División de Oceanología, Departamento de Acuicultura. (2) División de Física Aplicada, Departamento de Óptica,

Transcripción

1 Identificación de Cromosomas Homólogos Mediante Correlación Digital de Patrones de Difracción Cristian Gallardo Escárate 1,2, Josué Álvarez-Borrego 2, Miguel Ángel del Río Portilla 1 y Vitaly Kober 3. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada. Km 107 Carretera Tijuana Ensenada, Código Postal Ensenada, B.C. México. (1) División de Oceanología, Departamento de Acuicultura. (2) División de Física Aplicada, Departamento de Óptica, (3) Depto. de Ciencias de la Computación gallardo@cicese.mx, josue@cicese.mx, midelrio@cicese.mx, vkober@cicese.mx RESUMEN El estudio citogenético aborda la identificación de cromosomas homólogos, es decir los cromosomas aportados por la vía paterna y materna respectivamente. El presente estudio plantea una nueva metodología de reconocimiento de cromosomas homólogos mediante correlación digital de patrones de difracción equivalente al modulo al cuadro de la transformada de Fourier. Para probar la utilización de correlación digital de cromosomas homólogos se utilizó como material de estudio, placas metafásicas provenientes de larvas de abulón rojo del Pacífico, Haliotis rufescens. A través de la correlación digital fue posible identificar 18 pares de cromosomas homólogos en el abulón rojo del Pacifico Haliotis rufescens. El cariotipo muestra ocho pares de cromosomas metacéntricos, nueve pares submetacéntricos y un par cromosómico subtelocéntrico. El presente estudio plantea la utilización de patrones de difracción para la identificación de cromosomas en distintos tipos de organismos. INTRODUCCIÓN A través del análisis citogenético, es posible describir las características de los cromosomas de un organismo. En este sentido, el establecimiento de la identidad cromosómica es el primer paso para los estudios de mapeo genómico, los cuales pueden ser utilizados en análisis taxonómicos, dado que cada especie posee un cariotipo distintivo, en términos de número y morfología de los cromosomas. De igual forma es posible utilizar los análisis citogenéticos para estudiar enfermedades derivadas de anomalías cromosómicas (Gersen & Keagle, 1999). Los cromosomas son reconocidos como portadores de ADN en eucariontes, dado que proveen la base estructural para la transmisión de la información genética. Las características morfológicas de los cromosomas han sido estudiadas con microscopía de alta resolución aunado a tinciones especificas de ADN. Características morfológicas comunes, como constricción primaria (centrómero) en diferentes posiciones a lo largo del cromosoma ha permitido la identificación y clasificación cromosómica (Appels et al., 1998). Sin duda una de las mayores problemáticas en citogenética es la identificación de cromosomas homólogos (par cromosómico aportado por ambos parentales). Dicha identificación es posible realizarla por mediciones morfológicas de los brazos cromosómicos, además de la utilización de tinciones especificas (patrones de bandeo). La utilización de análisis de imagen permite obtener un filtro compuesto, construido con base en las distintas variaciones morfológicas que pueden producirse durante el proceso citogenético. Metodologías como correlación digital se plantean como una nueva herramienta para el análisis cromosómico en distintos organismos. El objetivo del presente estudio es utilizar procedimientos de correlación digital de patrones de difracción para la identificación de cromosomas homólogos. 65V03-1

2 MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de cromosomas Imágenes cromosómicas fueron obtenidas desde placas metafásicas en larvas de abulón rojo del Pacifico, Haliotis rufescens 24 hrs. post-fertilización. Las larvas fueron seleccionadas y transferidas a una solución de 0.005% de colchicina durante 3-4 Hrs. Después del tratamiento antimitótico las muestras fueron colocadas en una solución hipotónica al 50% en agua destilada durante 45 min. Al término del tratamiento hipotónico las muestras fueron fijas en solución Carnoy (3:1, metanol: ácido acético). Para la obtención de placas metafásicas, disociaciones celulares de las muestras fijadas fueron goteadas sobre una platina a 45ºC y posteriormente dejadas secar al aire. Imágenes cromosómicas Las imágenes cromosómicas fueron obtenidas desde placas metafásicas sin teñir. Las mejores placas fueron digitalizadas con frame gabber de 24-bit (modelo CG-7, Scion Corp) usando una microscopio de contraste de fases marca Zeizz, modelo Axiolab y equipado con una cámara video RGB modelo 1040, marca COHU. Las imágenes citogenéticas fueron preprocesadas para la eliminación de ruido, mejora de contraste y conversión de RGV a escala de grises, mediante filtros morfológicos según Kober et al. (2002). La identificación de cromosomas homólogos fue desarrollada mediante correlación digital. Después de la identificación de los cromosomas homólogos, se determino la morfometría de los cromosomas mediante el software Image Pro-Plus software versión 4.0 (Copyright Media Cybernetics). Las mediciones de los cromosomas fueron utilizadas para realizar una análisis cariotípico. a b Figura 1. Imagen cromosómica de abulón rojo del Pacifico, Haliotis rufescens. a) Imagen original obtenida a través del CCD. b) Imagen pre-procesada. 65V03-2

3 + Filtro parabólico F 2 ( w, w Y ) F 2 ( w, w ) X X Y fn( x, y) Correlación Digital F ( w, w Y ) X RESULTADOS 2 Ordenamiento aleatorio Figura 2. Proceso de correlación digital para la identificación de cromosomas homólogos. La figura 1 muestra el resultado del pre-procesamiento de las imágenes utilizadas para el estudio. Mediante la aplicación de correlación digital de patrones de difracción fue posible identificar los 18 pares de cromosomas homólogos en el abulón rojo del Pacifico Haliotis rufescens (Figura 2). Las observaciones de imágenes cromosómicas permitió establecer un número diploide de 36 cromosomas. Los valores medios de las longitudes relativas y longitudes totales de los cromosomas se muestran en la Tabla 1. La razón de las longitudes de los brazos cromosómicos, indica que esta especie posee 8 pares de cromosomas metacéntricos (Cromosomas Nº 1, 3, 6, 7, 14, 15, 17 y 18), nueve pares submetacéntricos (Nº 2, 5, 4, 8, 9, 10, 11, 12 y 13) y un par de cromosomas subtelocéntrico (Nº 16) (Figura 3). Los pares 17 y 18 fueron difíciles de identificar usando solo características morfológicas debido al traslape de las desviaciones estándar. DISCUSIÓN La mayoría de los estudios citogenéticos disponibles hasta ahora, establecen las diferencias cromosómicas a partir del análisis cariológico clásico. Los cromosomas son clasificados cualitativamente en categorías (metacéntrico, submetacéntrico, subtelocéntrico y telocéntrico) con base en la relación de la longitud entre el brazo largo y brazo corto de cada par cromosómico (Levan et al., 1964). Este método separa la variación continua de la posición del centrómero en clases discretas, no considera el tamaño absoluto de cada cromosoma. Este procedimiento considera diferentes a pares cromosómicos similares que caen en distintas clases cualitativas o considera iguales a pares que, siendo distintos caen dentro de la misma categoría. Estas variaciones morfológicas debidas al grado de condensación del ADN en los cromosomas pueden originar errores en la identificación adecuada del cariotipo de una especie o individuo. Lo anterior ha hecho necesario la búsqueda de modificaciones a la metodología clásica propuesta por Levan et al. (1964) y de nuevos procedimiento de identificación y clasificación cromosómica. 65V03-3

4 La utilización de análisis de imágenes para estudiar distintos aspectos citogenéticos reduce el error ocasionado por las mediciones manuales, al permitir realizar aproximaciones más cuantitativas y detalladas de la naturaleza morfológica de los cromosomas (Schrock et al., 1996). El análisis propuesto en el presente estudio plantea la utilización del modulo al cuadrado de la transformada de Fourier (proporcional al patrón de difracción) de imágenes digitales como el punto de partida para la identificación de los aspectos citogenéticos de interés. Esta metodología es una alternativa a los métodos tradicionales de identificación cromosómica con base en mediciones morfológicas y tinciones especiales. El próximo paso en la aplicación de metodologías de correlación digital es integrar técnicas invariantes, es decir, técnicas que reconocen como idénticos a objetos iguales a pesar de tener cambios de posición, escala, rotación, entre otras. Sin embargo el procesamiento invariante es una tarea difícil y motivo por el cual, las técnicas encaminadas a resolver este problema son variadas (Zavala-Hamz & Álvarez-Borrego, 1996; Zavala-Hamz & Álvarez-Borrego, 1997; Pech Pacheco et al., 1998; Castro-Longoria et al., 2001; Pech Pacheco et al., 2001; Pech Pacheco et al., 2002; Kober et al., 2002; Álvarez-Borrego et al., 2002; Álvarez-Borrego & Castro-Longoria, 2003: Pech Pacheco et al., 2003). Tabla 1. Longitud relativa (LR) y longitud total (LT) de cromosomas in Haliotis rufescens. M, metacéntrico; SM, submetacéntrico; ST, subtelocéntrico. Cromosoma LR (%) LT (µm) Tipo ± ± M ± ± SM ± ± M ± ± SM ± ± SM ± ± M ± ± M ± ± SM ± ± SM ± ± SM ± ± SM ± ± SM ± ± SM ± ± M ± ± M ± ± ST ± ± M ± ± M 65V03-4

5 AGRADECIMIENTOS Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, proyecto CONACYT B Procesado e Identificación de Partículas Biogénicas. LITERATURA CITADA Alvarez-Borrego, J. & E. Castro-Longoria (2003). Discrimination between Acartia (Copepoda: Calanoida) species using their diffraction pattern in a position, rotation invariant digital correlation. Journal of Plankton Research. 25(2): Alvarez-Borrego, J., M.-P. Reyna, R., G. Cristóbal & J. Pech-Pacheco (2002). Invariant optical color correlation for recognition of Vibrio cholerae 01. Optical Engineering. 41(4): Appels, R., R. Morris, B. Gill & C. May (1998). Chromosome Biology. New York, Kluwer Academic Publishers.pp V03-5