TEMA 14. ACIDOS NUCLEICOS: QUIMICA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS. ESTRUCTURA DE ADN.

Transcripción

1 TEMA 14. ACIDS UCLEICS: QUIMICA DE LS ACIDS UCLEICS. ESTRUCTURA DE AD.

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3 5 3

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5 idrólisis alcalina suave de AR C 2-2 C - C 2 - C C C C C C 2 C 2-2 C C 2-2 C C C 2 - C

6 Mecanismo de la ribonucleasa

7 suave idrólisis ácida suave de AD

8 Síntesis de AD (máquinas de genes 100 a 200 nucleótidos) aso 1: a) rotección de desoxirribonucleósidos rotección de bases nitrogenadas Bases protegidas A(Benzoílo) G(Isobutirilo) C(Benzoílo) T (no requiere protección) a ) rotección de nucleósidos terminales y de elongación rotección del grupo 5 libre con p-dimetoxitritilo (DMT) C 3 C 3 C 2 Base C 2 Base C 3 CC 2 C 2 C terminal 2 C C 3 2 C 2 C (i-r) 2 Intermedio

9 aso 1: b) Unión a a resina rotección del grupo 5 libre con p-dimetoxitritilo (DMT) Unión a la fase sólida mediante un linker en el extremo 3 C 3 C 3 C 2 Base Res Si(C 2 ) 3 2 C 2 Base C 3 CC 2 C 2 C 2 C 3 CC 2 C 2 C(C 2 ) 3 Si Res

10 aso 2: a) Desprotección del 5 -hidroxilo Tratamiento con ácido dicloroacético en C 2 Cl 2 (reacción S 1 rápida y cuantitativa por generarse un carbocatión dimetoxitritilo, terciario y triplemente bencílico) C 3 C 2 Base C 2 Base CCl 2 C/ C 2 Cl 2 CC 2 C 2 C(C 2 ) 3 Si Res C 3 CC 2 C 2 C(C 2 ) 3 Si Res + C 3 C 3

11 aso 3: a) Acoplamiento ucleósido protegido con grupo fosforoamidito en posición 3 se une al 5 -hidrolxilo unido a la resina. Se realiza en solvente apróticos polares (Acetonitrilo) y se usa la amina heterocíclica tetrazol como catalizador. El esta activado con un buen grupo saliente (Diisopropilamino) El producto es un trailquil fósforo, (R) 3, o fosfito protegido por un grupo β-cianoetilo en uno de los átomos de oxígeno C 3 C 3 C 2 Base C 2 Base C C 3 2 C 2 C + (i-r) 2 C 3 C C C 3 2 C 2 C C 2 Base C 2 Base + (i-r) 2 C Res C Res Rend. 99%

12 aso 4: a) xidación xidación del fosfito producido por el acoplamiento a fosfato En TF acuoso en presencia de 2,6-Dimetilpiridina C 3 C 2 Base DMT C 2 Base C C 3 2 C 2 C C 2 Base I 2 2,TF 2,6-Dimetilpiridina C 2 C 2 C C 2 Base C Res C Res

13 aso 5: a) Elongación Repetición del ciclo desprotección, acoplamiento y oxidación hasta obtener el oligonucleótido deseado b) Desprotección final Todas las reacciones de desprotección son simultáneas por tratamiento con 3 acuoso. Se continúa con la purificación por electroforesis DMT C 2 Base C 2 Base C 2 C 2 C oligonucleótido oligonucleótido C 2 Base C 2 Base C Res

14 Resumen

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21 Conformación de desoxirribosa Apareamiento de bases Giro a derechas Conformación del enlace glicosídico anti

22 Conformación de desoxirribosa Apareamiento de bases Giro a derechas Conformación del enlace glicosídico anti

23 Conformación de desoxirribosa irimidinas urinas Apareamiento de bases Giro a izquierdas Conformación del enlace glicosídico

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25 Secuencias que adoptan estructuras inusuales Secuencias palindrómicas: regiones de AD de doble hebra con secuencias de bases que se repiten en forma invertida entre ambas cadenas presentando doble simetría Son potenciales formadoras de: orquillas (AD simple hebra y AR) Estructuras cruciformes (AD duplex)

26 Secuencias que adoptan estructuras inusuales Repeticiones espejadas: regiones de AD de doble hebra que no tienen secuencias complementarias en la misma cadena. Se encuentran en moléculas de AD largas (varios miles e pares de bases)

27 Estructuras de 3 o 4 hebras: AD triplex y AD cuadruplex AD triplex: se presenta en segmentos polipirimidinicos y polipurunicos Apareamientos de bases Apareamiento de oogsteen Apareamiento de Watson y Crick Apareamiento de oogsteen Apareamiento de Watson y Crick aralelas Las hélices triplex son más estables a p ácido porque C tiene que estar protonada C + (pka en la hebra 7,5, pka normal 4,2) Antiparalelas

28 -AD: élice triplex en trayectos polipirimidina o polipurina Con repeticiones espejadas Repetición espejada (pertenece a la misma hebra)

29 AD cuadruplex En secuencias con alta proporción de Guanina osibles orientaciones de las hebras

30 Desnaturalización Las soluciones de AD nativo son muy viscosas a p 7 y 25ºC rápido lento Al aumentar temperatura o variar el p a situaciones extremas la viscosidad decrece abruptamente

31 Densidad de flotación

32 Efecto hipercrómico: Aumento de absorbancia a 260 nm que manifiesta una estructura bicatenaria al perder su estructura nativa o plectonémica

33 Estimación del porcentaje de pares de bases en función de la magnitud del efecto hipercrómico

34 Temperatura media de fusión: Temperatura a la cual se alcanza el 50 % de desnaturalización

35 Tm y complejidad del AD AD parcialmente desnaturalizado Las flechas indican regiones ricas en A=T

36 Estimación del porcentaje de pares de bases en función de Tm

37 ibridación de AD

38 BIBLIGRAFÍA -RGAIC CEMISTRY. 2da. Edition.G.Marc LUD. Editorial Benjamin -RGAIC CEMISTRY. J. Mc MURRY. 3ra Edición1994. Ed Interamericana -QUIMICA RGAICA. Francis Carey 3 Edicion1999. Ed. Mc Grawill. -RGAIC CEMISTRY J. Clayden,. Greeves, S. Warren, and. Wothers, 2000.xford University ress. -BICEMISTRY. Lubert STRYER 3 Edition Ed. Freemon -BIRGAIC CEMISTRY ermann Dugas. 3rd Edition SpringerVerlang -BIQUÍMICA. D.yJ. Voet Ed. mega -BIQUIMICA. Albert L. LEIGER. 2da. Ed. Ediciones mega -RICIIS DE BIQUIMICA. Albert L. LEIGER. Ediciones mega -BIQUIMICA. Mathews, C and Van olde, K E. Ed. McGraw-ill Interamericana. Segunda edición QUIMICA RGAICA. ESTRUCTURA Y FUCI. Vollhardt, and Schore,. Ed. mega. 3ra Edición, 2000.