Tallo Sin respuesta Germinación completa SH (63%)* 0 32 (16%) 40 (20%)** SH (49%)* 1 16 (15%) 38 (35%)** Fisher s exact test *P=0.012; **P=0.004 Después de 8 semanas de cultivo, la frecuencia de respuesta de los embriones cultivados en medio con reguladores se incrementó ligeramente, respondiendo el 90% (Tabla 4). Tabla 4. Respuesta de los embriones somáticos del genotipo Q8 después 8 semanas en medio de germinación en ausencia de reguladores de crecimiento (SH-) y en presencia de ellos (SH+). Medio Nº ES Solo Raíz Solo Tallo Sin respuesta Germinación completa SH (59%)* 0 32 (16%)** 49 (25%)*** SH (49%)* 1 10 (9%)** 45 (41%)*** Fisher s exact test *P=0.054; **P=0.058; ***P=0.002

7 7/9 Tanto en medio con reguladores como sin ellos, algo más de la mitad de los embriones puestos a germinar siguieron mostrando exclusivamente la emisión de raíz. También la frecuencia de los embriones que germinaron completamente fue significativamente mayor en medio con reguladores del crecimiento, del 41 frente al 25% (Tabla 4). 5. Discusión La producción de plántulas de encina en condiciones in vitro a partir de embriones somáticos, quedó sujeta a la obtención de embriones diferenciados espontáneamente de cada una de las líneas embriogénicas, concluyendo que la maduración y la conversión en planta de los embriones somáticos está bajo control genético, y que por tanto el genotipo juega un papel fundamental en ambos procesos (WILHELM, 2000). Las frecuencias de germinación, y por ello de regeneración de plántulas, varían de unos genotipos a otros, obteniéndose porcentajes más elevados en el caso del genotipo Q8 al cabo de las 8 semanas de cultivo. Tal y como cabía esperar, la capacidad de germinación parece depender en gran medida del genotipo, así como también lo es la respuesta a los procesos de inducción de embriogénesis somática. Esta relación de dependencia ha sido descrita tanto en alcornoque (HERNÁNDEZ et al, 2003), como el roble (SAN-JOSÉ et al, 2010). Los resultados obtenidos al cultivar durante 8 semanas embriones somáticos procedentes de líneas embriogénicas que han permanecido en cultivo durante al menos 2 años, indican que la capacidad de germinación de las líneas no se ha visto afectada por el origen maduro de los tejidos (TORIBIO et al, 2004), los procesos de inducción de embriogénesis somática o el prolongado mantenimiento de las líneas en condiciones in vitro, al contrario de lo que sucede en otras especies (CORREDOIRA et al, 2003). En cuanto a la progresión de las diferencias morfogénicas en función del tiempo, la emisión del tallo es posterior al desarrollo radicular, aunque la frecuencia de embriones que emitieron tallo prácticamente no aumentó después de las cuatro semanas. El porcentaje de embriones que formaron raíces pero no emitieron tallo permaneció muy elevado, en torno a la mitad de los embriones puestos en cultivo, lo que indicaría la posible existencia de alguna malformación en el ápice caulinar, puesta de manifiesto en sistemas embriogénicos de muchas especies, y que requeriría mejorar los procesos de diferenciación y maduración (CHALUPA, 1995). Aunque los reguladores del crecimiento tuvieron efecto sobre la frecuencia de embriones germinados, su presencia no mejoró en gran medida esta respuesta. 6. Conclusiones A pesar de las características recalcitrantes de la especie y la importancia que juegan tanto el genotipo como las condiciones y tiempo de cultivo, en base a los resultados obtenidos hasta ahora podemos afirmar que la producción de plántulas, a partir de tejidos de individuos adultos de encina, es posible mediante embriogénesis somática. Y en consecuencia, la biotecnología de la regeneración permitirá la clonación de encinas adultas para su establecimiento en plantaciones de producción intensiva, siguiendo las estrategias de la silvicultura multivarietal, en apoyo a los programas de desarrollo rural y agrario.

8 8/9 7. Agradecimientos A Noelia Ramírez y Alfredo Cuevas por su colaboración técnica. Al Director y personal del Centro Quintos de Mora (Organismo Autónomo Parques Nacionales), por la autorización y colaboración en la recogida del material vegetal. Financiación del proyecto nacional AGL C01/C03 8. Bibliografía BARRA, A.; BLASCO, M.; RUIZ-GALEA, M.; CELESTINO, C.; ALEGRE, J.; ARRILLAGA, I.; TORIBIO, M.; Inducción de embriogénesis somática y establecimiento en medio líquido de líneas embriogénicas obtenidas de óvulos en desarrollo de encina. IX Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in Vitro de Tejidos Vegetales. Puerto de la Cruz - Tenerife. BARRA, A.; BLASCO, M.; RUIZ-GALEA, M.; CELESTINO, C.; ALEGRE, J.; ARRILLAGA, I.; TORIBIO, M.; Induction of somatic embryos in developing ovules of Quercus ilex L. II International Conference of the IUFRO Working Party Brno, Czech Republic. BONGA, J.M.; KLIMASZEWSKA, K.K.; VON ADERKAS, P.; Recalcitrance in clonal propagation, in particular of conifers. Plant Cell Tiss Org Cult 100: CHALUPA, V.; Somatic embryogenesis in oak, Quercus spp. En: Jain S.M.; Gupta P.K.; Newton, R.J. (eds.) Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Vol. 2, Angiosperms. pp Kluwer Acad. Publisher, Dordrecht, The Netherlands. CORREDOIRA, E.; BALLESTER, A.; VIEITEZ, A.M.; Proliferation, maturation and germination of Castanea sativa Mill. somatic embryos originated from leaf explants. Ann Bot 92: 1 8. DAZA, A.; Sistemas de Explotación. En: Porcino Ibérico: aspectos claves. Buxade, C,; Daza, A. (Eds) Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. DEY, D.C.; Acorn production in red oak. Ministry of Natural Resources, Ontario Forest Research Institute. Forest Research Information Paper. No pp FÉRAUD-KELLER, C.; ESPAGNAC, H.; Conditions d apparition d une embryogénèse somatique sur des cals issus de la culture de tissus foliares du chêne vert (Quercus ilex). Can J Bot 67: HERNÁNDEZ, I.; CELESTINO, C.; ALEGRE, J.; TORIBIO M.; Vegetative propagation of Quercus suber L. by somatic embryogenesis: II. Plant regeneration from selected cork oak trees. Plant Cell Rep 21: HERNÁNDEZ I.; Regeneración clonal de alcornoques adultos (Quercus suber L.) mediante embriogénesis somática. Tesis Doctoral. Universidad de Alcalá.

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