DIEGO ALEJANDRO MILLÁN RODRÍGUEZ. Directora. Dra. MARYLIN ELISEYEV HIDALGO DÍAZ M.Sc., Ph.D. Co-Director. Dr. ÁLVARO ADOLFO FACCINI MARTÍNEZ MD.

Transcripción

1 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, Mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca. DIEGO ALEJANDRO MILLÁN RODRÍGUEZ Directora Dra. MARYLIN ELISEYEV HIDALGO DÍAZ M.Sc., Ph.D. Co-Director Dr. ÁLVARO ADOLFO FACCINI MARTÍNEZ MD. Jurado Dra. RUBIELA CASTAÑEDA SALAZAR MV. M.Sc. PONTIFICA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARERRA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA 2012

2 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, Mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca. DIEGO ALEJANDRO MILLÁN RODRÍGUEZ APROBADO Decano Académico Facultad Ciencias Dra. INGRID SCHULER GARCIA Ph.D. Directora Carrera Microbiología Dra. JANETH ARIAS PALACIOS Ph.D. BOGOTÁ 2012

3 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, Mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca. DIEGO ALEJANDRO MILLÁN RODRÍGUEZ APROBADO Directora Dra. MARYLIN ELISEYEV HIDALGO DÍAZ M.Sc., Ph.D. Jurado Dra. RUBIELA CASTAÑEDA SALAZAR MV. M.Sc. BOGOTA

4 Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946 La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y justicia 4

5 AGRADECIMIENTOS: Gracias a Dios por guiar mis pasos y mis acciones, mis palabras, por la fortuna de llevar la vida que llevo. Pero más que nada, gracias a Dios por mis papás y mi hija. Agradezco antes que a cualquier otra persona a mis papás, Consuelo Inés Rodríguez Montoya y José María Millán Morales por la paciencia, por el amor, por los detalles, por el apoyo y las palabras que me dieron fuerza para levantarme después de cada paso en falso. Por confiar en mí, en mis capacidades y en mis ganas de salir adelante. Sin ellos NADA sería posible. Agradezco a mi esposa Paola Andrea Escobar Zabala y a mi pequeña Isa, la luz de mis ojos, la razón de mi vida. Gracias a ustedes me doy cuenta que siempre valdrá la pena cada esfuerzo realizado; tomamos la decisión correcta amor mío! Su apoyo y el gran amor que por ustedes siento son mi fuerza cada día. A mi directora Marylin Hidalgo Díaz y mi co-director Álvaro Faccini Martínez, quienes hicieron posible éste trabajo y a quienes agradezco su paciencia y orientación. Gracias por ser un apoyo y además entender por todo lo que pasé durante el desarrollo de éste trabajo. Gracias por ser aún mejores personas que orientadores. A todos mis compañeros del laboratorio de Bacteriología especializada por los consejos y la ayuda que nos brindaron durante el proceso, un gran grupo de trabajo. Al laboratorio de parasitología veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia por su apoyo en la recolección y la clasificación de las garrapatas. A mis amigos de la universidad, Diego Pedraza, Gustavo Araque, Paula Ospina, Camila Díaz, Alejandra Camacho y Alejandra Martínez, sin palabras, sólo gratos recuerdos y buenos momentos. A Daniel Granados, mi gran amigo, me ha acompañado desde el colegio y siempre ha estado presente para mí durante 16 años de amistad. Siempre con palabras precisas en momentos correctos. Y por supuesto a mi compañero de batallas, mi amigo, mi hermano, mi compañía, Elkin Valbuena, siempre que se pudo mi fórmula de trabajo, hasta el último momento. Gracias por el apoyo recibido durante 13 años de amistad. Siempre un placer trabajar juntos. 5

6 Tabla de contenido RESUMEN INTRODUCCIÓN JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA MARCO TEÓRICO Rickettsia Garrapatas (Ixodidae) como vectores de las rickettsiosis Biología molecular del género Rickettsia OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS METODOLOGÍA Zona y población de muestreo Recolección de garrapatas Clasificación taxonómica de las garrapatas Extracción de ADN a partir de los vectores recolectados Detección molecular de Rickettsia Análisis estadístico RESULTADOS Recolección de garrapatas Clasificación de las garrapatas Extracción de ADN y detección molecular de Rickettsia DISCUSIÓN CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS ANEXO 1. Clasificación taxonómica de las garrapatas ANEXO 2. Procedimiento de PCR para el gen 16S rrna ANEXO 3. Procedimiento de PCR para el gen glta ANEXO 4. Tabla de clasificación taxonómica y por estadío de las garrapatas

7 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca. RESUMEN Las rickettsiosis son enfermedades de carácter zoonótico, causadas por bacterias del género Rickettsia, que afectan a mamíferos, siendo en su mayoría transmitidas por garrapatas de diversas especies. En Colombia, no se han presentado reportes continuos sobre las enfermedades rickettsiales que permitan conocer su comportamiento epidemiológico, por esta razón se hace necesario realizar una determinación de la presencia del género Rickettsia mediante la amplificación del gen glta, conservado en éste género, en garrapatas recolectadas de caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca. Se encontró un total de 300 garrapatas que fueron clasificadas taxonómicamente como: Rhipicephalus sanguineus, el 95% (n=285), Amblyomma cajennense, 2,3% (n=7), Amblyomma ovale, 1,3% (n=4), Dermacentor nitens, 1% (n=3) y Rhipicephalus microplus, el 0,3% (n=1). De éstas garrapatas se obtuvieron 177 grupos, de los cuales en el 1,9% (n=3) se detectó la presencia del gen glta por medio de PCR convencional. A través de algunos estudios, se ha observado la importancia del papel de los caninos como reservorios potenciales, siendo animales que pueden ser usados como vehículos, y transportar las garrapatas desde algunas zonas de su preferencia como zonas silvestres, hasta la zona de contacto con los humanos, además en algunos estudios se han reportado signos de infecciones en humanos, antecedidos por casos clínicos en caninos y se resalta la importancia de la interacción entre los médicos humanos y los médicos veterinarios para evitar la propagación de enfermedades zoonóticas. Se detectó la presencia del gen glta en 3 garrapatas de las especies Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense y Dermacentor nitens por medio de PCR convencional, lo que sugiere la presencia de bacterias del género Rickettsia en la zona de estudio. Es necesario continuar con la aplicación de técnicas moleculares con el fin de amplificar genes más conservados para el género, como rompa y rompb, su consecuente secuenciación y el uso de herramientas como el BLAST para observar la homología de las secuencias y lograr la identificación de las especies de Rickettsia presentes en las garrapatas y, por ende, las especies circulantes en la zona de estudio. 7

8 1. INTRODUCCIÓN Las rickettsiosis son enfermedades de carácter zoonótico, causadas por bacterias del género Rickettsia, que afectan a mamíferos, siendo en su mayoría transmitidas por garrapatas de diversas especies (1). Las zoonosis, según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (2003), son aquellas enfermedades infecciosas naturalmente transmisibles entre los animales vertebrados y el hombre, donde los agentes patógenos pueden cumplir ciclos de vida que involucran más de un hospedero (1). Las infecciones causadas por bacterias de este género, han sido estudiadas en todo el mundo, debido a su amplia distribución (2), aunque se presentan algunas zonas de escasa documentación como el continente americano, en donde en las últimas décadas se ha venido trabajando en ello (3). Tras la falta de estudios continuos sobre la presencia de bacterias del género Rickettsia en Colombia, el presente estudio, busca detectar el gen glta, conservado en todas las bacterias del género, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca como aporte a un macro proyecto titulado Caracterización de factores climáticos y ecológicos de una especie de garrapata y su relación con la epidemiología de la rickettsiosis en un área endémica. 2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Las rickettsiosis son enfermedades causadas por la infección con bacterias del género Rickettsia, que ocasionan manifestaciones clínicas diversas que varían de asintomáticas a severas, según la especie de Rickettsia implicada (2).Son transmitidas a humanos y animales por garrapatas (entre otros ectoparásitos) de diversas especies que tienen ciclos de vida que involucran uno o más hospederos (3). En los últimos años en las regiones de Centro y Sur América, en vista de la escasa documentación existente (3), se ha fortalecido el estudio y la investigación de las rickettsiosis, siendo éstas parte de las enfermedades zoonóticas de tipo emergente y reemergente (4). En Colombia, no se han presentado reportes continuos sobre las enfermedades rickettsiales que permitan conocer su comportamiento epidemiológico, con el fin de implementar planes de monitoreo y control. Los pocos registros existentes mencionan que en 1935 en el Valle de Tobia, lo que hoy en día pertenece al 8

9 municipio de Nimaima, Cundinamarca, en cercanías del municipio de Villeta, se reportó un brote de una enfermedad febril, con una relación de caso-fatalidad de 95% que se denominó Fiebre de Tobia (5). La enfermedad fue descrita como un conjunto de signos y síntomas clínicos caracterizados por la presencia de fiebre, exantema generalizado y deterioro clínico acelerado (5).Por el comportamiento en animales de experimentación y el aislamiento del microorganismo, se determinó que era una enfermedad similar a la Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas de Norteamérica, cuyo agente etiológico es Rickettsia rickettsii (6). Durante un periodo de alrededor de años, no se tuvo conocimiento sobre las rickettsiosis en Colombia, aunque en los libros de trabajo que se encuentran en el Instituto Nacional de Salud se describen reportes de otro brote en la zona del Valle de Suratá, Santander en 1946 (3). Entre 2003 y 2004 se reportaron dos nuevos casos que provenían de la zona rural del municipio de Villeta y el corregimiento de Tobia, Cundinamarca con enfermedad febril y características clínicas y epidemiológicas compatibles con Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas, los cuales terminaron en la muerte de los pacientes, identificándose a Rickettsia rickettsii como el agente etiológico mediante técnicas de biología molecular (7). Dados los antecedentes mencionados, ha surgido la necesidad de realizar un estudio en el que se identifiquen las garrapatas que son vectores de este tipo de enfermedades y cuáles su distribución en los diferentes nichos ecológicos; ya que en la última década, se han realizado estudios que demuestran la relación existente entre la biología de algunos vectores, la dinámica del paisaje y cómo esta dinámica puede determinar la propagación de las enfermedades infecciosas y su transmisión a humanos (8). Debido al papel de los caninos como animales de compañía para el ser humano, los cuales además son importantes hospederos de ectoparásitos como las garrapatas y por ende potenciales transmisores de agentes zoonóticos, se establece la necesidad de realizar una determinación de la presencia de bacterias del género Rickettsia mediante la amplificación del gen glta, conservado en este género, en garrapatas recolectadas de caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca, y cuáles especies de garrapatas podrían estar implicadas como vectores del género en ésta zona que ha sido clasificada como endémica para la rickettsiosis (5,7). 9

10 3. MARCO TEÓRICO 3.1. Rickettsia Los microorganismos del género Rickettsia son α-proteobacterias, Gram negativas altamente especializadas, intracelulares obligadas con preferencia por células endoteliales, donde viven libremente en el citosol o de forma menos frecuente en el núcleo, como es el caso de las especies que pertenecen al Grupo de las Fiebres Manchadas (9). Una clasificación moderna, basada en un completo análisis del genoma, divide las especies del género Rickettsia en cuatro grupos: Grupo de las Fiebres Manchadas (Rickettsia rickettsii, R. conorii, R. parkeri, entre otras), Grupo tifus (R. prowazekii y R. typhi), Grupo Ancestral (R. bellii y R. canadensis) sin patogenicidad conocida, y grupo transicional (R. akari, R. australis y R. felis) (10,11). El Grupo de las Fiebres Manchadas se denomina de esta manera debido a la presentación clínica de las enfermedades que provoca (estado febril agudo, exantema generalizado y otros síntomas inespecíficos), aunque cabe resaltar que algunas bacterias pertenecientes al grupo del tifus presentan cuadros clínicos similares (3). Las especies pertenecientes al Grupo de las Fiebres Manchadas, característicamente son transmitidas por garrapatas (10) Garrapatas (Ixodidae) como vectores de las rickettsiosis Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados que necesitan para su supervivencia la presencia de un hospedero, que les brinde las condiciones adecuadas para su alimentación, reproducción y ciclo de vida (12),presentan fases de vida libre y sobre hospedero, parasitando mamíferos, aves, reptiles y en ocasiones también anfibios (13).Se caracterizan por tener un tamaño corporal relativamente grande en comparación con otros ácaros de la subclase Acari; ingerir grandes cantidades de sangre, linfa o tejidos digeridos; por tener una alta capacidad de muda regulada por la ingesta de sangre; y por poner un gran número de huevos (entre 200 y 23,000 según la especie) (12). Cuando las garrapatas se alimentan pueden transmitir microorganismos patógenos a sus hospederos, algunos de los cuales pueden generar enfermedades que son zoonóticas (12). Las garrapatas implicadas en la transmisión de rickettsias del Grupo de las Fiebres Manchadas pertenecen a la familia Ixodidae (13), su tamaño varía entre los 2mm y 30mm, dependiendo de la especie, estadío, sexo y estado de alimentación (12). Típicamente tienen 3 estadíos de desarrollo: larva, de seis 10

11 patas, ninfa, de ocho patas, y adulto sexualmente maduro, también de ocho patas. En algunas especies de Ixodidae el ciclo de vida se puede completar en dos o más años, durante los cuales hacen una sola ingesta de sangre en cada estadío, generalmente, en un huésped vertebrado diferente cada vez, antes de la metamorfosis al siguiente estadío (12). En Europa, se han reportado infecciones por diferentes especies de Rickettsia en vectores como Ixodes ricinus, Dermacentor marginatus, Dermacentor reticulatus, Rhipicephalus sanguineus, entre otros, reportándose a Rickettsia conorii como la especie más encontrada en los diferentes vectores(14,15).r. sanguineus, conocida también como la garrapata marrón del perro, se adapta bien a la vegetación mediterránea y a las condiciones climáticas y por tanto es endémica en el área, pero está ausente en el norte de Europa, excepto en los hogares, donde las condiciones le permiten sobrevivir (15). En América, a pesar de que A. cajennense es reconocido como el principal vector de R. rickettsii(16), en otros países como Estados Unidos, México y Brasil también se describe a R. sanguineus como un importante vector de R. rickettsii, además, esta especie de garrapata es el principal vector asociado a la enfermedad generada por ésta bacteria en caninos (16).Adicionalmente, cabe resaltar que se han encontrado otras garrapatas parasitando caninos como son Amblyomma cajennense y Amblyomma ovale, en donde en ésta última se ha reportado la presencia de especies de Rickettsia del Grupo de las Fiebres Manchadas (17,18). En Colombia la documentación existente sobre la población de garrapatas es escasa; en 1940, Osorno describe la distribución de algunas garrapatas, entre las cuales, Rhipicephalus sanguineus se encontró en Bogotá en un perro doméstico que según se dijo nunca había salido de ésta ciudad, además de encontrar algunos especímenes en vida libre en algunas casas de Barranquilla y Magangué (19). Además, Amblyomma cajennense fue encontrada en múltiples mamíferos como caninos, equinos y humanos en Villeta, Cundinamarca y se describe como una garrapata de amplia distribución (19). Por otra parte, Acero y colaboradores en 2011 describen algunas garrapatas prevalentes en caninos no migrantes en la zona noroccidente de Bogotá, evidenciando la presencia de garrapatas Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus (Boophilus) microplus y Amblyomma maculatum en una población de 799 caninos estudiados (20). Con respecto a especies de Rickettsia infectando garrapatas en Colombia, Miranda y colaboradores en 2012 reportaron la presencia de bacterias de éste género en garrapatas Amblyomma spp y Rhipicephalus microplus parasitando iguanas en el departamento de Córdoba, además del hallazgo de una nueva especie candidata de Rickettsia (21), por su parte Quintero y colaboradores en 11

12 una publicación anticipada en línea reportan el hallazgo del gen glta en larvas del género Amblyomma spp a partir de roedores capturados en el noroccidente antioqueño y en un área limítrofe de Córdoba (22) Biología molecular del género Rickettsia Los organismos rickettsiales tienen genomas relativamente pequeños (1,1 a 1,3Mb) que han surgido a través de una evolución reductiva a medida que las bacterias iban desarrollando dependencia de las células hospederas para sus funciones vitales. Los genes rompa y rompb codifican para las proteínas de membrana externa, por su parte, el gen glta, es un gen que codifica para la citrato sintasa y su importancia radica en que es un gen que se conserva en la totalidad de especies del género Rickettsia (23,24). En la actualidad, en varios estudios se ha reportado la amplificación de estos genes y la secuenciación de los mismos como métodos de elección para la identificación de especies de Rickettsia (4,25) 4. OBJETIVOS: 4.1. OBJETIVO GENERAL Detectar el gen glta del género Rickettsia, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Recolectar garrapatas a partir de la población de caninos en la zona rural y en la cabecera municipal de Villeta, Cundinamarca Clasificar taxonómicamente género y especie, y determinar el estadío de desarrollo de las garrapatas recolectadas en los caninos del Municipio de Villeta, Cundinamarca. Evaluar mediante PCR convencional la presencia del gen glta en las garrapatas obtenidas de los caninos muestreados en el municipio de Villeta, Cundinamarca. 5. METODOLOGÍA 5.1. Zona y población de muestreo En conjunto con la Unidad de desarrollo para el campo del municipio de Villeta se realizaron jornadas de desparasitación de los caninos en las 22 veredas y en la cabecera municipal para un total de 23 zonas de muestreo, con el fin de que los 12

13 propietarios los llevaran a las jornadas y fueran incluidos en el estudio. El muestreo realizado en el presente estudio, corresponde a un muestreo por conveniencia, ya que fueron utilizados en él, únicamente los caninos que se encontraban a disposición el día en el que se realizó la jornada de desparasitación en cada vereda Recolección de garrapatas Con apoyo del laboratorio de parasitología veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia se recolectaron, conservaron y transportaron las garrapatas en etanol al 70% a Bogotá. Para la recolección, se retiraron con pinzas las garrapatas de cada animal, tomando cada espécimen desde el hipostoma. Se tuvieron en cuenta, las garrapatas encontradas en la totalidad del cuerpo, iniciando por la cabeza, orejas, lomo, vientre, zona inguinal, patas y la zona interdigital. Además se realizó una encuesta donde se registraron los datos de identificación del animal dentro del estudio y el número de garrapatas encontradas en cada uno Clasificación taxonómica de las garrapatas Las garrapatas recolectadas fueron identificadas en el Laboratorio de Parasitología Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia, agrupándolas por estadío de desarrollo, animal del que fue extraída y vereda a la que pertenece. Posteriormente se clasificaron taxonómicamente utilizando las claves pertinentes para llegara género y especie (26) (Anexo 1) Extracción de ADN a partir de los vectores recolectados En la preparación de las muestras, cada garrapata se cortó por la mitad a través del eje longitudinal del cuerpo en la cabina de flujo laminar. Una mitad se conservó se congeló a -80 C para ser utilizada como control en caso de problemas de contaminación o tener que repetir algún procedimiento. La otra mitad se utilizó para el procedimiento de extracción y posterior evaluación de la presencia del gen glta. Los artrópodos del mismo estadío de desarrollo, misma especie y ubicación geográfica se reunieron en grupos de máximo seis donde debían ser todas retiradas del mismo animal para el análisis por PCR, las hembras se procesaron de forma individual. Para el proceso de extracción, cada grupo se colocó en recipientes plásticos que fueron introducidos en un baño termostático a una temperatura de 78 C con el fin de asegurar la eliminación del etanol en el que fueron conservadas las garrapatas ya que este puede ser un inhibidor de la PCR. Al sacar los grupos del baño 13

14 termostático, las garrapatas se introdujeron en un tubo de 2 ml estéril y se agregaron 40 µl de PBS 1X para posteriormente ser maceradas en este tubo. La extracción de ADN se realizó utilizando el estuche comercial DNeasy Blood & Tissue Kit de Qiagen siguiendo las instrucciones de la casa comercial con una modificación en la que se adicionaron 400 µl de DNAzol antes de comenzar el procedimiento; esta modificación se realizó ya que éste reactivo contiene un detergente que hidroliza el ARN y es selectivo para la obtención de ADN. El producto extraído se cuantificó en un Nanodrop para observar la calidad y la cantidad del ADN y finalmente se conservó de forma individual en tubos de 2 ml estériles debidamente identificados y se congeló a-20 C para luego ser amplificado mediante la técnica de PCR Detección molecular del género Rickettsia Antes de iniciar la detección molecular de Rickettsia se corrió una PCR para el gen 16S rrna de garrapata con el protocolo descrito anteriormente por Mangold y colaboradores (27) (Anexo 2), este procedimiento se hizo como control para garantizar que no había inhibidores de la PCR. Posteriormente el ADN de los grupos de garrapatas se utilizó para la amplificación de un fragmento de 401 pb del gen glta, el cual se encuentra en todas las rickettsias conocidas (10). Para esto, se siguió el protocolo descrito por Labruna y colaboradores. (4) (Anexo 3) y se utilizaron los iniciadores CS-78 y CS-323. Los productos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con Sybr-safe. Se incluyeron marcador de peso molecular Zymmo, controles positivos (ADN puro de Rickettsia rickettsii) y controles negativos (Agua) en todos los experimentos Análisis estadístico Para el análisis estadístico de los resultados, se utilizaron herramientas de estadística descriptiva, tomando como base medidas de frecuencia y realizando cálculos de proporciones. 6. RESULTADOS 6.1. Recolección de garrapatas De las 23 zonas de muestreo, se revisaron 131 caninos, de los cuales 41 presentaron garrapatas (31,29%), incluyendo en el estudio las garrapatas 14

15 encontradas en un canino ( Perro 7 ) del cual no se conoce la zona de procedencia. Se recolectó un total de300 garrapatas (Tabla 1). Tabla 1. Número de garrapatas y perros muestreados por vereda en el municipio de Villeta (Cundinamarca). Vereda Número de perros Número de garrapatas Chapaima 6 4 La Bolsa 2 0 Chorrillo 8 0 Payandé 4 0 Mave 9 2 Alto de Torres 6 0 Salitre Blanco 12 2 Naranjal 4 3 Salitre Negro 1 0 Alto de Paja 5 40 Mani 4 6 La Mazata 3 4 Cune 5 3 Río Dulce 4 12 Balsal 2 7 El Puente 7 69 Bagazal La Esmeralda 5 0 San Isidro 3 0 Potrero Grande 4 0 Quebrada Honda 4 0 Cabecera Municipal Ilo Grande 6 4 NO DATO - Perro TOTAL Clasificación taxonómica de las garrapatas Siguiendo un patrón numérico, fue asignado un código respectivo a las garrapatas recolectadas teniendo en cuenta la zona donde fueron encontradas y su animal hospedero; posteriormente se clasificaron utilizando claves taxonómicas obteniéndose como resultado 95% (n=285) Rhipicephalus sanguineus; 2,3%(n=7) 15

16 Amblyomma cajennense; 1,3% (n=4) Amblyomma ovale; 1% (n=3) Dermacentor nitens y 0,3% (n=1) Rhipicephalus microplus (Gráfica 1) (Anexo 4). Proporción de garrapatas recolectadas en caninos de Villeta Rhipicephalus sanguineus Amblyomma cajennense Amblyomma ovale Dermacentor nitens Rhipicephalus microplus Gráfica 1. Proporción de garrapatas recolectadas en los caninos del municipio de Villeta (Cundinamarca) 6.3. Extracción de ADN y detección molecular de Rickettsia A partir de las 300 garrapatas recolectadas de los caninos, se obtuvieron 177 grupos a los cuales se les realizó PCR para el gen 16S rrna de garrapata, encontrando 158 grupos positivos y 19 grupos negativos. (Imagen 1) C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 C 10 C 11 C 12 C 13 C 14 C 15 C 16 C 17 C 18 C 19 C 20 Imagen 1. Gel de agarosa, luego de llevar a cabo la electroforesis de la PCR para el gen 16S rrna de garrapata. En el carril 1 (C 1 ) se puede observar el marcador de peso molecular, en los carriles 19 y 20 (C 19 y C 20 ) se encuentran el control de extracción y el control negativo respectivamente. La muestra del carril 4 (C 4 ) es negativa. Posteriormente se realizó PCR para el gen glta de los 158grupos positivos para el gen 16S rrna de garrapata ya que se confirmó que no presentaban inhibidores de la PCR (Imagen 2). 16

17 C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 C 10 C 11 C 12 C 13 C 14 C 15 Imagen 2. Gel de agarosa, luego de llevar a cabo la electroforesis de la PCR para el gen glta. En el carril 1 (C 1 ) se observa el marcador de peso molecular, en el carril 2 (C 2 ) se ve el control positivo, en el carril 15 (C 15 ) se sembró el control negativo (agua), el carril 14 (C 14 ) contiene una muestra positiva. El resto de los carriles contenían muestras negativas En total, para el gen glta se obtuvieron 3 grupos (1,9%) positivos de muestras correspondientes a garrapatas de las especies Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense y Dermacentor nitens 7. DISCUSIÓN En el presente estudio se detectó la presencia del gen glta conservado en bacterias del género Rickettsia spp. en 3 grupos de garrapatas: Amblyomma cajennense, Rhipicephalus sanguineus y Dermacentor nitens, recolectadas de caninos del municipio de Villeta, Cundinamarca. La seroreactividad contra Rickettsia spp. en muestras de suero de caninos, al igual que la presencia del gen glta en garrapatas extraídas de los mismos ha sido anteriormente reportada en diferentes zonas endémicas del mundo en países como Brasil, Colombia, Francia, entre otros (7, 28-30, 37). Los caninos podrían ser reservorios potenciales de infecciones rickettsiales (31), lo que quiere decir que si un canino se infecta con Rickettsia spp al ser mordido por una garrapata; éste podría transmitirlo a una garrapata no infectada generando riesgo de propagación; aunque cabe resaltar que esto sólo ha sido reportado en estudios experimentales bajo condiciones de laboratorio (31,32). Piranda y colaboradores en 2011 realizaron un estudio en donde expusieron algunos caninos a infección experimental con Rickettsia rickettsii y luego, bajo observación permitieron que garrapatas del género Rhipicephalus sanguineus se alimentaran de ellos. Posteriormente por medio de técnicas moleculares, observaron que las garrapatas que se alimentaron de los caninos, adquirieron la infección y además la transmitieron de forma horizontal a un hospedero susceptible (cobayos), a su vez, se observó transmisión transovárica (transmisión a la progenie) en huevos de hembras que se infectaron siendo ninfas alimentándose de los caninos (32). 17

18 Los caninos juegan un papel importante en la epidemiología de las rickettsiosis por ser animales de compañía, principalmente considerando los resultados serológicos positivos en zonas con altos niveles de infecciones por bacterias del género Rickettsia (31). Otro de los factores que resaltan la importancia de estos animales, es la seroreactividad durante largos periodos de tiempo, ya que un canino seroreactivo, indica la circulación de alguna especie de Rickettsia en un área determinada, durante al menos 6 a 12 meses (33). Adicionalmente se considera probable, que la aparición de Rickettsia spp. en un hospedero canino, representa un riesgo de contagio para los seres humanos que residen en el mismo lugar, y se documentan reportes concurrentes de Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas en caninos y sus dueños (34).Dantas-Torres y colaboradores en su revisión de 2012 mencionan un reporte de un caso de Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas en caninos y su dueño en Estados Unidos, en este caso, los dos caninos presentaron signos como fiebre, petequias, palidez en las mucosas e incapacidad para mantenerse de pie, fueron llevados al veterinario y sometidos a varios tratamientos, entre los cuales se incluyó doxiciclina y finalmente se recuperaron; dos semanas después el propietario de los caninos acudió a una clínica con historia de 2 días de síntomas similares y fue tratado para un diagnóstico errado para finalmente terminar en la muerte 3 días después. Uno de los perros, presentó un alto nivel de anticuerpos anti Rickettsia rickettsii lo que sugiere que sufrieron de Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas (34). En Colombia, Hidalgo y colaboradores en 2007 describieron dos casos de muerte en pacientes que presentaron síntomas como dolor abdominal, dolor de cabeza y fiebre, en Villeta, Cundinamarca; ambos casos terminaron en la muerte, en uno de ellos se documentó que dos caninos pertenecientes al paciente habían muerto algunos días antes con signos similares; mientras un tercer canino se recuperó rápidamente tras ser tratado con doxiciclina. Posteriormente se evidenció mediante ensayo de inmunofluorescencia indirecta, análisis inmunohistoquímico y el aislamiento del microorganismo, que la causa de la muerte de los humanos fue Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas y se encontró una homología del 100% con Rickettsia rickettsii como agente etiológico (7). Estos estudios resaltan la importancia de la interacción entre los médicos clínicos humanos y veterinarios y resaltan cómo ellos podrían beneficiarse a través de diagnósticos acertados; además se evidencia la necesidad que existe de tratar la Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas como una enfermedad de diagnóstico diferencial en los casos de cuadros febriles (7,34). En el 2008, Pinter y colaboradores reportaron que algunas especies de garrapatas como Amblyomma aureólateme en Brasil prefieren hábitats húmedos en las zonas rurales como algunas selvas, y explican que algunos caninos que tienen desplazamientos a zonas silvestres, pueden llevar las garrapatas del interior de la 18

19 selva hasta el ambiente de los humanos, lo que podría suponer un aumento en el riesgo de infección por especies de rickettsias en humanos que residen en las áreas donde A. aureólateme es el vector principal (35). En el presente estudio, 15 de los caninos muestreados (11,45%) pertenecían a la zona urbana del municipio de Villeta, mientras el 88,55% restante se distribuía en diferentes zonas rurales. Los caninos son el principal hospedero dentro del ciclo de vida de Rhipicephalus sanguineus, también conocida como la garrapata marrón del perro (36). Es la más distribuida a nivel mundial y es además vector de varios patógenos de humanos y animales (37). Es una garrapata de 3 hospederos, lo que significa que en cada estadío de vida requiere un nuevo hospedero para alimentarse (36); puede ser un reservorio en el que se presenta transmisión transovárica o transestadial (transmisión a través de los estadío de vida). Ocasionalmente puede parasitar otros hospederos incluyendo a los humanos, que no pertenecen a su cadena trófica natural, lo que indica que esta garrapata es capaz de adoptar diferentes estrategias de supervivencia según sea necesario (36). Adicionalmente, es una garrapata endofílica, (definido como el hábito de reposar en construcciones hechas por humanos durante al menos una parte del ciclo gonadotrófico) (38) lo que aumenta el riesgo de transmisión de zoonosis (36). Bermúdez y colaboradores en 2011 encontraron que un 87,7% de las garrapatas extraídas a partir de caninos en El Valle de Antón, Coclé, Panamá, resultaron pertenecer a la especie Rhipicephalus sanguineus (39).Del mismo modo, Melo y colaboradores en el mismo año reportaron que el 76,1% de las garrapatas recolectadas en caninos de la municipalidad de Poconé, en el estado de Mato Grosso, Brasil, pertenecían a garrapatas de ésta especie (17). Éstos resultados se relacionan con lo reportado en el presente estudio donde Rhipicephalus sanguineus fue la garrapata encontrada en mayor proporción (95%) Amblyomma cajennense es el principal vector de la Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas en Suramérica (4,17) causada por Rickettsia rickettsii; el hospedero principal de ésta garrapata es el caballo (17), aunque es capaz de parasitar otros hospederos incluyendo el humano. A pesar de esto, se han realizado reportes de garrapatas de esta especie parasitando caninos, como el caso de Melo y colaboradores quienes reportaron que el 22,5% de las garrapatas encontradas en perros pertenecían a la especie A. cajennense; aunque en la zona urbana se encontró esta especie tan sólo en un canino (0,6%); para el presente estudio la proporción encontrada de este vector fue del 2,3% Por otra parte, garrapatas del género Amblyomma ovale han sido reportadas anteriormente parasitando caninos en Suramérica, Bermúdez y colaboradores en 19

20 2011 reportaron que el 6,1% de las garrapatas recolectadas a partir de caninos en Panamá fueron A. ovale, así como Melo y colaboradores documentaron que el 1,4% de las garrapatas encontradas en su estudio en Brasil fueron adultos de éste género (17), lo que se relaciona con lo encontrado en este estudio correspondiente al 1,3% de proporción. Los caninos, no son hospederos habituales de garrapatas de los géneros Dermacentor nitens y Rhipicephalus (Boophilus) microplus, como sí lo son bovinos y equinos respectivamente, sin embargo dentro del estudio se encontró una proporción del 1 y 0,3% respectivamente, esto debido probablemente a que la población de garrapatas que se encontraba era bastante amplia y no habían suficientes hospederos para parasitar. Adicionalmente, es posible que estos hallazgos se relacionen con altas tasas de infestación de éstas especies, en praderas que comparten los caninos con los hospederos habituales. Dado lo anterior, es importante tener en cuenta, con respecto al riesgo de infección de humanos y a las garrapatas encontradas en este estudio, que mientras A. cajennense es una garrapata que normalmente se ha encontrado parasitando humanos, D. nitens y R. sanguineus han sido reportadas sólo como parásitos ocasionales de los mismos (39), y aunque A. cajennense no fue la garrapata encontrada en mayor proporción en este estudio, el riesgo de infección existe. Por otra parte, se han realizado estudios alrededor del mundo en los que se reporta infección por bacterias del género Rickettsia spp. en garrapatas; tan sólo en Latinoamérica y el Caribe, se han documentado 13 especies de Rickettsia, siendo Rickettsia felis, R. prowazekii y R. rickettsii las reportadas con mayor frecuencia (16). Adicionalmente se han encontrado reportes de Rickettsia spp. en diferentes lugares del mundo como en Portugal donde Milhano y colaboradores en 2010 reportaron un 55,1% de infección de Rickettsia spp. en garrapatas de las especies Dermacentor marginatus, R. sanguineus e Ixodes ricinus recolectadas en un parque safari; y Francia donde Marié y colaboradores en 2012 documentan la infección de Rickettsia spp. en garrapatas R. sanguineus recolectadas de un erizo (31, 37,40). Bermúdez y colaboradores (2011), documentaron infección con bacterias del género Rickettsia en 7 garrapatas a partir de 65 examinadas(10,8%) en caninos, todas pertenecientes a la especie Rhipicephalus sanguineus, en el mismo estudio, se reporta la presencia de Rickettsia spp. en garrapatas de las especies Amblyomma cajennense y Dermacentor nitens en una proporción del 36,7% y 27,4% respectivamente, aunque cabe aclarar que estas garrapatas fueron 20

21 recolectadas en equinos y la especie de Rickettsia implicada en el estudio fue R. amblyommi, que es una especie de baja patogenicidad y es posible que a esto se deba la alta proporción de infección. De la misma forma, Milagres y colaboradores en el año 2010 reportaron que de 646 muestras de ectoparásitos obtenidas en la región este de Minas Gerais en Brasil, entre garrapatas y pulgas, tan sólo 8 (1,2%) resultaron ser positivos para el gen glta, que sugiere la presencia de especies de Rickettsia, los resultados obtenidos en estos reportes coinciden parcialmente con lo encontrado en el presente estudio donde el 1,9% de los grupos obtenidos se encontraron positivos para el gen glta presente en todas las especies de Rickettsia spp. conocidas. Aunque se han reportado casos de alta prevalencia de Rickettsia spp. en animales silvestres o garrapatas capturadas en vida libre en Europa en los que la proporción de infección por Rickettsia spp. es alta como en Portugal, donde Milhano y colaboradores reportan un 55,1% de muestras positivas para ADN rickettsial en un parque Safari (40), los estudios realizados en animales domésticos en América, han reportado que la tasa de infección de Rickettsia rickettsii (especie cuya distribución se limita a éste continente) en garrapatas Amblyomma aureolatum y Dermacentor spp. recolectadas a partir de caninos en áreas endémicas es <1% (41,42), lo cual es similar a los datos obtenidos en el presente estudio. La baja proporción de la presencia del género Rickettsia en garrapatas ha sido explicada por algunos autores; Labruna y colaboradores en 2011 sugieren que a pesar de reportar garrapatas como Amblyomma aureolatum como susceptibles a la infección de Rickettsia rickettsii y además ser altamente eficientes en la transmisión transestadial y transovárica, la misma infección genera un efecto perjudicial en las garrapatas, lo que desata una mayor tasa de mortalidad y una disminución en el rendimiento reproductivo de las hembras infectadas (42).Estas razones pueden contribuir ampliamente a las bajas tasas de infección que se presentan entre las poblaciones de garrapatas en áreas endémicas, dichas tasas se ven contrastadas debido a la presencia de posibles hospederos amplificadores que contribuyen al mantenimiento de la infección. Adicionalmente, con base en esto, parece poco probable que éstas garrapatas puedan sostener una infección a lo largo de múltiples generaciones sucesivas, basándose únicamente en la transmisión vertical (transovárica) y la transestadial ya que el número de garrapatas infectadas va disminuyendo gradualmente después de cada generación; por lo cual la transmisión horizontal con la participación de hospederos vertebrados como los caninos parece crucial para el mantenimiento de la infección en las áreas endémicas (42). 21

22 8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Se recolectaron garrapatas de las especies Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense, Amblyomma ovale, Dermacentor nitens y Rhipicephalus microplus en los caninos estudiados en el municipio de Villeta, Cundinamarca, con la formación de un total de 177 grupos, de las cuales tres (1,9%), correspondientes a las especies R. sanguineus, A. cajennense y D. nitens evidenciaron la presencia del gen glta por medio de PCR convencional. Estos resultados sugieren la presencia de bacterias del género Rickettsia en la zona del estudio. Es necesario continuar con la aplicación de técnicas moleculares con el fin de amplificar genes más conservados para el género Rickettsia como rompa y rompb, su consecuente secuenciación y el uso de herramientas como el BLAST para determinar homología de secuencias con las ya reportadas, logrando así, la identificación de especies de Rickettsia presentes en las garrapatas y por ende circulantes en la zona de estudio. 9. BIBLIOGRAFÍA 1) Vega, R. L. Emerging and reemerging zoonoses and basic principles for zoonoses control. Rev. Med. Vet n.17. p ) Walker, D.H. Rickettsioses of the spotted fever group around the world. J Dermatol Jun; 16(3): ) Hidalgo, M. Rickettsiosis y Ehrlichiosis en Colombia, una aproximación al problema y a la solución. Tesis de Doctorado. Mayo de Doctorado en Ciencias-Biología. 240 Páginas. 4) Labruna, M. Whitworth, T. Horta, M. Bouyer, D. McBride, J. Pinter, A. Popov, V. Gennari, S. Walker, D. Rickettsia species infecting Amblyomma cooperi ticks from an Area in the state of Sao Paulo, Brazil, where brazilian spotted fever is endemic. Journal of clinical microbiology, 2004, Vol 42, No.1. p ) Patiño, L., A. Afanador, A spotted fever in Tobia, Colombia Biomedica (2): ) Labruna, M. Arrieta, G. Máttar, S. Distribución de Rickettsia rickettsii en las Américas: un patógeno letal VI Encuentro nacional de investigación en enfermedades infecciosas. Asociación colombiana de infectología Vol. 12 S1, ) Hidalgo, M. Orejuela, L. Fuya, P. Carrillo, P. Hernandez, J. Parra, E. Keng, C. Small, M. Olano, J. Bouyer, D. Castañeda, E. Walker, D. 22

23 Valbuena, G. Rocky Mountain Spotted Fever, Colombia. Emerging Infectious Diseases Vol. 13, No. 7: ) Randolph, S. E. Ticks and tick-borne disease systems in space and from space.advparasitol : ) Walker, D. H. Rickettsiae and rickettsial infections: the current state of knowledge. Clin Infect Dis Suppl 1: S ) Raoult, D. Parola, P. Rickettsial diseases. Primera edición. Editorial Informa. New York London p. 11) Mansueto, P. Vitale, G. Cascio, A. Seidita, A. Pepe, I. Carroccio, A. di Rosa, S. Battista, G. Cillari, E. Walker, D. New insight into immunity and immunopathology of Rickettsial diseases. Clinical and Developmental Immunology. 2012; ) Anderson, J. The natural history of ticks. Med Clin North Am (2): ) Szabo, M. Castro, M. Ramos, H. García, M. Castagnolli, K. Pinter, A. Veronez, V. Magalhaes,G. Duarte, J. Labruna, M. Species diversity and seasonality of free-living ticks (Acari: Ixodidae) in the natural habitat of wild Marsh deer (Blastocerus dichotomus) in Southeastern Brazil. Vet Parasitol (2): ) Parola, P. Davoust, B. Raoult, D. Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses. Vet. Res ) Parola, P. Raoult, D. Ticks and Tickborne Bacterial Diseases in Humans: An Emerging Infectious Threat. Clinical Infectious Diseases : ) Labruna, M. Mattar, S. Nava, S. Bermudez, S. Venzal, J. Dolz, G. Abarca, K. Romero, L. de Sousa, R. Oteo, J. Castro, J. Rickettsioses in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal. Rev.MVZ Córdoba (2): ) Melo, A. Martins, T. Horta, M. Moraes, J. Pacheco, R. Labruna, M. Aguiar, D. Seroprevalence and risk factors to Ehrlichia spp. and Rickettsia spp. in dogs from the Pantanal Region of Mato Grosso State, Brazil. Ticks and Tick-borne Diseases 2 (2011) ) Barbieri, A. Szabó, M. Nieri, F. Souza, J. Labruna, M. Detection of a spotted fever group rickettsia in Amblyomma ovale (Acari: Ixodidae) from Blumenau, southern Brazil. Biomédica (Supl): ) Osorno, E. Las garrapatas de la República de Colombia. Biomédica 2006;26: ) Acero, E. Calixto, O. Prieto, A. Garrapatas (Acari: Ixodidae) prevalentes en caninos no migrantes del noroccidente de Bogotá, Colombia. NOVA Publicación científica en ciencias biomédicas ISSN: Año. Vol 9. No. 15. Pg:

24 21) Miranda, J. Portillo, A. Oteo, J. Mattar, S. Rickettsia sp. strain colombianensis (Rickettsiales: Rickettsiaceae): A new proposed Rickettsia detected in Amblyomma dissimile (Acari: Ixodidae) from iguanas and free-living larvae ticks from vegetation. J. Med. Entomol (4): ) Quintero, J. Londoño, A. Díaz, F. Agudelo, P. Arboleda, M. Rodas, J. Ecoepidemiología de la infección por rickettsias en roedores, ectoparásitos y humanos en el noroeste de Antioquia, Colombia. Biomédica. 2013; 33(Supl.1). 23) Pontier, D. Guiserix, M. Fouchet, D. Sauvage, F. Gonzalez, J. Emergence of infectious diseases: when hidden pathogens break out. C R Biol (6): ) Roux, V. Drancourt, M. Raoult, D. Determination of genome sizes of Rickettsia spp. within the spotted fever group, using pulsed-field gel electrophoresis. J Bacteriol (22): ) Santibáñez, S. Portillo, A. Santibáñez, P. Palomar, A. Oteo, J. Usefulness of rickettsial PCR assays for the molecular diagnosis of human rickettsioses. Enferm Infecc Microbiol Clin Article in press : Consulta: 26) Krantz, G. Walter, D. A manual of Acarology. 3th Ed. Lubbock: Texas University Press p. 98, ) Mangold, A.J, Bargues, M.D., Mas-Coma, S. Mithocondrial 16S rdna sequences and phylogenetic relationship of species of Rhipicephalus and other tick genera among Metastriata (Acari: Ixodidae). Parasitol Res (1998) 84: ) Hidalgo, M. Vesga, J. Lizarazo, D. Valbuena, G. Short report: A survey of antibodies against Rickettsia rickettsii and Ehrlichia chaffeensis in domestic animals from a rural area of Colombia. Am. J. Trop. Med. Hyg., 80(6), 2009, pp ) Labruna, M. Kamakura, O. Moraes, J. Horta, M. Pacheco, R. Rocky Mountain Spotted Fever in Dogs, Brazil. Emerging Infectious Diseases Vol.15, No ) Milagres, B. Padilha, A. Marcelos, R. Gomes, G. Montandon, C. Pena, D. Nieri, F. Silveira, I. Pacheco, R. Labruna, M. Bouyer, D. Freitas, R. Walker, D. Mafra, C. Galvao, M. Rickettsia in synanthropic and domestic animals and their hosts from two areas of low endemicity for brazilian spotted fever in the eastern region of Minas Gerais, Brazil. Am. J. Trop. Med. Hyg., (6), pp ) Alexandre, N. Santos, A. Bacellar, F. Boinas, F. Núncio, M. de Sousa, R. Dectection of Rickettsia conorii strains in Portuguese dogs (Canis familiaris). Ticks and Tick-borne Diseases. 2 (2011)

25 32) Piranda, E. Faccini, J. Pinter, A. Pacheco, R. Cançado, P. Labruna, M. Experimental infection of Rhipicephalus sanguineus ticks with the bacterium Rickettsia rickettsii, using experimentally infected dogs. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011; 11(1): ) Piranda, E. Faccini, J. Pinter, A. Baito, T. Pacheco, R. Hagiwara, M. Labruna, M. Experimental infection of dogs with a Brazilian strain of Rickettsia rickettsii: clinical and laboratory findings. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 103(7): ) Dantas-Torres, F. Chomel, B. Otranto, D. Ticks and tick-borne diseases: A One Health perspective. Article in Press. Trends in parasitology ) Pinter, A. Horta, M. Pacheco, R. Moraes, J. Labruna, M. Serosurvey of Rickettsia spp. in dogs and humans from an endemic area for Brazilian spotted fever in the state of Sao Paulo, Brazil. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, (2): ) Dantas-Torres, F. Biology and ecology of the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus. Dantas-Torres Parasites & Vectors 2010, 3:26. Pag: ) Marié, J. Davoust, B. Socolovschi, C. Raoult, D. Parola, P. Molecular detection of rickettsial agents in ticks and fleas collected from an European hedgehog (Erinaceus europaeus) in Marseilles, France. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases ) Pardo, R. Cabrera, O. Becerra, J. Fuya, P. Ferro, C. Lutzomyia longiflocosa, posible vector en un foco de leishmaniasis cutánea en la región sub andina del departamento del Tolima, Colombia, y el conocimiento que tiene la población sobre este insecto. Biomedica 2006; 26(Supl.1): ) Bermúdez, S. Zaldívar, A. Spolidorio, M. Moraes, J. Miranda, R. Caballero, C. Mendoza, Y. Labruna, M. Rickettsial infection in domestic mammals and their ectoparasites in El Valle de Antón, Coclé, Panamá. Veterinary Parasitology ) Milhano, N. Lopes, I. Alves, A. Arroube, S. Soares, J. Rodríguez, P. Carolino, M. Núncio, M. Piesman, J. de Sousa, R. Coinfections of Rickettsia slovaca and Rickettsia helvetica with Borrelia lusitaniae in ticks collected in a Safari Park in Portugal. Ticks and Tick-borne Diseases ) Pinter, A. Labruna, M. Isolation of Rickettsia rickettsii and Rickettsia bellii in cell culture from the tick Amblyomma aureolatum in Brazil. Ann. N.Y. Acad. Sci :

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27 10. ANEXOS Anexo 1: Clasificación taxonómica de las garrapatas CLAVE PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS ESTADÍOS DE GARRAPATAS 1) Presentan seis patas. Larvas Presentan ocho patas 2 2) Orificio genital ausente. Escudo en la parte anterior do idiossoma. Basis capitulum sin áreas porosas Ninfas Orificio genital presente 3 3) Escudo en la parte anterior do idiossoma. Basis capitulum con áreas porosas. Adulto (Hembras) Escudo en toda la cara dorsal do idiossoma. Basis capitulum sin áreas porosas. Adulto (Machos) CLAVE PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS GÉNEROS DE ADULTOS DE LA FAMILIA IXODIDAE 1) Surco anal claramente marcado, pre anal. Ojos e festones ausentes Inornato.. Ixodes Surco anal post anal o ausente. 2 2) Gnatossoma longo, ornato o inomato.. Amblyomma Gnatossoma curto, siempre inornato.. 3 3) Basis capitulum rectangular.. 4 Basis capitulum hexagonal 5 4) Ojos ausentes, presenta 11 festones.. Haemaphysalis Ojos presentes, presenta 7 festones, pentrema en forma de disco de teléfono Anocentor 5) Coxa I con dos espuelas largas, palpos tan largo como hipostomum. Con festones. Machos con 2 placas adanales. Rhipicephalus Coxa I con dos espuelas muy pequeñas, palpos más curtos que hipostomum. Sin festones. Machos con 4 placas adanales. Boophilus 27