Conservación de las Colecciones de Historia Natural en Fluido: Análisis y Evaluación de las Alteraciones de los Especímenes a Largo Plazo

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1 2 Conservación de las Colecciones de Historia Natural en Fluido: Análisis y Evaluación de las Alteraciones de los Especímenes a Largo Plazo Amandine Péquignot Resumen Los museos desempeñan una función patrimonial, referida a la adquisición, conservación, restauración y exposición de colecciones adquiridas. Las colecciones constituyen un conservatorio de biodiversidad de valor inestimable. Su conservación es un desafío para la comunidad científica y museológica y puede únicamente ser mejorada tras la comprensión de los fenómenos de degradación que tienen lugar con el transcurso del tiempo. Entre las diferentes técnicas de preparación, la conservación en fluido es un método ampliamente utilizado para preservar todos los especímenes biológicos. Desgraciadamente, ciertos fluidos tienen efectos irreversibles sobre los especímenes. Un análisis de estos fenómenos de alteración, que ocurren en el modus operandi (fijación y conservación), es capital para la comprensión de las degradaciones observadas a lo largo del tiempo. Por otro lado, la utilización muy común de la formalina en la preparación de estas colecciones en museos, plantea, además de su acción química alterante, problemas de sanidad pública debido a su alta toxicidad y poder cancerígeno. El análisis y la evaluación de la estabilidad de los organismos según los fluidos empleados, a nivel morfológico y químico, es un medio eficaz para proponer nuevos métodos de preparación que aseguren al máximo posible la integridad de este patrimonio. Palabras clave: Espécimen de historia natural - Formalina - DSC - HPLC.

2 Patrimonio Cultural Naturaleza de los archivos a conservar Estimadas en casi tres mil millones de ejemplares, las colecciones biológicas representan el patrimonio natural de un país y constituyen un archivo histórico de utilidad múltiple, en el que la preservación de especímenes es la base para estudios sistemáticos, taxonómicos, filogenéticos, ecológicos o de genética de poblaciones, siendo elementos insustituibles en el conocimiento de la diversidad [1] biológica. Así, las colecciones biológicas son las depositarias de la biodiversidad, y no sólo sirven para la comunidad científica, sino que también han sido muy beneficiosas para la sociedad, la educación y la historia de un científico, de una institución, de la ciencia en general. A medida que las preocupaciones acerca de la preservación de la biodiversidad y la extinción de especies crecen, las colecciones constituyen un conservatorio de un valor inestimable. Esta herencia naturalista seca, comprimida, taxidermizada, fosilizada o preservada en fluido se reparte en una densa red: 330 instituciones, museos y universidades, conservando unos diez millones de especímenes en Francia [2]. La conservación de estas naturalias es desde ahora una puesta mayor para la comunidad científica y museológica en el mundo. Esta conservación únicamente puede ser mejorada mediante la comprensión de los diferentes fenómenos de degradación que pueden presentarse en el curso del tiempo [3]. A pesar de su importancia en términos de cantidad de objetos concernidos y de su interés a los ojos de los científicos y del público, la investigación sobre la conservación de los colecciones de historia natural desgraciadamente se tiene poco en cuenta. Recientemente, los directorios de 93 instituciones de 36 países de diferentes continentes firmaron la Declaración de Buffon (2007) que estipula que las colecciones de especímenes y otras bases de datos de historia natural constituyen un modelo de la variabilidad de la naturaleza, y forman parte de la infraestructura científica mundial. Son herramientas indispensables para comprender el impacto del cambio climático, de la pérdida de la biodiversidad y de los retos medioambientales. Los Estados y las organizaciones competentes están llamados a aportar un mayor apoyo a la conservación de estas colecciones irremplazables [4]. Esta toma de conciencia mundial está la espera de una acción concreta, y como cualquier colección patrimonial, las colecciones biológicas afrontan problemas de deterioro causado por agentes físicos, químicos y biológicos. Las colecciones en fluido en particular A- Historia de una técnica de preparación naturalista Las colecciones conservadas en fluido ocupan un lugar importante en los museos de historia natural y son el resultado de una técnica de preparación muy corriente y simple de realizar. El origen moderno de la preparación de colecciones de historia natural en fluido data de mediados del siglo 17, periodo en el que William Croone ( ), un físico inglés, mostró a la Royal Society de Londres dos embriones de perro mantenidos en espíritu de vino durante 8 días. A la misma época, Robert Boyle ( ), un químico irlandés, descubrió que los especímenes de historia natural pueden ser conservados en alcohol. Boyle relató las conclusiones de sus propios experimentos sobre el asunto en sus Some Considerations Touching the Usefulness of Experimental Natural Philosophy (1663), donde describió, por ejemplo, el empleo de espíritu de vino para las preservación de los cuerpos de la putrefacción. De esta manera conservó un pájaro y una serpiente en espíritu de vino con una pequeña cantidad de sal de amoníaco, montaje que mostró a la Royal Society en Otros naturalistas estudiaron la utilización del alcohol para la conservación de sus colecciones. El farmacéutico inglés James Petiver ( ) imprimió una instrucción para conservar animales en Cabinet, Ron, Brandy u otros alcoholes, al mismo tiempo que animaba a los naturalistas viajeros a recoger especímenes para él. El anatomista y médico holandés Federico Ruysch (l638-l73l) perfeccionó nuevas técnicas de preparación, como por ejemplo las inyecciones de ceras coloreadas en los sistemas vasculares de especímenes, y conservó el cuerpo de un hombre con alcohol diluido aproximadamente al 67%. En paralelo con la conservación en espíritu de vino, aparecen la utilización del óxido de plomo para aclarar el vidrio de los contenedores, y las técnicas de inyección de ceras coloreadas o de mercurio en los sistemas vasculares de animales y plantas. Las tapaderas de los vidrios fueron realizadas con vejiga de cerdo enlucida con cera para asegurar un buen cierre hermético. En el siglo 18, las tapaderas son de de plo-

3 Conferencias mo, En Francia, René-Antoine Ferchault de Réaumur ( ) preconizó, en 1748, entre sus cuatro técnicas de preparación la de conservar pájaros en espíritu de vino o brandy para su posterior envío. Así durante los siglos XVIII y XIX, viajeros y naturalistas recolectaron y enviaron ejemplares desde los cuatro rincones del planeta en espíritu de vino, como lo demuestran los manuscritos de Darwin durante su viaje por América del Sur. Un momento decisivo para las colecciones fue el empleo a mediados del siglo XIX del formaldehído, sustancia sintetizada por primera vez en 1859 por el científico ruso Aleksandr Mikhailovich Butlerov ( ) y categóricamente identificada en 1867 por el químico alemán August Wilhelm von Hofmann ( ). La capacidad de formaldehído para actuar como un preservativo de las células fue descubierta a finales de los años Sus propiedades adhesivas fueron encontradas por casualidad por un médico alemán Ferdinand Blum ( ) en Blum estuvo implicado en un proyecto de investigación sobre las propiedades antisépticas del formaldehído. Trabajando con una solución acuosa al 4% de formaldehído, Blum descubrió que sus dedos mojados se volvieron rígidos. Él escribió un artículo en el que describe su descubrimiento, experiencia inicial en el empleo del formaldehído como conservante. Numerosos naturalistas probaron esta nueva propiedad, como el botánico Ferdinand Cohn ( ), quien encontró que la formalina conservaba las plantas mucho mejor que el espíritu de vino. El siglo XX se caracteriza por la utilización intensiva de la formalina para la fijación y la conservación a largo plazo de las colecciones de historia natural [5]. B- Etapas de la preparación De todas formas, no hay que olvidar que las técnicas de preparación de las colecciones conservadas en fluido son mucho más diversas que las presentadas en esta rápida retrospectiva histórica. Podríamos decir, como en taxidermia, que cada preparador tiene su método. Actualmente, esta pluralidad en la preparación y el desconocimiento de muchas de las técnicas plantea problemas a la hora de conservar ciertos especímenes. Entre la gran variedad de métodos de preparación de las colecciones de historia natural, la conservación en fluido es uno de los más antiguos y, a día de hoy, continúa siendo el más utilizado para preservar todo tipo de organismos: animales, invertebrados y vertebrados, y plantas que pueden alcanzar tallas muy diferentes. La facilidad del procedimiento de preparación y su "universalidad" explican que este tipo de colección sea un material privilegiado para los estudios científicos y esté muy presente tanto en los museos de historia natural como en los establecimientos educativos (universidades, institutos y colegios). La preparación de una colección en fluido se efectúa siguiendo dos etapas claramente identificables. La primera consiste en una fijación del espécimen justo después de su muerte. El organismo se sumerge en el fluido con el fin de impedir la autólisis, es decir, la degradación de las proteínas y la coagulación de los contenidos de las células y, en la medida de lo posible, mantenerlos en condiciones cercanas a las que poseían durante la vida. El objeto de la fijación consiste en estabilizar la adhesión de los tejidos, que depende de los enlaces químicos, para así minimizar la degradación. La fijación verdadera, por ejemplo mediante el uso de formalina, forma enlaces covalentes para unir las moléculas de los tejidos. Anteriormente, el fluido empleado para esta etapa fue durante muchos años el etanol. En ese caso, la fijación realizada con alcoholes era una pseudofijación, porque no se forman enlaces covalentes y cambia los patrones de los enlaces hidrógeno. La calidad de la fijación depende de diferentes parámetros: el tiempo transcurrido entre la muerte del organismo y su tratamiento, la naturaleza del fluido o de la mezcla, el tiempo de inmersión en el fluido fijador, la temperatura ambiente, la concentración del fluido así como la proporción del volumen del fijador respecto al tamaño del espécimen. La segunda etapa consiste en la conservación del espécimen a largo plazo en un segundo fluido, que según el caso y las épocas, puede ser el mismo que el fijador o no. Un conservante debe ser un germicida que evite la degradación del espécimen. Son muchos los tipos de fluidos empleados para asegurarse la conservación, como ejemplo los alcoholes (etílico, metílico, isopropílico). Por sus propiedades biocidas e hidrófilas, el alcohol etílico fue el primer conservante que se usó desde los siglos XVI yx- VII. En general, se ha recomendado el etanol en concentraciones entre el 60 y el 80% según el tipo de organismo a conservar. El isopropanol (30-70%), también se recomienda como conservante, pese a tener algunos inconvenientes asociados, como su toxicidad, el doble que la del etanol, la dificultad de

4 Patrimonio Cultural mezclarle con otro solvente, el provocar el ablandamiento de los huesos y la decoloración de los tejidos a una concentración baja a 40% o el encogimiento significativo de los especímenes. Aunque el modus operandi siempre esté basado en estas dos etapas, la naturaleza de los fluidos (fijadores o conservadores) ha evolucionado en el transcurso de los siglos. A finales del siglo 19, la formalina era empleada en las dos etapas de preparación aunque a veces, después de una fijación en formalina, el espécimen se transfería a otro tipo de fluidos. Diferentes problemas de las colecciones preservadas en fluido A- La conservación Seguramente, durante la visita a algún museo de historia natural, han sido testigos del problema de conservación de los especímenes en fluido. Las alteraciones que sufren los ejemplares son claramente visibles. Una de las más frecuentes es la decoloración (blanqueo en general) y la torsión del espécimen, con frecuencia motivadas por la naturaleza y la concentración del conservante, sin duda mal adaptado al organismo. La torsión de los ejemplares, observada con frecuencia, es debida, en gran parte, a los endurecimientos de los tejidos por la acción del fluido, particularmente la formalina que crea enlaces químicos muy fuertes a nivel de las proteínas, como veremos posteriormente. Otro problema que puede afectar a las colecciones es la evaporación, causada por la existencia de cierres defectuosos (porosos o quebradizos), y/o tapas mal adaptadas. Una temperatura ambiente no adecuada, por ejemplo muy alta, acelera la desecación y las fisuras de la junta, favoreciendo la evaporación. La consecuencia es el desarrollo de mohos o bacterias que pueden atacar y destruir la parte seca de los especímenes así como las etiquetas. La evaporación del alcohol es más rápida que la del agua porque su presión de vapor es mayor. Como el fluido se evapora del contenedor, las sustancias químicas se concentran en su interior. Los lípidos son solubles en alcohol, pero no en agua. Si la concentración de alcohol se hace demasiado baja, estos lípidos pueden precipitar y formar una capa sobre el espécimen o residuos de degradación que flotan o se sedimentan en el fondo del frasco. La lixiviación de lípidos es más importante en especímenes grasientos, como los peces o los cetáceos, que poseen grandes áreas de tejidos adiposos. La formalina conserva el lípido pero no lo fija, lo que conduce a su lixiviación y a la contaminación del fluido con glicéridos y ácidos grasos no unidos. La liberación de ácidos grasos causa una disminución del ph que, a su vez, conduce al decaimiento gradual y la alteración del espécimen, así como a la aparición de una coloración amarillenta o anaranjada del fluido, indicio muy característico de los fenómenos de alteración [6]. Está claro que las diferentes degradaciones que puede sufrir un espécimen preservado en fluido son muy dependientes las unas de otras y genera un círculo vicioso que se acentúa por tratarse de un sistema cerrado. El análisis de estos fenómenos de alteración es capital para la comprensión de las degradaciones de los especímenes que pueden sobrevenir en el curso del tiempo y, en consecuencia, para proponer soluciones en materia de conservación preventiva para este patrimonio científico particular. Sin embargo, los estudios químicos sobre la conservación de estas colecciones son poco numerosos. La gran mayoría son obra de von Endt y sus colaboradores. Sus investigaciones abrieron numerosas pistas sobre la estabilidad de las colecciones en fluido: evidenciaron la existencia de un envejecimiento acelerado propio de esta tipología de colecciones [7], identificaron los residuos de degradación en los fluidos [8], evaluaron el efecto de los tratamientos preservativos en el ADN [9] y en proteínas como la queratina y el colágeno [10] y, finalmente, cuantificaron el efecto del curtido y del proceso de fijación en las propiedades físicas de la piel [11]. B- El peligro de la formalina Además de los aspectos de conservación, el uso de formalina plantea, desde hace algunos años, problemas de Salud Pública. En Francia, desde 2004, el Centro Internacional de Investigación sobre el Cáncer (CIRC) clasificó el formaldehído como cancerígeno para el hombre en categoría 1, teniendo como base estudios epidemiológicos que demostraban una asociación entre la exposición al formalde-

5 Conferencias hído y el diagnóstico de nuevos cánceres [12]. Las autoridades francesas decidieron someter a los trabajadores expuestos a normas propias para la prevención de los riesgos derivados de la exposición a agentes cancerígenos. Es responsabilidad del director del establecimiento tomar las medidas necesarias para asegurar la seguridad y proteger la salud de los trabajadores: la sustitución es una obligación legal [13]. Esta legislación tiene repercusiones directas sobre los establecimientos que custodian colecciones de historia natural en formalina, como los museos, los centros de investigación y los centros escolares. Para estos últimos, una nueva directiva ministerial, fechada en febrero de 2008, solicita a los diferentes rectores de academias "que los establecimientos escolares procedan a la eliminación total del formaldehido y, en consecuencia, las colecciones, por utilizar formalina, ya no pueden ser conservadas en el establecimiento [14]. Esta disposición podría aplicarse en el futuro al conjunto de museos que alberguen colecciones preservadas en formalina. Evaluación de la estabilidad de los especímenes Frente a este doble problema de conservación y de salud, se está realizando un proyecto financiado para dos años por el Ministerio de la Cultura en el marco del Programa Nacional de Investigación sobre el Conocimiento y la Conservación de los materiales del Patrimonio Cultural (PNRCC) en colaboración entre el Museo de París (responsable del proyecto) y el Museo de historia natural de Toulouse. En primer lugar se trata de identificar y evaluar el proceso de alteración de los especímenes preservados en fluido gracias al estudio de los mecanismos de acción de los fluidos seleccionados, analizando y evaluando la estabilidad de los organismos, tanto morfológica como química (proteínas y ADN). Para comprender mejor esas alteraciones, se emplea una metodología basada en el envejecimiento acelerado del sistema fluido-espécimen. En segundo lugar, se pretende encontrar un sustituto al formol para la fijación, compuesto seleccionado por sus propiedades de conservación y ajustado a las normas de higiene y seguridad. A- Materiales y métodos Las alteraciones del espécimen se estudian a diferentes niveles, tanto morfo-anatómico (variación de talla y de coloración del pelo del organismo), como molecular (variación de la temperatura de desnaturalización de las fibras de colágeno por medio de la Calorimetría Diferencial de Barrido, DSC; estudio de las modificaciones de los enlaces entre moléculas orgánicas con la Espectroscopia infrarroja (FTIR) y análisis cromatográfico (HPLC) de los productos de alteración de los aminoácidos del colágeno) y genético (gracias a una extracción de los ácidos nucleicos que permite un análisis cualitativo de su presencia, de la talla y/o de la secuencia de fragmentos de ADN). Para tener una visión amplia sobre estos fenómenos de degradación, se realiza un envejecimiento acelerado del sistema "espécimenfluido" a diferentes temperaturas. La primera fase del proyecto consiste en la preparación de una colección de estudio que permita controlar el modo operatorio y de muestrear sin restricción. El ejemplar modelo escogido es la rata, un mamífero fácil de adquirir y de talla razonable. Por otro lado, la rata es una especie modelo muy utilizada en estudios patológicos y dermatológicos, lo que permite comparar nuestros resultados con los de publicaciones médicas. Las ratas eran almacenadas a -20 C y, tras ser descongeladas durante una hora, fueron medidas y pesadas para determinar el volumen de fijador necesario. La piel se diseca y se toman las primeras muestras (punto 0 del análisis) que se relacionan con medidas morfométricas y con el ph del fluido. Más tarde las ratas se meten en formol el 10% (10ml/1g) (fluido de referencia) durante 24 horas. Después de un enjuague en agua (con el fin de quitar un máximo de formalina), cada rata se prepara de nuevo, y se recogen muestras (tiempo 1) antes de sumergirla en etanol al 80% en un frasco hermético y opaco de Politetrafluoroetileno (PTFE) y de meterla en una estufa a la temperatura escogida. Para cada temperatura de envejecimiento ( C) hay 3 ratas y para cada rata se muestrea a las 2, 4, 6 y 24 horas. B- Calorimetría diferencial de barrido y resultados Uno de los primeros estudios realizados fue la observación de la degradación del colágeno, analizando la variación de la temperatura de desnaturalización de la proteína por medio de la calorimetría diferencial de barrido (DSC). La DSC es una técnica termo-analítica en la que la diferencia de calor entre una

6 Patrimonio Cultural muestra y una referencia se mide como una función de la temperatura. La muestra y la referencia son mantenidas aproximadamente a la misma temperatura a lo largo del experimento. El principio básico subyacente a esta técnica es que, cuando la muestra experimenta una transformación física, tal como una transición de fase o degradación, se necesitará que fluya más (o menos) calor a la muestra que a la referencia para mantener ambas a la misma temperatura. Cuando la muestra experimenta una transición, los calefactores suministran la energía adicional al material para mantener el equilibrio térmico entre muestra y referencia, y esto es lo que se registra. De esta manera, el termograma obtenido muestra el flujo calorífico o entalpía versus temperatura. Cinco muestras de piel de 2 a 3mg son afeitadas (la queratina puede desviar la aparición del pico de desnaturalización), luego rehidratadas en agua pura durante 45min y después se encierran en una cápsula hermética de aluminio [15]. Las muestras son analizadas por medio de un DSC Perkin-Elmer DSC7 bajo atmósfera inerte de nitrógeno (20b, y una velocidad de 10 C/min). Para la medición se coloca una cápsula de aluminio cerrada con la muestra y otra cápsula igual pero vacía, que sirve como referencia. Los termogramas muestran sin excepción el aumento de la temperatura de desnaturalización del colágeno después de su fijación con formol, pasando de 57,50 C (n=60 muestras) para la piel fresca a 85 C para la piel fijada, corroborando los resultados obtenidos en estudios previos [16, 17]. Por otro lado, la energía necesaria para alcanzar esta degradación también aumenta de 2,2 J/g a 3,5 J/g. Estos resultados traducen el efecto fijador real del formol, reforzando visiblemente la estructura del colágeno y limitando así su alteración mediante la creación de enlaces químicos muy fuertes, denominados puentes de metilino. En el transcurso del envejecimiento acelerado en etanol, la temperatura de desnaturalización del colágeno baja a lo largo del tiempo (2 horas, 4 horas, 6 horas y 24 horas). Esta disminución es tanto más importante a medida que la temperatura de envejecimiento aumenta. La similitud de los resultados abre perspectivas en cuanto a la aplicación de la ley de Arhénius (fórmula matemática que se utiliza para comprobar la dependencia de la constante de velocidad, o cinética, de una reacción con la temperatura a la que se lleva a cabo esa reacción), con el fin de prever las alteraciones efectivas en las condiciones normales de conservación en Museo. Esta será una de las próximas etapas de nuestra investigación. Conclusiones La toma en consideración de las colecciones de historia natural como patrimonio cultural es nueva en Francia y parece abrirse camino entre la comunidad científica y los encargados de la conservación en los museos. Sin embargo, la investigación sobre su conservación es muy reciente y sigue siendo un tema poco desarrollado por los científicos. Además, las formaciones destinadas a los preparadores y conservadores de los museos de historia natural son absolutamente necesarias con el fin de intercambiar conocimientos y de debatir sobre los problemas encontrados, para así proponer métodos de conservación preventiva y curativa y sensibilizar a la comunidad de los museos sobre el problema de la formalina en general. Agradecimientos Este trabajo fue financiado durante dos años por la Délégation au Développement et aux Affaires Internationales (DDAI) y la Mission de la Recherche et de la Technologie (MRT) del Ministerio de Cultura (MCC) de Francia, en el marco del Programme National de Recherche sur la Connaissance et la Conservation des Matériaux du Patrimoine (PNRCC 2008 (Programme:186 ; Sous-action:42 ; Titre:6 Catégorie:64). Agradezco especialmente a Santiago Aragón por su disponibilidad y por la relectura de este trabajo y a Fernando Marte por su ayuda y comentarios constructivos sobre este proyecto.

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