Estudio Citogenético de las especies del género Polylepis P. incana y P. racemosa en el Ecuador

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1 Estudio Citogenético de las especies del género Polylepis P. incana y P. racemosa en el Ecuador Quijia Lamiña, P., Jadán, M & Proaño K. Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ing. en Biotecnología, Escuela Politécnica del Ejército, Sangolquí, Ecuador. Segovia-Salcedo, C. Universidad de Florida, Departamento de Botánica, FLMNH, Gainesville, USA RESUMEN: En este trabajo se presentan los números cromosómicos somáticos de 2 especies del género Polylepis Ruiz & Pav. (Rosaceae, Sanguisorbeae). Este género está distribuido únicamente a lo largo de los Andes Sudamericanos, con gran importancia ecológica. P. incana (2n = 39 42) está ampliamente distribuida en el Ecuador, forma el centro de un complejo de especies, muchas de las cuales pueden hibridizarse entre sí, del cual forma parte también P. racemosa (2n = 69-80), especie que ha sido introducida en los ecosistemas naturales causando un impacto negativo. Se utilizaron ápices radicales y botones florales para estandarizar los protocolos de obtención de cromosomas metafásicos con las diferentes técnicas de pretratamiento, fijación, hidrólisis y montaje de las muestras. Adicionalmente, se evaluó el proceso mitótico en células radicales de P. incana colectadas a diferentes horas del día, para determinar la hora más apropiada de recolección y pretratamiento de las muestras, la cual es a las 08h30 debido a que reporto el mayor íncide mitótico (67%). ABSTRAC: The chromosome number (2n) of two species of genus Polylepis Ruiz & Pav. (Rosaceae, Sanguisorbeae) is shown in this study (P. incana, 2n = 39 42, P. racemosa, 2n = 69 80). The genus Polylepis is widely distributed along the Andes becoming a key species to the highlands. P. incana is widely distributed in the Ecuador, is the center of a species complex that can hybridize between them, P. racemosa forms part of this complex, it has been introduced in the natural ecosystems causing a negative impact. Root tips and young inflorescences were used to standardize protocols for obtaining chromosomes in metaphase with different techniques: Pretreatment, fixation, hydrolysis, staining and squash of samples. In addition, the process mitotic was revised on P. incana s root tips collected at different daytime to determinate the better hour for the samples collection and pretreatment. This hour is O8h00 because has the higher mitotic index. (67%) 1. INTRODUCCIÓN El género Polylepis incluye 26 especies de árboles y arbustos que habitan desde los Andes Venezolanos hasta la parte central de Argentina, entre los 3500 a 5000 m.s.n.m. (Kessler & Shmidt-Lebuhn, 2006). Estos árboles constituyen la vegetación natural de los Andes, en su mayor parte, los cuales se encuentran formando parches entre los pajonales formando verdaderos oasis biológicos que permiten el desarrollo de gran cantidad de especies animales y vegetales muchas de ellas endémicas (Kesssler & Herzog, 1998). La importancia ecológica de estos bosques de montaña radica en el aumento de la humedad del aire y de las precipitaciones, las cuales son retenidas y filtradas a través de la vegetación lo que permite obtener, en forma gradual, agua de mejor calidad y la prevención de la erosión (Bucher & Schofield, 1981). Sin embargo, la dis-

2 tribución actual de las poblaciones de Polylepis ha ido disminuyendo de manera alarmante por procesos antropogénicos e introducción de especies, las cuales presentan mayores ventajas adaptativas al medio, provocando un impacto negativo en los ecosistemas naturales (Jameson & Ramsay, 2007). Durante las últimas décadas, varios intentos de clarificar la filogenia de Polylepis ha fracasado (Schmidt-Lebuhn, Kumar & Kessler, 2006). La presencia de poliploidía en el género, no ha sido analizada con éxito, debido a la complejidad del conteo cromosómico de estas especies (Shmidt-Lebuhn, Seltmann & Kessler, 2007). Esta investigación se centra en determinar el número cromosómico de dos especies de Polylepis y aportar con información para el esclarecimiento del proceso evolutivo de este género en los Andes con miras a su conservación y manejo. 2. METODOLOGIA 2.1 Recolección de muestras Dos especies: P. incana y P. racemosa del género Polylepis Ruiz & Pav. (Rosaceae, Sanguisorbeae) colectadas de poblaciones naturales y cultivadas, en los andes ecuatorianos en junio y julio del 2008, fueron utilizadas en este estudio. Las plántulas colectadas fueron mantenidas en la zona de los invernaderos del laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Escuela Politécnica del Ejército, Sangolquí-Ecuador. 2.2 Determinación de la hora de colección Se fijaron las raíces meristemáticas, colectadas a diferentes horas del día, en una solución de etanol, ácido acético (3:1) durante 24 horas a 4 C (Martínez-Gómez, Sánchez-Pérez, Vaknin, Dicenta & Gradziel, 2005). Después de hidrolizar de 25 a 30 minutos y teñir con aceto-carmín 1%, se observaron al microcopio. Se anotaron las frecuencias de cada una de las fases del ciclo celular por cada hora de colección, luego de sistematizar esta información se obtuvo la mejor hora de pretramiento de las muestras mediante los cálculos de IF (índice de fase) y IM (índice mitótico). 2.3 Conteo cromosómico Las raíces meristemáticas fueron: pretratadas con agua destilada a 4 C durante al menos 24 horas, fijadas en etanol:ácido acético 3:1 durante 24 horas a 4 C y conservadas en etanol 70% a -20 C. Las raíces fijadas fueron lavadas con agua bidestilada e hidrolizadas de 25 a 30 minutos en HCl 1N a 60 C. Los botones florales en diferentes estadios, fueron pretratados en el lugar de colección y llevados al laboratorio para su fijación y conservación. Los ovarios, obtenidos de los botones florales, se lavaron una vez en etanol 99.6%, tres en etanol 70% y una en agua bidestilada, para ser hidrolizados en HCl 1N a 60 C durante 5 minutos. Los cromosomas mitóticos fueron obtenidos mediante la técnica convencional del squash de las raíces meristemáticas y ovarios, previamente teñidos con aceto carmín 1% y observadas en un microscopio invertido marca Lomo, adaptada una cámara digital de 20MPX. El procesamiento de las imágenes digitales fue realizado con el software RINCON Simple Image Analysis RESULTADOS Y DISCUSION La técnica descrita en este trabajo incrementa la calidad y el número de las imágenes para los conteos cromosómicos en raíz meristemática y botones florales para las dos especies analizadas del género Polylepis. El uso de temperarturas bajas durante largos periodos de tiempo, tuvo un efecto positivo tanto en el pretratamiento como en la fijación, logrando una mejor definición de

3 los cromosomas. La hidrólisis durante minutos provoca la separación de las células de una manera adecuada por el posterior conteo. Finalmente la tinción en aceto carmín 1% filtrado, produce los mejores resultados para la observación y el conteo de cromosomas, evitando la confusión con partículas del colorante Determinación de la hora de colección El protocolo mencionado permite también la observación de las células en diferentes estadios de la mitosis en raíces meristemáticas, lo que permite realizar estudios del ciclo celular y determinar la hora apropiada para el pretratamiento de las muestras. Al evaluar el índice de fase (IF) e índice mitótico (IM) parciales y totales, para un periodo de 12 horas, se estableció que la mejor hora para el pretratamiento de las muestras con inhibidores mitóticos es a las 08h30 (IM=67%). Durante los otros períodos de colección, los IM fueron bajos fluctuando entre el 20 y 30 % de la población celular. Al analizar el ciclo celular en su conjunto encontramos que la mitosis se desarrolla únicamente entre las 07h30 y 09h Conteo cromosómico Polylepis racemosa Se emplearon muestras de ovario y raíz meristemática de P. racemosa colectadas en la localidad de Oyacachi. El rango encontrado en las muestras de raíces meristemáticas fue de 2n = cromosomas y en botón floral 2n = cromosomas (Tabla 1; Figura 1). ESPECIE MUESTRA LOCALIDA D P. incana P. racemosa NO. CÉLULA S NO. CROMOSOMAS Raíz meristemática El Ángel 2 38(1), 40(1) Illinizas 23 38(11), 39(5), 40(4), 41(1), 42(2) Papallacta 25 39(2), 40(7), 41(9), 42(7) Ovario Papallacta 15 40(7), 41(3), 42(5) Raíz meristemática Oyacachi 25 69(9), 70(4), 71(3), (2), 74(3), 76(2), 78(1), 80(1) Ovario Oyacachi 2 72(1), 77(1) Tabla 1. Números cromosómicos somáticos de las especies P. incana y P. racemosa con detalle de muestra utilizada, localidad y número de células metafásicas analizadas. 2n Los individuos de P. racemosa, se encuentran localizados en los Andes Ecuatorianos excepto la provincia de Loja (Segovia, Quijia, Proaño, Soltis & Soltis, 2009), ésta es una especie introducida del Perú desde aproximadamente 20 años bajo el marco de planes de reforestación apoyados por el gobierno Central y Gobiernos Locales (Segovia et. al, 2009). Existe una alta variación en su número cromosómico sugiriéndonos la presencia de individuos poliploides, lo que concuerda con las hipótesis de poliploidía dentro del género. Además está alta variabilidad es un indicador de la respuesta adaptativa al medio, lo que estaría provocando la invasión de las especies naturales y en el futuro la pérdida de las mismas Polylepis incana El número cromosómico (2n) de P. incana, encontrado en muestras de ovarios de la localidad de Papallacta fue de 2n = cromosomas. En raíz meristemática, se analizaron 3 localidades: en Illinizas se obtuvo un rango de 2n = cromosomas, en Papallacta 2n = cromosomas y en El Ángel de 2n = cromosomas (Tabla 1; Figura 2).

4 Figura 1 Cromosomas metafásicos de P. racemosa en muestras de raíz meristemática (a: fotografía, a1: conteo 2n=78) y ovario (b: fotografía, b1: conteo 2n=76) colectadas en la localidad de Oyacachi. Barra representa 5 μm Figura 2. Cromosomas metafásicos en muestras de raíz meristematica de P. incana de tres localidades: El Ángel (a: fotografía, a1: conteo 2n=40); Los Illinizas (b: fotografía, b1: conteo 2n=42) y Papallacta (c: fotografía, c1: conteo 2n=42). Barra representa 5 μm. La baja variación en el número cromosómico en P. incana (Tabla 1), sugiere que no existe diferencias entre los individuos dentro de cada población lo que concuerda con los datos de porcentaje de variación dentro de las poblaciones (32,48%). Los resultados del análisis de varianza molecular realizado por Ochoa, Segovia, Jiménez & Proaño, 2008 en poblaciones de P. incana de los Illinizas y Papallacta, evidencian la falta de respuesta adaptativa al medio que se presenta en los bosques analizados (Ochoa et al, 2008). Estos datos son similares a los obtenidos en A. magellanica, especie del género Acaena, el cual está estrechamente relacionado al género Polylepis. A. magellanica presenta un número diploide de 2n = 42 (Roulet, 1981; Marticorena & Cavieres, 2000). Esto nos permite concluir que las especies basales de Polylepis y las especies de Acaena solo comparten caracteres morfológicos (Simpson, 1979) y no los citológicos, aunque al parecer las dos provendrían del un número base x=7, característico de la tribu Sanguisorbeae, al cual pertenecen (Pérez, 2004). La variación presentada en los números cromosómicos de las dos especies nos confirma, por primera vez, la presencia de poliploidía en el género Polylepis, lo cual estaría indicando la importancia de los cambios cromosómicos numéricos en la diversificación de las especies. En el futuro, sería interesante estudiar los cromosomas de un mayor número de poblaciones, intentar establecer las relaciones entre los niveles de ploidía y su localización geográfica o hábitat. Además, sugerir modelos evolutivos para las especies de este género cuyo rol ecológico es fundamental para el ecosistema en donde habita.

5 4. CONCLUSIONES El protocolo presentado en este trabajo es ideal para la obtención de imágenes de buena calidad para el conteo cromosómico, ya que permite obtener cromosomas individualizados y evita la aparición de partículas del colorante que pueden confundirse con los mismos. La hora apropiada para la recolección y pretratamiento de las muestras con agentes mitóticos es a las 08h30, donde se presentó el más alto índice mitótico IM=67%. No existe una alta variación en los números cromosómicos entre los individuos de una misma población (P. incana, Illinizas 2n = 37 42), lo que sugiere que en dichas poblaciones no se esta generando una respuesta adaptativa al medio. Sin embargo, existe una alta variación en el número cromosómico de P. racemosa que sugiere la presencia de individuos poliploides intraespecíficos y su alta respuesta adaptativa al medio. Los números cromosómicos presentados en este trabajo son los primeros para el género Polylepis los cuales constituyen la base para futuros estudios genéticos y de conservación y manejo. 6. AGRADECIMIENTOS A la Escuela Politécnica del Ejército, Carrera de Ingeniería en Biotecnología por el apoyo para el desarrollo de esta investigación. A la M.Sc. Claudia Segovia por su valioso y constante asesoramiento. REFERENCIAS Bucher, E., & Schofield, C., (1981) Economic assault on chagas disease, New Scientist 81: Jameson, S. J., & P. R., Ramsay, (2007). Changes in high-altitude Polylepis forest cover and quality in the Cordillera de Vilcanota, Peru Biological Conservation 138: Kessler, M., & S., Herzog, (1998) Conservation status in Bolivia of timberline Habitat, elfin forest and theirs birds. Cotinga, 10: Kessler, M., & A. N., Shmidt-Lebuhn, (2006). Taxonomical and distributional notes on Polylepis (Rosaceae). Organisms, Diversity and Evolution, 6, Marticorena, A. E., & Cavieres, L. A. (2000). Acaena magellanica (Lam.) Vahl (Rosaceae). Guyana Botánica, 57(1). Martínez-Gómez, P., Sánchez-Pérez, R., Vaknon, Y., Dicenta, F. & T., Gradziel, Improved technique for counting chromosomes in almond. Scientie Horticulture 105: Ochoa, V., Segovia-Salcedo, C., Jiménez, P. & K., Proaño. (2008). Genética Poblacional de P. pauta y P. incana en el páramo de Papallacta y los Illinizas mediante ISSRs. Tesis de grado. Pérez, J. (2004). Rosaceae-Sanguisorbeae de macaronesia: géneros Marcetella, bencomia y dendriopoterium. Palinología, Biogeografía, sistemas sexuales y filogenia. Bot. Macaronesica, 25, Roulet, M. (1981). Contribution à l'etude du genre Acaena L. (Rosaceae) danns les Andes argentines et chiliennes. Bulletin de la Société Neuchâteloise de Sciences Naturelles, 104, Segovia- Salcedo, M. C., Quijia, P., Proaño, K., Soltis, P., & Soltis, D. (2009). La desaparición de los bosques de Polylepis (Rosaceae: Rosoideae: Sanguisorbeae) en el Ecuador: Hibridización y sus implicaciones para la conservación y manejo (II Congreso mundial de Páramos PARAMUNDI, vida en las alturas). Schmidt-Lebuhn, A. N., Kumar, M. & M., Kessler, (2006). An assessment of the genetic population structure of two species of Polylepis in the Chilean Andes. Flora 201: Schmidt-Lebuhn A. N., Seltmann, P. & M., Kessler, (2007). Consequences of the pollination system on genetic structure and pattern of species distribution in the Andean genus Polylepis (Rosaceae): a comparative study. Plant Systematic and Evolution 266: Talledo, D., Escobar, B. & V., Alleman, (1995). El ciclo celular en vegetales; su estudio, importancia y aplicaciones. Biotempo V:2 (2): 13-31