Elkin Fabián Valbuena Mora. Dirigido por. Marylin Hidalgo Ph D. Co-director. Alvaro A. Faccini M, MD. Jurado. Dra. Rubiela Castañeda Salazar MV. M Sc.

Transcripción

1 Tas Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del municipio de Villeta, Cundinamarca Elkin Fabián Valbuena Mora Dirigido por Marylin Hidalgo Ph D Co-director Alvaro A. Faccini M, MD Jurado Dra. Rubiela Castañeda Salazar MV. M Sc. Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología Industrial Bogotá 2012

2 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del municipio de Villeta, Cundinamarca Elkin Fabián Valbuena Mora Aprobado Decano Académico Facultad Ciencias Dra. Ingrid Schuler Garcia Directora Carrera Microbiologia Dra. Janeth Arias Palacios Ph D. Ph D. Bogotá 2012

3 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del municipio de Villeta, Cundinamarca Elkin Fabián Valbuena Mora Aprobado Directora Dra. Marylin Eliseyev Hidalgo Díaz M Sc., Ph D. Jurado Dra. Rubiela Castañeda Salazar MV. M Sc. Bogotá 2012

4 Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946 La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y justicia

5 Agradecimientos A Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de mi carrera, por ser mi fortaleza y por brindarme una vida llena de aprendizajes. Le doy gracias a mis padres Luis Antonio Valbuena y Gladys Mora, por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, por su apoyo incondicional y sobre todo por su sacrificio para ser realidad este sueño. A mi hermana Milena Valbuena Mora por sus consejos, por su inalcanzable apoyo y por ser un ejemplo a seguir. Gracias a mi novia Ana milena Barragán Sánchez por su apoyo, comprensión y amor. Le agradezco la confianza, el apoyo y dedicación de tiempo a mi directora Marylin Hidalgo Díaz y mi codirector Álvaro Faccini Martinez quienes hicieron posible este trabajo y que además de ser orientadores fueron grandes seres humanos. A todos los que conforman el laboratorio de Bacteriología especializada por el apoyo durante el proceso y por ser un gran grupo de trabajo. A mis amigos, Daniel Granados por enseñarme que la amistad sincera es posible, a Diego Millán por ser mi compañero de momentos malos y buenos y por hacer de este largo camino una gran etapa y a Diego Pedraza mi único y gran amigo de la Universidad.

6 TABLA DE CONTENIDO RESUMEN INTRODUCCIÓN JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA MARCO TEÓRICO Generalidades: Género Rickettsia Garrapatas (Ixodidae) como vectores de las rickettsias Biología molecular de las rickettsiosis OBJETIVOS Objetivo general Objetivo específicos Recolección de garrapatas Clasificación taxonómica de las garrapatas Extracción de ADN a partir de los vectores recolectados METODOLOGÍA Población de muestreo Recolección de garrapatas Clasificación taxonómica de las garrapatas Detección de rickettsias en especímenes colectados Análisis estadístico RESULTADOS Recolección de garrapatas Clasificación de las garrapatas Detección de rickettsias en especímenes colectados DISCUSIÓN CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS Anexo 1. Claves taxonómicas para estadío y género Anexo 2. Procedimiento de PCR para el gen 16S rrna Anexo 3. Procedimiento de PCR para el gen glta Anexo 4. Tabla de clasificación taxonómica y por estadío de las garrapatas... 19

7 Detección del gen glta, conservado en el género Rickettsia, mediante PCR convencional a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos del municipio de Villeta, Cundinamarca Resumen Las rickettsiosis son enfermedades causadas por bacterias del género Rickettsia, que se transmiten a humanos a través de artrópodos vectores, causando en algunos casos brotes graves con tasas elevadas de mortalidad, lo que las convierte en un problema importante de Salud Publica. El presente estudio evaluó mediante la técnica de PCR convencional, la presencia del gen glta, conservado en todas las especies de Rickettsia, a partir de garrapatas (Ixodidae) recolectadas en equinos en la zona rural del municipio de Villeta, Cundinamarca. Un total de 45 equinos fueron muestreados recolectando 386 garrapatas, distribuidas en 3 especies diferentes: 86 (22,5%) Amblyomma cajennense, 298 (77,2%) Dermacentor (Anocentor) nitens y 2 (0,51%) Rhipicephalus (Boophilus) microplus. De 234 grupos obtenidos durante el estudio, 191 grupos fueron positivos para el gen 16S rrna y 2 para el gen glta correspondientes a una A. cajennense y D. nitens. A través de algunos estudios se ha observado la presencia de especies de rickettsias circulantes en zonas endémicas para fiebre manchada de las montañas rocosas reportando altas tasas de seropositividad de anticuerpos contra Rickettsia rickettsii en equinos. Sin embargo, son necesarios más estudios para la detección de genes más específicos para el género Rickettsia como rompa y rompb, además del uso de técnicas de secuenciación con el fin de establecer las especies de Rickettsia presentes en las garrapatas. 1. Introducción Las Rickettsiosis son enfermedades causadas por bacterias del género Rickettsia, transmitida a humanos y a animales por medio de artrópodos vectores como pulgas, piojos y garrapatas (1). Estas últimas, en su mayoría, involucran más de un hospedero en su ciclo de vida, los cuales pueden ser animales domésticos tales como caninos y equinos (2). En Latinoamérica, Dermacentor (Anocentor) nitens es la principal garrapata asociada a equinos, seguida por Amblyomma cajennense (3). En los últimos años, estudios serológicos realizados en equinos, demuestran importantes tasas de seropositividad para rickettsias del grupo de las fiebres manchadas, sugiriendo la presencia de estas bacterias en las zonas de estudio 1

8 (4). Este hecho suele presentarse en zonas geográficas endémicas para fiebre manchada de las montañas rocosas, cuyo agente etiológico es R. rickettsii (5). En Colombia la primera descripción de enfermedad humana por R. rickettsii, fue realizada en 1937 por el Doctor Luis Patiño en la región del Valle de Tobia, denominándola como Fiebre de Tobia, presentando tasas de mortalidad del 90% (6). Sin embargo, casi 70 años después, entre 2003 y 2004, se reportaron dos nuevos casos de mortalidad causada por esta especie de Rickettsia en personas procedentes de zona rural de Villeta y Tobia, Cundinamarca, sin determinarse el vector implicado (7). En el año 2005 se realizó un estudio en el municipio de Villeta, el cual arrojó una seroprevalencia de anticuerpos de la clase IgG contra R. rickettsii en humanos del 43% de la población estudiada, así mismo en el año 2007 fueron reportados estudios de seropositividad en equinos muestreados en Villeta, Cundinamarca los cuales reportaron una seroprevalencia del 16,3% para anticuerpos de la clase IgG contra especies de rickettsias del grupo de las fiebre manchadas (8). A pesar de estos antecedentes, no existen publicaciones que demuestren cuál o cuáles especies de garrapatas actúan como vectores de las rickettsiosis ni las especies de rickettsias que predominan en la región de Villeta Cundinamarca. El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia del gen glta, conservado del género Rickettsia, en especies de garrapatas de equinos del municipio de Villeta, Cundinamarca mediante PCR convencional, aportando información preliminar para el proyecto dentro del cual se encuentra enmarcado Caracterización de factores climáticos y ecológicos de una especie de garrapata y su relación con la epidemiología de la rickettsiosis en un área endémica. 2. Justificación y planteamiento del problema Las Rickettsias son microorganismos que infectan a humanos, transmitidos a través de artrópodos vectores, causando cuadros febriles agudos y en algunos casos brotes graves con tasas elevadas de mortalidad, siendo consideradas como un problema de Salud Pública (9). Es importante destacar que la ecoepidemiologia de las rickettsiosis depende de la distribución de sus vectores; es así como algunas especies de Rickettsia se delimitan a determinadas aéreas geográficas como R. massiliae en Buenos Aires, Argentina, R.rickettsii en zonas tropicales (Colombia, Brasil entre otras), R. helvética en Isla Madeira en Portugal y R.slovaca en España, entre otras. (10). En Centro y Suramérica la documentación sobre estas enfermedades ha ido en progreso desde la última década con la descripción de nuevas especies como R. amblyommii, R. rhipicephali, R. parkery, R. massiliae, R. akari, R. candidatus entre otras y con casos clínicos relacionados (1, 10,11). La importancia de 2

9 documentar datos epidemiológicos sobre las rickettsiosis reside en que la incidencia en países tropicales no sigue patrones temporales claros, lo que se suma a su dificultad de diagnóstico por la semejanza a otras enfermedades febriles agudas como el dengue y la malaria, presentando manifestaciones clínicas similares (12). En el caso de las rickettsiosis del grupo de las fiebres manchadas, la transmisión ocurre entre la garrapata (vector) y una especie animal, pasando por diferentes hospederos dependiendo de la especie de garrapata implicada, en donde los humanos pueden verse afectados, por lo que son consideradas como enfermedades zoonóticas (13). Uno de los factores que más se relaciona con este tipo de enfermedades zoonoticas, es la frecuencia con la cual los humanos se exponen a potenciales artrópodos vectores, especialmente relacionados a animales domésticos como caninos y equinos (14). Dermacentor (Anocentor) nitens y Amblyomma cajennense, son las principales garrapatas relacionadas con equinos en Suramérica, adicionalmente se han encontrado infectadas con especies de rickettsias como R. rickettsii, R. amblyommii, así mismo se destaca el papel de A. cajennense como principal vector de R. rickettsii en esta región geográfica (11,15). A su vez, algunos estudios, demuestran tasas considerables de seropositividad para R. rickettsii en equinos en zonas endémicas para fiebre manchada de las montañas rocosas, sugiriendo la circulación de bacterias del género Rickettsia (4,8). Teniendo en cuenta los reportes existentes en Colombia se considera a Villeta como una zona endémica para las rickettsiosis (6,8). A pesar de esta clasificación no se ha logrado establecer cual o cuales especies de garrapatas son las que pueden actuar como vectores de la Rickettsia. Por esta razón este estudio, tuvo como objetivo determinar la presencia del gen glta, conservado en el género Rickettsia, en especies de garrapatas recolectadas en equinos del municipio de Villeta, Cundinamarca. 3. Marco teórico: 3.1 Generalidades: Género Rickettsia El género Rickettsia pertenece al orden de los Rickettsiales y a la familia Rickettsiaceae, son bacterias intracelulares obligadas, Gram negativas, con capacidad de reproducirse tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula infectada (13). Son transmitidas por artrópodos vectores, por lo cual, la epidemiologia de las enfermedades causadas por estas bacterias, depende de la distribución de sus vectores (2). Los miembros de este género bacteriano se clasifican actualmente en cuatro grupos, dadas sus características genéticas: Grupo de las fiebres manchadas 3

10 (R. rickettsii, R. conorii, R. parkeri, entre otras), Grupo del tifus (R. prowazekii y R. typhi), Grupo transicional (R. felis, R. akari y R. australis) y el Grupo ancestral (R. bellii y R. canadensis); este último sin patogenicidad conocida (16). Una vez están en el hospedero vertebrado, las Rickettsias invaden las células endoteliales induciendo su propia fagocitosis y una vez dentro del citosol, escapan del fagosoma y proliferan por fisión binaria simple, siendo finalmente expulsadas por exocitosis para seguir infectando células contiguas (13). La lesión vascular se ve reflejada en el aumento de la permeabilidad vascular y hemorragia (16). En relación a las garrapatas, las rickettsias se multiplican en casi todos los órganos y fluidos, principalmente en glándulas salivales y ovarios, lo que facilita la transmisión durante la alimentación y de manera transestadial (17). Respecto a los humanos, la diseminación dentro del organismo se da por vasos linfáticos seguido de los vasos sanguíneos hacia todos los órganos, la invasión de las células endoteliales, produce un aumento en la permeabilidad vascular causando un edema e hipovolemia (9). 3.2 Garrapatas Ixodidae como vectores de Rickettsias Los vectores, ya sean artrópodos o mamíferos, son aquellos que intervienen en la transmisión de virus, parásitos o bacterias, causando consigo una infección. Entre los artrópodos con capacidad vectorial respecto a las rickettsiosis, se destacan las garrapatas, los ácaros, las pulgas y los piojos (2). Las garrapatas se clasifican en 3 familias Ixodidae (duras), Argasidae (blandas) y Nuttalliellidae. Son arácnidos hematófagos obligados que tienen gran importancia médica y veterinaria debido a las múltiples enfermedades que pueden transmitir entre las que se encuentran involucrados diferentes organismos patógenos como virus, bacterias, protozoos y nemátodos (18). Las rickettsias del grupo de las fiebres manchadas, son transmitidas por garrapatas pertenecientes a la familia Ixodidae principalmente, que se caracterizan por un tamaño que varia entre los 2mm y 30mm dependiendo de la especie, estadio y sexo (18); las etapas de desarrollo se dividen en 4 estadios, que incluyen huevo, larva (hexápoda), ninfa y estadio adulto (octápodas) (18). En su mayoría, respecto al ciclo de vida, las garrapatas de la familia Ixodidae, tienen un hospedero por cada estadío de desarrollo (garrapatas de tres estadíos), en donde la variedad de vertebrados tanto silvestres (zarigüeyas y roedores) como domésticos (equinos, caninos y bovinos) actúan como hospederos (18). 4

11 Dentro del grupo de las fiebres manchadas, Rickettsia rickettsii, es la especie más patógena (5). Ha sido encontrada en garrapatas de diferentes géneros como Amblyomma, Dermacentor y Rhipicephalus recolectadas de animales domésticos como caninos y equinos en México, Costa Rica, Panamá, Colombia, Brasil y Argentina (11). Dermacentor (Anocentor) nitens es la principal garrapata asociada a equinos, clasificada como de un solo hospedero (19). Sin embargo se ha observado que otras especies de garrapatas también tienen una relación directa con los equinos en sus ciclos de vida, como es el caso de Amblyoma cajennense y en menor frecuencia Rhipicephalus (boophilus) microplus (20). Amblyoma cajennense ha sido reportada en varios países de Sur América como vector de R. rickettsii y R. amblyommii (11,18). En relación a Rhipicephalus (boophilus) microplus, si bien es conocida como la garrapata de los bovinos en algunos casos puede encontrarse parasitando equinos, teniendo en cuenta que en algunos episodios comparten zonas de pastoreo (15). 3.3 Biología molecular de la rickettsiosis El diagnóstico clínico en humanos de las enfermedades rickettsiales es de gran complejidad por la semejanza clínica respecto a otras enfermedades febriles agudas (12). Es por esa razón que los métodos de diagnóstico en los últimos años, se han enfocado en la identificación de genes específicos del género Rickettsia mediante pruebas de biología molecular como la PCR (13). El gen comúnmente analizado para la identificación de rickettsias es glta (codifica para la citrato sintasa), el cual se encuentra conservado en todas las especies del género Rickettsia (20) así mismo es frecuentemente utilizado en la determinación de la presencia de este género bacteriano en artrópodos vectores como pulgas y garrapatas (21). A su vez, existen otros genes (rompa y ropmb), también utilizados para la identificación de rickettsias. Estos son los que codifican para dos proteínas de la membrana externa, rompa y rompb (20). 4. Objetivos 4.1 Objetivo general Detectar mediante PCR convencional la presencia del gen glta del género Rickettsia en especies de garrapatas recolectadas en equinos en Villeta, Cundinamarca. 5

12 4.2 Objetivos específicos Recolección de las garrapatas de equinos en la zona rural del municipio de Villeta, Cundinamarca Clasificar taxonómicamente y determinar el estadio de desarrollo de las garrapatas de los equinos de la zona rural del municipio de Villeta, Cundinamarca Evaluar la presencia de tickettsias en las especies de garrapatas colectadas en equinos mediante la detección del gen glta usando PCR convencional. 5. Metodología 5.1 Población de muestreo Se realizó el muestreo de los equinos pertenecientes a 23 veredas del municipio de Villeta Cundinamarca incluyendo cabecera municipal. 5.2 Recolección de las garrapatas Dichos equinos fueron inmovilizados y las garrapatas fueron desprendidas manualmente siguiendo la metodologia descrita por Alvarez y Bonilla (22). Para lograr obtener una mayor cantidad de equinos se realizó una jornada de desparasitación por cada vereda que se visitó. Se realizó exámen físico para cada animal, de esta manera se inició por la región de la cabeza y el cuello incluyendo el interior de las orejas (área 1), posteriormente se siguió con la región pectoral y axial (área 2), luego la región abdominal (área 3) finalizando con la región inguinal y perineal (área 4), las garrapatas recolectadas fueron puestas en un recipiente con etanol al 70% para preservarlas. Por medio de una encuesta se registaron datos de cada animal correspondientes a la especie, raza, sexo, edad, áreas corporales infestadas, zona geográfica y fecha de colecta. Despues de recolectadas las garrapatas fueron transportadas al laboratorio de parasitologia veterinaria de la FMVZ de la Universidad Nacional de Colombia. 5.3 Clasificación taxonómica Las garrapatas recolectadas fueron identificadas en el Laboratorio de parasitología Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia clasificandolas por medio de claves taxonómicas para llegar a género y especie (23) (anexo 1). Poteriormente fueron separadas primero por estadío de desarrollo, animal al que pertenece y vereda. 6

13 Las garrapatas identificadas hasta el taxón más específico se conservaron en alcohol etílico al 70% en recipientes individuales para cada hospedero, región muestreada (vereda) y estadío de desarrollo en caso de las hembras. 5.4 Detección de rickettsias en especímenes colectados. La identificación molecular se realizó reuniendo las garrapatas recolectadas por animal y zona geografica en grupos de 5 a 6 en caso de los machos, en grupos de 7 u 8 en caso de ser ninfas o larvas y en las hembras una por recipiente, esto se hizo ya que el tamaño de los machos, ninfas y larvas, es menor que el de las hembras. Cada garrapata se lavó con agua destilada estéril y fue cortada por la mitad. Una mitad se guardó debidamente identificada a -80º C en caso de problemas de contaminacion y la otra mitad fue utilizada para la extracción de ADN y posterior análisis por PCR. Para la extracción de ADN los grupos fueron puestos en baño termostatado a 78ºC por 20 minutos con el fin de evaporar el etanol ya que este compuesto es inhibidor de la PCR. Posteriormente las garrapatas fueron sacadas de cada grupo y puestas en un tubo eppendorf estéril al cual se le agregó 400 µl de PBS 1X para luego ser maceradas. La extracción de ADN se realizó utilizando el estuche comercial de Quiagen siguiendo el procedimiento descrito, con una modificacion, la adición de 400 ul de DNAzol, con el fin de obtener el ADN mas puro ya que el DNAzol es un detergente que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtención de ADN. Posteriormente se hizo la cuantificacion del ADN extraido por medio del nanodrop determinando cantidad y calidad del mismo. El ADN extraido de cada grupo fue congelado a -20ºC y utilizado para la amplificación del gen 16s rrna mitocondrial descrita por Mangold y colaboradores (24) (Anexo 2) como control de inhbidores de la PCR, asi como para la amplificación de un fragmento de 401 pb del gen glta descrita por Labruna y colaboradores (25) (Anexo 3) el cual corresponde a un gen presente en todas las especies de Rickettsia (21). La amplificación de la citrato sintasa se llevó acabo por PCR convencional utilizando los primers 78 ( sentido) y 323 (anti sentido) (25). En cada una de las PCR realizadas se incluyeron tanto un control positivo de DNA puro de Rickettsia rickettsii como un control negativo el cual contenia solo agua. Cinco micro litros del marcador de peso molecular de 100 pb de la casa comercial ZYMMO y diez microlitros del producto de PCR fueron sometidos a la electrofresis en gel de de agarosa al 2,0%, teñido con Sybr Safe y examinado bajo transiluminacion UV. 7

14 5.5 Análisis estadístico. En el presente trabajo se realizó un muestreo por conveniencia en donde se usaron los equinos que se encontraban disponibles el dia en que se realizó la jornada de desparasitación. Así mismo para el análisis estadísticos de los resultados, se utilizaron herramientas de estadistica descriptiva, tomando como base medidas de frecuencia y realizando cálculos de proporciones. 6. Resultados 6.1 Recolección de garrapatas En 19 veredas incluyendo la cabecera municipal de las 23 incluidas en la investigación, se encontró un total de 76 equinos, de los cuales 45 presentaron infestación por garrapatas, en las 5 veredas restantes no hubo equinos. Un total de 386 garrapatas fueron recolectadas las cuales estuvieron distribuidas en 13 veredas, en las 6 veredas restantes no hubo equinos infestados (Figura 1). Figura 1: Número de garrapatas distribuidos en las 13 veredas

15 6.2 Clasificación taxonómica Teniendo en cuenta la zona geográfica y el equino muestreado, a las garrapatas obtenidas se les asignó un código único, posteriormente las 386 garrapatas recolectadas se clasificaron por género, especie y estadío, obteniendo como resultados: Amblyomma cajennense 22,3% (n=86), Dermacentor (anocentor) nitens 77,2% (n=298) y Rhipicephalus (boophilus) microplus 0,51% (n=2) (Figura 2) (Anexo 4). A B C Figura 2: Especies de garrapatas recolectadas. A: Amblyomma cajennense. B: Dermacentor (Anocentor) nitens. C: Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 6.3 Detección de rickettsias en especímenes colectados A partir de las 386 garrapatas recolectadas de los equinos, se obtuvieron 234 pools a los cuales se les realizó PCR convencional para el gen 16S rrna mitocondrial de garrapata como control de inhibidores, teniendo como resultado 191 grupos positivos (81,6%) y 43 grupos negativos (18.3%) para el gen 16S rrna (figura 3). C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 C 10 C 11 C 12 C 13 C 14 C 15 C 16 C 17 C 18 C 19 C 20 Figura 3. Gel de agarosa de la PCR para el gen 16S rrna mitocondrial de garrapata. En el carril 1 (C1) se observa el marcador de peso molecular, en los carriles 19 y 20 (C19 y C20) se sembró el control negativo de extracción de ADN y el control negativo respectivamente. La muestra del carril 11 (C11) es negativa, las demás muestras son positivas. A los 191 pools positivos obtenidos en la PCR convencional para el gen 16S rrna mitocondrial de garrapata, se les realizó PCR para el gen glta presente en 9

16 todas las especies de Rickettsia, obteniendo como resultado 2 grupos positivos (1,0 %) y 189 grupos negativo (99%) (Figura 4), los cuales correspondían a una hembra A. cajennense y una hembra D. nitens C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8 C 9 C 10 C 11 C 12 C 13 C 14 C 15 Figura 4. Gel de agarosa de la PCR para el gen glta. En el carril 1 (C1) se observa el marcador de peso molecular, en el carril 2 (C2) el control positivo, en el carril 15 (C15) se sembró el control negativo. La muestra del carril 14 (C14) es positiva. 7. Discusión Tres especies de garrapatas, D. nitens, A. cajennense y R. microplus fueron encontradas parasitando equinos en la zona donde se llevó a cabo la recolección (Villeta, Cundinamarca), esto concuerda con estudios previos en Brasil y Panamá que reportan dichas garrapatas infestando equinos, en zonas donde la fiebre de las montañas rocosas ha estado presente (3,5,26). D. nitens fue la especie más encontrada, seguida por A. cajennense y en menor proporción R. microplus; resultados similares fueron obtenidos en 6 granjas del estado de Sao Paulo por Heuchert et al. (1999) (27), y concuerda con lo reportado por Labruna et al. (2001) (3) quien indica que los equinos son considerados hospederos primarios para las especies A. cajennense y D. nitens. Cabe resaltar que los equinos han sido utilizados en zonas endémicas de la fiebre manchada de las montañas rocosas indicando la presencia de bacterias de género Rickettsia en dichas zonas, estudios previos de ensayos de inmunofloresencia indirecta lo corroboran con datos altos de seropositividad en equinos en zonas endémicas para fiebre manchada (4,8,28). Por otro lado, R. microplus ha estado asociada a bovinos como su huésped principal, sin embargo se ha observado en estudios anteriores la posibilidad de que los equinos actúen como hospederos accidentales para esta especie de garrapata cuando comparten zonas de pastoreo con los bovinos (15), fundamentando la razón por la cual esta especie de garrapata se encontró durante el estudio. D. nitens y A. cajennense estuvieron presentes en los tres estadíos (larva, ninfa, adulto) por el contrario R. microplus solo se presentó en estadío adulto. Cabe resaltar que durante el estudio se obtuvieron más garrapatas en estadío adulto, 10

17 debido a que el periodo de colecta fue entre Julio y Diciembre, el cual se presentó como época de sequia; esto concuerda con estudios realizados en Brasil por Oliveira et al (2000), donde la mayor cantidad de especímenes (adultos) fueron recolectados entre los meses de Septiembre y Diciembre (29). Este fenómeno se debe a que cuando las temperaturas son mayores, los niveles de infestación son mas altos, por lo que la abundancia larval y de adultos es superior, principalmente porque las garrapatas evitan recibir directamente luz solar para impedir su desecación, lo que genera un tropismo hacia las zonas sombreadas del caballo, entre las que se destacan las orejas, el perine, la cola y la ingle (19, 29,30). De las tres especies de garrapatas recolectadas en el estudio, solo en dos (hembras de D. nitens y A. cajennense) se logró detectar el gen glta, datos semejante fueron reportados en un estudio realizado en Panamá por Bermúdez et al (2010) (5). Así mismo hay que tener en cuenta que la detección de ADN de Rickettsia en sangre de garrapatas no es frecuente, se ha reportado que sólo el 4% de las garrapatas del género Dermacentor están infectadas con Rickettsia y menos del 0.1% con especies patógenas (31), de igual forma Labruna et al (2001) (3) reportan infección de bacterias del género Rickettsia en garrapatas de la especie A. cajennense en menos del 1%, datos que coincide con lo obtenido en el presente estudio donde se obtuvo el 1% de grupos positivos para el gen glta. Éste fenómeno también se presenta en humanos, generalmente el número de rickettsias en la sangre es bajo, a excepción de una enfermedad avanzada o una infección severa. Así, la detección para el diagnóstico de fiebre manchada de las montañas rocosas es limitada, debido a la baja prevalencia de la enfermedad. Sin embargo, han surgido nuevos métodos basados en PCR, los cuales presentan ventajas como mayor velocidad, sensibilidad y reproducibilidad, respecto a la PCR convencional. Éstas técnicas, en caso de poder ser implementadas y adicionalmente ser complementadas con métodos inmunológicos, pueden ayudar al diagnóstico oportuno de esta enfermedad (32). A pesar de haber logrado detectar el gen glta, en el estudio no se realizó la identificación de la especie implicada en cada espécimen, sin embargo estudios anteriores por Labruna et al (2001) demuestran que la especie que comúnmente infecta a Amblyomma cajennense es Rickettsia rickettsii agente etiológico de la fiebre manchada de las montañas rocosas (3). Así mismo estudios previos demuestran la posibilidad que Rickettsia rickettsii infecte a D. nitens (5), lo que nos podría sugerir la presencia de esta especie de Rickettsia en lo grupos positivos para el gen glta teniendo en cuenta que la especie de garrapata fue recolectada y que además Rickettsia rickettsii ha sido reportada en Villeta, Cundinamarca lugar donde se llevó a cabo el presente estudio (6,7). 11

18 No obstante estudios previos demuestran que Rickettsia Amblyommii es capaz de infectar especies como A. cajennense y D. nitens (33) las cuales fueron las mismas especies que se obtuvieron en el presente estudio como positivas para el en glta. R. amblyommii se ha reportado como un patógeno humano potencial, pero esto no se ha comprobado con su aislamiento en muestras de pacientes que presenten la enfermedad; adicionalmente se ha demostrado su circulación entre garrapatas y animales domésticos en Panamá, por lo que debe ser considerado como un posible patógeno humano en este país. Hay que tener en cuenta que hallazgos similares han sido reportados en la frontera entre Colombia y Panamá, por lo que R. amblyommi debería ser considerado un patógeno humano potencial también en nuestro país (5). Partiendo de lo anterior se podría sugerir la presencia de esta especie de Rickettsia en el presente estudio, teniendo en cuenta que si bien se ha reportado casos letales por R. rickettsii, además de estudios serología tanto en animales como en humanos reportando altas tasas de seropositividad, en los últimos años no se han registrado nuevos casos, lo que podría sugerirnos que estamos frente a una especie de Rickettsia menos patógena, sin embargo cabe aclarar que en el presente estudio no se realizo la secuenciación de las muestras positivas para el gen glta. Al igual que con otras enfermedades transmitidas por vectores, las rickettsiosis son de difícil control debido a su epidemiología compleja que involucra diferentes garrapatas como vectores, así como numerosos animales hospederos y sus dinámicas de población; el ser humano es un hospedero accidental en el caso de D. nitens a diferencia de A. cajennense, la cual se alimenta de varios hospederos dentro de los cuales algunas veces al hombre (5,32). Sin embargo, el ser humano no es responsable del mantenimiento de la infección en la naturaleza, de esto se encargan los vectores, como las garrapatas, las cuales transmiten las rickettsias durante varias generaciones transováricamente (34). No obstante las rickettsias pueden llegar a ser patógenas para las garrapatas después de varias generaciones, por lo que para mantenerse en el ambiente, las rickettsias deben ser transmitidas horizontalmente a hospederos vertebrados que desarrollen rickettsemia en una magnitud suficiente para infectar otras garrapatas, y así empezar nuevas líneas de rickettsias mantenidas transováricamente (34). Sin embargo, este proceso puede verse afectado por la infección transovárica de las garrapatas por otras especies no patógenas de Rickettsia, impidiendo la distribución de R. rickettsii; además de esto, el éxito de la transmisión transovárica depende principalmente del grado de desarrollo de Rickettsia en el tejido ovárico de la garrapata (35). Con lo anteriormente mencionado se hace evidente la 12

19 importancia de los caballos, entre otros mamíferos, en el ciclo de vida de especies del género Rickettsia como R. rickettsii y en su transmisión a humanos. Por esto, se hace necesario un conocimiento preventivo en zonas endémicas para la fiebre de las montañas rocosas así como la unificación de las ramas de la medicina que involucran animales y humanos, los cuales se ven afectados por este grupo de enfermedades, con el fin de lograr un incremento en el nivel de comunicación entre médicos y médicos veterinarios y así lograr la aplicación de medidas preventivas efectivas para evitar el desarrollo de brotes y en tal caso, lograr un diagnóstico más eficiente y un tratamiento apropiado tanto para los mamíferos como para los humanos (36). 8. Conclusiones y recomendaciones Los equinos muestreados en la zona rural del municipio de Villeta, Cundinamarca se encontraban infestados con garrapatas de las especies D. nitens, A. cajennense y R. microplus. Se logró detectar el gen glta en dos especimenes (D. nitens, A. cajennense) correspondiente al 1%, sugiriendo la presencia del género Rickettsia en la zona de estudio. Es necesario la secuenciación para las muestras positivas del gen glta obtenidas en el estudio con el fin de corroborar la especie presente en cada espécimen, además de la amplificación de genes más específicos para especies de Rickettsia como ompa y ompb (20). 9. Bibliografía (1) Labruna M. Ecology of Rickettsia in South America. N.Y. Acad Scie 2009: 1166: (2) Parola P, Davoust, B, Raoult, D. Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses.vet Res 2005; 36(3): (3) Labruna M, Kerber C, Ferreira F, Luiz J. Faccini B, De Waal D, Gennari S. Risk factors to tick infestations and their occurrence on horses in the state of São Paulo, Brazil. Veterinary Parasitology 2001; 97: (4) Horta M, Labruna M, Sangioni M, Vianna M, Gennari S, Galvao M, Mafra C, Vidotto O, Schumaker T, Walker D. Prevalence of antibodies to spotted fever group rickettsiae in humans and domestic animals in a brazilian spotted fever endemic area in the state of Sao Paulo, Brazil: serologic evidence for infection by Rickettsia rickettsii and another spotted fever group Rickettsia. Am J Trop Med Hyg 2002; 71(1):

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23 10. Anexos Anexo 1: Claves taxonómicas para estadío y género. 17

24 18

25 10.2. Anexo 2: Procedimiento de PCR para el gen 16S rrna Las condiciones de la PCR incluyen una denaturación inicial a 94 C durante 2 minutos, seguida por 35 ciclos de 30 segundos a 94 C, 30 segundos para la hibridación de los iniciadores y 45 segundos para la extensión de los mismos a 72 C. La temperatura de anillamiento de los 7 primeros ciclos se incrementa a razón de 0,3 C cada segundo ciclo de 47 a 48,8 C, seguido por 28 ciclos usando una temperatura de anillamiento de 50 C. Se lleva a cabo un paso final de extensión durante 7 minutos a 72 C. Los iniciadores utilizados para la amplificación de un fragmento de 460 pb del gen 16S rrna son: Forward: 5 -CCG GTC TGA ACT CAG ATC AAG T-3 y Reverse: 5 -GCT CAA TGA TTT TTT AAA TTG CTG T Anexo 3: Procedimiento de PCR para glta Las condiciones de la PCR incluyen un ciclo inicial a 95 C durante 3 minutos, 40 ciclos por 15 segundos a 95 C, 30 segundos a 48 C, 30 segundos a 72 C y un ciclo final a 72 C durante 7 minutos. Los iniciadores utilizados fueron CS-78: 5 - GCA AGT ATC GGT GAG GAT GTA AT-3 y CS-323: 5 -GCT TCC TTA AAA TTC AAT AAA TCA GGA T Anexo 4. Clasificación taxonómica de género y especie y por estadio de las garrapatas, y distribución por veredas. Vereda Género y especie Estadio ( garrapata) Larva Ninfa Adulto Hembra Macho Alto de paja A. cajennense D. nitens Balsal A. cajennense D. nitens Cabecera Municipal A. cajennense D. nitens Chapaima A. cajennense D. nitens Chorrilo R.microplus D. nitens Cune A. cajennense D. nitens La bolsa A. cajennense

26 D. nitens llo grande D. nitens Mave D. nitens Naranjal A. cajennense Payande A. cajennense D. nitens Salitre negro A. cajennense D. nitens San isidro D. nitens TOTAL Anexo 4. Clasificación taxonómica de género y especie y por estadio de las garrapatas, y distribución por veredas Garrapatas 20