DiaSorin S.p.A. Via Crescentino snc Saluggia (Vercelli) - Italy LIAISON Anti-HBs II (310220), Anti-HBs II Plus (310230)

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1 DiaSorin S.p.A. Via Crescentino snc Saluggia (Vercelli) - Italy LIAISON Anti-HBs II (310220), Anti-HBs II Plus (310230) 1. FINALIDAD DEL ENSAYO El ensayo LIAISON Anti-HBs II emplea la tecnología de la quimioluminiscencia (CLIA) en un ensayo inmunológico para la determinación cuantitativa de los anticuerpos dirigidos contra el antígeno de superficie de la hepatitis viral B (anti-hbs) en muestras de suero o plasma humano. El ensayo debe realizarse en la serie de instrumentos LIAISON. 2. SUMARIO Y EXPLICACIÓN DEL TEST La hepatitis es una enfermedad inflamatoria con etiología tanto no infecciosa como infecciosa, bacteriana o viral, que puede causar daños severos al hígado. La hepatitis viral B es endémica en todo el mundo (2). La infección se propaga sobre todo por vía parenteral, por ejemplo mediante transfusiones de sangre o hemoderivados no controlados para la presencia de HBV, o bien por el uso comunitario de agujas entre drogadictos (1, 18). El virus de la hepatitis B (HBV) se encuentra también en prácticamente todos los líquidos biológicos humanos y puede propagarse mediante el contacto genital. El virus HBV puede ser transmitido también de la madre al hijo por vía perinatal (17). El período de incubación de la hepatitis viral B es de 90 días en promedio (entre 40 y 180 días). Entre los síntomas más comunes se encuentran el agotamiento, la fiebre, la gastroenteritis y la ictericia. La infección por HBV puede causar las siguientes condiciones patológicas: (a) hepatitis ictérica; (b) hepatitis anictérica subclínica; (c) hepatitis fulminante; (d) hepatitis crónica activa o persistente (7). Más del 90% de los pacientes adultos con hepatitis B se recupera completamente de la enfermedad aguda, aproximadamente el 1% muere de hepatitis fulminante y aproximadamente el 6-10% se vuelve portador crónico activo o persistente (10, 15). El diagnóstico de la hepatitis B se ha basado en la detección de los marcadores serológicos, que ayuda a determinar la presencia de infección por HBV pasada o presente, la fase aguda o crónica de la enfermedad, la respuesta a la terapia y/o el estado inmunitario del paciente (4). El HBsAg es detectable en la circulación antes del comienzo de la enfermedad sintomática y durante toda la fase clínica de la enfermedad. Después de la enfermedad clínica, el título de HBsAg comienza a disminuir paulatinamente hasta llegar a unos valores inferiores al nivel de detección. Después de la desaparición del HBsAg del suero, aparecen los anticuerpos anti-hbs, aunque a menudo existe un intervalo llamado el período de ventana inmunológica de la infección entre la desaparición del HBsAg y la aparición del anti-hbs (seroconversión). En el 10% de los pacientes aproximadamente, el HBsAg persiste en el suero por toda la vida y los anticuerpos anti-hbs no aparecen; esto indica un estado de portador crónico (9). La presencia de anticuerpos anti-hbs en el suero indica la pasada exposición de un sujeto al virus de la hepatitis B y la inmunidad duradera adquirida (13). Sin embargo, los títulos bajos de anticuerpos anti-hbs pueden indicar la falta de inmunidad hacia futuras infecciones por HBV. Por consiguiente, la detección de los anticuerpos anti-hbs es fundamental para determinar la completa remisión de la infección y la adquisición de la inmunidad tanto de tipo natural (debida a la infección por HBV), como en respuesta a la vacuna. La amplia disponibilidad de las vacunas basadas en HBsAg de origen humano o recombinante (6, 14, 16) ha evidenciado la necesidad de cuantificar exactamente la respuesta de anticuerpos (3, 5): el ensayo de los anticuerpos anti-hbs en los vacunados es esencial para determinar la duración de la protección otorgada por el ciclo de vacunación y la necesidad de inoculaciones de refuerzo (8, 11, 12). El ensayo de los anticuerpos anti-hbs también es crucial para identificar a los individuos susceptibles a la infección por HBV en el estudio de las categorías que corren más riesgos y que hay que someter a vacunación. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El método para la determinación cuantitativa de anticuerpos anti-hbs es un ensayo directo, a dos sitios (sandwich), basado en el principio de la quimioluminiscencia (CLIA). El antígeno HBsAg recombinante (subtipos ad y ay) se emplea para recubrir las partículas magnéticas (fase sólida) y el antígeno HBsAg humano está enlazado a un derivado del isoluminol (conjugado antígeno HBs-isoluminol). Durante la incubación, los anticuerpos anti-hbs presentes en los calibradores, en las muestras o en los controles enlazan la fase sólida y el antígeno HBs conjugado, formando así un sandwich. Después de la incubación, se elimina el material no enlazado mediante un ciclo de lavado. A continuación, se añaden los reactivos starter que inducen una reacción de quimioluminiscencia. La señal luminosa, y por lo tanto la cantidad de conjugado antígeno HBs-isoluminol, se mide con un fotomultiplicador en unidades relativas de luz (RLU, relative light units) e indica la concentración de anticuerpos anti-hbs presente en los calibradores, en las muestras o en los controles. 41 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

2 4. MATERIALES SUMINISTRADOS Integral de reactivos Partículas magnéticas (2,3 ml) Calibrador 1 (2,0 ml) Calibrador 2 (2,0 ml) Conjugado (11 ml) Diluyente de muestras (28 ml) Partículas magnéticas recubiertas con HBsAg obtenido en Hansenula polymorpha con la tecnología del DNA recombinante (subtipos ad y ay equilibrados), albúmina sérica bovina, tampón PBS, < 0,1% azida sódica. Suero/plasma humano que contiene bajos niveles de anticuerpos anti-hbs, suero fetal bovino, EDTA, 0,2% ProClin 300, conservantes. Las concentraciones de los calibradores (mui/ml) son calibradas contra el Segundo Estándar Internacional para Inmunoglobulinas humanas anti-antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (anti-hbs) de la Organización Mundial de la Salud, OMS (NIBSC code: 07/164, 2008). Suero/plasma humano que contiene niveles bajos de anticuerpos anti-hbs, suero fetal bovino, EDTA, 0,2% ProClin 300, conservantes y un colorante azul inactivo. Las concentraciones de los calibradores (mui/ml) son calibradas contra el Segundo Estándar Internacional para Inmunoglobulinas humanas anti-antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (anti-hbs) de la Organización Mundial de la Salud, OMS (NIBSC code: 07/164, 2008). HBsAg de origen humano tratado mediante calentamiento (subtipos ad y ay equilibrados), conjugado con un derivado del isoluminol, albúmina sérica bovina, tampón PBS, EDTA, 0,2% ProClin 300, conservantes y un colorante rojo inactivo. Suero/plasma humano, EDTA, 0,2% ProClin 300, conservantes y un colorante azul inactivo (solo para LIAISON Anti-HBs II Plus, código ). Número de ensayos 100 Todos los reactivos se suministran listos para su uso. El orden de los reactivos refleja el orden con el que se han ensamblado los contenedores en el integral de reactivos. Materiales requeridos, pero no suministrados Instrumentos LIAISON XL Instrumentos LIAISON LIAISON XL Cuvettes (código X0016). LIAISON Module (código ). LIAISON XL Disposable Tips (código X0015). LIAISON XL Starter Kit (código ). LIAISON Starter Kit (código ) o LIAISON XL Starter Kit (código ). LIAISON Light Check (código ). LIAISON Wash/System Liquid (código ). LIAISON Wash/System Liquid (código ). LIAISON XL Waste Bags (código X0025). LIAISON Waste Bags (código ). LIAISON Cleaning Kit (código ). Otros materiales requeridos Controles LIAISON Anti-HBs II (negativo y positivo) (código ). 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Sólo para uso diagnóstico in vitro. Todas las unidades de suero y plasma utilizadas para la fabricación de los componentes de este kit se han analizado y se han encontrado no reactivas para la presencia de HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1 y anti-hiv-2, excepto el conjugado, que es reactivo para HBsAg. El antígeno de superficie del virus de la hepatitis B ha sido tratado mediante calentamiento (60 C por 10 horas) durante el proceso productivo. A pesar de ello, no es seguro que la inactivación sea completa. Sin embargo, visto que ningún método de análisis puede asegurar que los agentes patógenos estén ausentes, todo el material de origen humano se deberá considerar potencialmente infeccioso y manipularlo como tal. 6. NORMAS DE SEGURIDAD No coma, beba, fume o se maquille durante la ejecución del ensayo. No pipetee las soluciones con la boca. Evite el contacto directo con el material potencialmente infeccioso usando batas de laboratorio, gafas de protección y guantes desechables. Lávese cuidadosamente las manos al terminar el ensayo. Evite salpicaduras o formación de aerosoles. En caso de que esto sucediera, cada gota de reactivo se debe eliminar con una solución de hipoclorito sódico al 5% y el medio utilizado se deberá tratar como material residuo potencialmente infeccioso. Todas las muestras, los reactivos biológicos del kit y los materiales usados para efectuar el ensayo se deben considerar capaces de transmitir agentes infecciosos; por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país. El material desechable deberá ser incinerado; los residuos líquidos deberán ser descontaminados con una solución de hipoclorito sódico a una concentración final del 5% durante media hora como mínimo. Cualquier material que pueda ser reutilizado deberá ser tratado en autoclave con un tratamiento de exceso (overkill) (USP 24, 2000, p. 2143). Generalmente se considera que una hora a 121 C es un tiempo de esterilización adecuado; sin embargo se recomienda a cada usuario que verifique la eficacia del ciclo de descontaminación mediante una validación inicial y el uso rutinario de indicadores biológicos. Los reactivos que contienen ProClin 300 se clasifican como irritantes según las Directivas Europeas aplicables: R 43 - Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. S 24 - Evítese el contacto con la piel. S 37 - Úsense guantes adecuados. S 60 - Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. 42 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

3 7. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS INTEGRAL DE REACTIVOS Observe escrupulosamente las siguientes precauciones importantes para manipular los reactivos: Resuspensión de las partículas magnéticas Las partículas magnéticas deben estar completamente resuspendidas antes de colocar el integral en el instrumento. Siga los pasos indicados a continuación para garantizar la suspensión completa de las partículas: Antes de quitar la protección de los contenedores, gire hacia adelante y hacia atrás la ruedecilla dentada situada por debajo del contenedor de las partículas magnéticas hasta que la suspensión adopte una coloración morena. Agite horizontalmente el integral de reactivos con delicadeza y sumo cuidado para favorecer la suspensión de las partículas magnéticas (evite la formación de espuma). Controle visualmente el fondo del contenedor de las partículas magnéticas para cerciorarse de que no hayan quedado partículas magnéticas sedimentadas. Seque con sumo cuidado la superficie de cada pared para eliminar el líquido residual. Si es necesario, repita el procedimiento hasta la completa resuspensión de las partículas magnéticas. Formación de espuma en los reactivos Para garantizar las mejores prestaciones del integral, se recomienda evitar la formación de espuma en los reactivos. Observe las recomendaciones siguientes para evitarla: Antes de usar el integral, controle visualmente los reactivos, especialmente los calibradores (situados en la segunda y tercera posición del integral, después del contenedor de las partículas magnéticas) para excluir la presencia de espuma. Si se observa la presencia de espuma después de la resuspensión de las partículas magnéticas, coloque el integral en el instrumento y deje que se disuelva la espuma. El integral está listo para el uso cuando se ha dejado descansar en el instrumento, las partículas magnéticas han sido mantenidas en agitación automática y se ha disuelto la espuma. Cargar el integral en el área de los reactivos del instrumento Instrumentos LIAISON Coloque el integral de reactivos en el área de los reactivos del instrumento con la etiqueta de los códigos de barras situada a la izquierda y déjelo agitar durante 30 minutos antes del uso. Durante este tiempo las partículas magnéticas serán mantenidas en agitación automáticamente para garantizar una resuspensión completa. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para cargar las muestras e iniciar el ensayo. Instrumentos LIAISON XL El instrumento LIAISON XL está dotado de un dispositivo magnético interno que favorece la dispersión de las micropartículas antes de colocar un integral de reactivos en el área de los reactivos del instrumento. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para los detalles técnicos. a. Coloque el integral de reactivos en la ranura específica. b. Deje descansar el integral de reactivos en el dispositivo magnético por al menos 30 segundos (hasta varios minutos). Si es necesario, repita la operación. Luego coloque el integral de reactivos en el área de los reactivos del instrumento con la etiqueta situada a la izquierda y déjelo agitar durante 15 minutos antes del uso. Durante este tiempo las partículas magnéticas serán mantenidas en agitación automáticamente para garantizar una resuspensión completa. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para cargar las muestras e iniciar el ensayo. CONTROLES Hágase referencia a las instrucciones del juego de controles LIAISON Anti-HBs II para preparar y manipular los controles. 8. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DEL INTEGRAL DE REACTIVOS Sellado: Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. Abierto en el instrumento o a 2-8 C: estabilidad durante ocho semanas. Use siempre el mismo instrumento LIAISON para un integral de reactivos ya abierto. Use las gradillas suministradas con el instrumento LIAISON para la conservación del integral de reactivos en posición vertical. No congele. Mantenga el integral de reactivos en posición vertical durante la conservación para facilitar la resuspensión de las partículas magnéticas. Mantenga protegido de la luz directa. 9. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El ensayo se puede efectuar en muestras de suero o plasma humano. Se pueden utilizar anticoagulantes como el citrato, el EDTA y la heparina. El ensayo efectuado en muestras de plasma obtenido con citrato ha demostrado una disminución de la señal, que provoca una subestimación de los resultados (del 20% aproximadamente). Recoja la sangre mediante punción venosa, déjela coagular y separe el suero del coágulo lo antes posible. Clarifique por filtración o centrifugación antes del ensayo las muestras que presenten material en suspensión, opalescencia, lipemia o residuos eritrocitarios. No use muestras fuertemente hemolizadas o lipémicas, ni muestras que presenten material suspendido o evidente contaminación microbiana. Elimine las eventuales burbujas de aire que pueda haber antes del ensayo. Si el ensayo se lleva a cabo dentro de los siete días sucesivos a la recogida, las muestras se pueden conservar a 2-8 C. En caso contrario, se deben subdividir en alícuotas congeladas a 20 C o a temperaturas inferiores. Si las muestras han sido descongeladas, agítelas con cuidado antes de realizar el ensayo. Ocho muestras de diferente reactividad se han guardado durante siete días a 2-8 C, y diez muestras se han sometido a cuatro ciclos de congelación y descongelación. Los resultados no han presentado diferencias significativas. El volumen mínimo de muestra necesario es 300 μl (150 μl de muestra μl de volumen muerto). 43 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

4 10. CALIBRACIÓN El ensayo de los calibradores específicos contenidos en el integral de reactivos permite ajustar la curva predefinida memorizada por el fabricante en las unidades relativas de luz (RLU = relative light units) detectadas. Con una solución de los calibradores es posible realizar cuatro calibraciones. La calibración debe realizarse en triplicado cada vez que se verifique al menos una de las siguientes condiciones: Se usa un nuevo lote de reactivos starter. La calibración anterior fue realizada más de cuatro semanas antes. Se usa un nuevo lote de integral de reactivos. El instrumento ha sufrido una intervención de asistencia técnica. Los valores de los controles están fuera de los rangos esperados. Instrumentos LIAISON : Los valores de los calibradores están almacenados en los códigos de barras de la etiqueta del integral. Instrumentos LIAISON XL: Los valores de los calibradores están almacenados en el Tag para identificación de radiofrecuencia (Radio Frequency IDentification transponder, RFID Tag). 11. PROCEDIMIENTO OPERATIVO Para obtener unas prestaciones analíticas ideales hay que respetar estrictamente las instrucciones del manual operativo del instrumento. Analizadores LIAISON. Cada parámetro del test se identifica mediante el código de barras incluido en la etiqueta del integral de reactivos. Si el código de barras no se puede leer, no será posible usar el integral y tendrá que desecharse. Para obtener información detallada, consulte el manual del analizador. Analizadores LIAISON XL. Cada parámetro del test se identifica mediante la información codificada en la etiqueta de identificación por radiofrecuencia (RFID) del integral de reactivos. Si la etiqueta no se puede leer, no será posible usar el integral y tendrá que desecharse. Para obtener información detallada, consulte el manual del analizador. El instrumento realiza las operaciones siguientes: Las operaciones del analizador son las siguientes: 1. Dispensación de los calibradores, los controles o las muestras en el módulo de reacción 2. Dispensación del conjugado en el módulo de reacción 3. Dispensación de las partículas magnéticas recubiertas 4. Incubación 5. Lavado con líquido de lavado/líquido del sistema 6. Dispensación de los reactivos Starter y medición de la luz emitida 12. CONTROL DE CALIDAD Los controles LIAISON se deben analizar individualmente para evaluar las prestaciones del test. El control de calidad se debe realizar analizando los controles LIAISON Anti-HBs II (a) por lo menos una vez por cada día de trabajo, (b) cuando se usa un nuevo integral de reactivos, (c) cuando se calibra el kit, (d) cuando se usa un nuevo lote de reactivos starter. Los valores de los controles tienen que estar comprendidos entre los rangos esperados: cada vez que uno o ambos valores estén fuera de los rangos esperados habrá que volver a efectuar la calibración y probar de nuevo los controles. Si los valores experimentales de los controles estén de nuevo fuera de los rangos predefinidos después de la calibración, habrá que repetir el test usando un frasco de control no abierto. Si los valores de los controles estén fuera de los rangos esperados, los resultados de las muestras no deben ser notificados. Las prestaciones de otros controles se deben evaluar para asegurar su compatibilidad con este test antes del uso. Por lo tanto es indispensable establecer los intervalos de los valores de los materiales usados para el control de calidad. 13. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El instrumento calcula automáticamente las concentraciones de anticuerpos anti-hbs expresadas en mui/ml y clasifica los resultados. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada. Los calibradores y los controles pueden dar unos resultados de concentración o de unidades relativas de luz (RLU) distintos en LIAISON y LIAISON XL, pero los resultados de los pacientes son equivalentes. El valor límite que discrimina entre la presencia y la ausencia de anticuerpos anti-hbs en niveles compatibles con la inmunidad contra la infección por HBV es 10 mui/ml. Los resultados de las muestras deben ser interpretados como sigue: Las muestras con concentraciones de anticuerpos anti-hbs por debajo de 9 mui/ml se deben clasificar negativas. Las muestras con concentraciones de anticuerpos anti-hbs entre 9 y 11 mui/ml se deben clasificar dudosas. Se recomienda repetir en duplicado el test de las muestras dudosas para confirmar el primer resultado. Las muestras con concentraciones de anticuerpos anti-hbs iguales o por encima de 11 mui/ml se deben clasificar positivas. El análisis de la distribución de los valores expresados en mui/ml observados en una población negativa para anti-hbs indica que el 99% de la población estudiada presenta una concentración aparente de anticuerpos anti-hbs inferior a 8,5 mui/ml. El análisis de distribución de los valores de anti-hbs, expresado en miu/ml, estudiado en una población positiva muestra que el 99% de la población presenta una concentración aparente de anticuerpos anti-hbs por encima de 11,6 miu/ml. Intervalo de ensayo mui/ml de anticuerpos anti-hbs (LIAISON Anti-HBs II) mui/ml de anticuerpos anti-hbs (LIAISON Anti-HBs II Plus). Las muestras que contengan concentraciones de anticuerpo superiores al intervalo de ensayo pueden ser pre-diluidas mediante la función Dilute del instrumento y reanalizadas (los factores de dilución aconsejados son 1:50 y 1:90, solo para LIAISON Anti-HBs II Plus). Los resultados se multiplicarán automáticamente por el factor de dilución para obtener los niveles de anticuerpos de las muestras no diluidas. El diluyente de muestras disponible en el integral de reactivos permite realizar la pre-dilución 1:50 de 100 muestras o la pre-dilución 1:90 de 55 muestras. En la práctica clínica se considera que una concentración de anticuerpos anti-hbs superior a 10 mui/ml indica la remisión de la infección o la respuesta a la vacunación. En ambos casos se piensa que el individuo es inmune a la infección por HBV. Una concentración de anticuerpos menor que 10 mui/ml indica la ausencia de inmunidad, dado que un nivel de 10 mui/ml se considera el límite inferior de protección. 44 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

5 Sin embargo, la concentración de anticuerpos anti-hbs después del ciclo inicial de inmunización con la vacunación anti- HBV disminuye a lo largo del tiempo. No obstante, algunos estudios han revelado que las concentraciones de anticuerpos mantienen la protección incluso a niveles no detectables durante muchos años, al menos 10 o 15, en sujetos vacunados inmunocompetentes que respondieron adecuadamente a la primera vacunación. De hecho se ha demostrado que la protección a largo plazo depende de la memoria inmunológica. Por esta razón, la mayoría de los países no recomiendan administrar una dosis de recuerdo a personas inmunocompetentes durante al menos 15 años desde la vacuna neonatal, aunque algunos países sí recomiendan la administración de dicha dosis de recuerdo. De este modo, se recomienda consultar las disposiciones reglamentarias y directrices vigentes de cada país para conocer la frecuencia de los ensayos de concentración de anticuerpos, así como la recomendación sobre la administración de una dosis de recuerdo de la vacuna. Sin embargo, en la clasificación de las muestras con una concentración de 10 ±1 mui/ml hay que tener en cuenta la variabilidad de la dosis debida a la imprecisión del ensayo. Por eso, estas muestras se deben evaluar con atención y considerar prudencialmente con una concentración de anticuerpos anti-hbs menor que 10 mui/ml cuando se espere saber mediante el test si una muestra contiene seguramente una concentración mayor o igual a 10 mui/ml. 14. LIMITACIONES DEL ENSAYO Para obtener resultados fiables es necesario atenerse estrictamente a las instrucciones de utilización y poseer una adecuada técnica manual. La contaminación bacteriana de las muestras o la inactivación mediante calentamiento pueden modificar los resultados del análisis. Los resultados del test se muestran de manera cuantitativa como positivos o negativos para la presencia de anticuerpos anti-hbs. Sin embargo, el diagnóstico de una enfermedad infecciosa no se debe formular en base al resultado de un solo ensayo, sino que éste se debe validar con otras pruebas clínicas, procedimientos diagnósticos y con la opinión del médico. La comparación de los datos cuantitativos obtenidos con los diferentes métodos analíticos sobre las mismas muestras presenta una discreta concordancia para la mayoría de las muestras. Sin embargo muestras individuales pueden suministrar resultados discrepantes debidos a los siguientes motivos (3): variabilidad antigénica de HBsAg (presencia y características de enlace de los diferentes epítopes de HBsAg, procedimiento de purificación del antígeno, proceso de inactivación de HBsAg, conjugación o fijación del antígeno en la fase sólida) composición de anticuerpo del analito (especificidad para diferentes epítopes, diferente afinidad para los mismos epítopes) prestaciones metodológicas del test (por ejemplo, relación con el estándar primario, principio del ensayo, sistema tampón) o método de cálculo de los resultados efecto matriz en las muestras diluidas y no diluidas y entre muestras y calibradores (debido por ejemplo a proteínas o lípidos). Los integrales no deben utilizarse con los dos tipos de instrumentos (LIAISON y LIAISON XL). Cuando se ha usado un integral con un tipo de instrumento éste debe continuar a usarse siempre en dicho instrumento hasta que se termine. Por cuestiones de posibilidad de rastreo que derivan de esta declaración, es necesario terminar el seguimiento de los pacientes con el mismo tipo de instrumento (LIAISON o LIAISON XL), sin efectuar intercambios ni desplazamientos. 15. PRESTACIONES METODOLÓGICAS DEL KIT Especificidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad que tiene el test para detectar exactamente el analito ante la presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra (por ejemplo, anticoagulantes, hemolisis, efectos de tratamientos de la muestra) o de reacciones cruzadas con anticuerpos potencialmente interferentes. Interferencias. Estudios controlados sobre los factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del test no están influenciadas por anticoagulantes (EDTA, heparina), hemolisis (hasta 100 mg/dl de hemoglobina), lipemia (hasta 3000 mg/dl de triglicéridos), bilirrubinemia (hasta 20 mg/dl de bilirrubina) o por los ciclos de congelación y descongelación de las muestras. El ensayo efectuado en muestras de plasma obtenido con citrato ha demostrado una disminución de la señal, que provoca una subestimación de los resultados (del 20% aproximadamente). Reacciones cruzadas. La finalidad del estudio de reactividad cruzada relacionado con el ensayo LIAISON Anti-HBs II es evaluar las posibles interferencias de anticuerpos dirigidos contra otros organismos que podrían originar síntomas clínicos similares a los de la infección del virus de la hepatitis B (EBV, hcmv, virus de la rubeola, el sarampión y la parotiditis, HAV, HCV), de anticuerpos dirigidos contra otros organismos que podrían ocasionar enfermedades (HSV, VZV, HIV, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum) y de otras condiciones derivadas de una actividad atípica del sistema inmunitario (autoanticuerpos anti-nucleares, anticuerpos anti-saccharomyces cerevisiae, factor reumatoide y anticuerpos humanos anti-ratón). Las muestras utilizadas en estos estudios se seleccionaron previamente mediante el uso de otro ensayo de anti-hbs comercializado. Las muestras que son negativas para anti-hbs se emplearon en el estudio de reactividad cruzada. Para detectar la presencia de reactivos cruzados en las muestras se usaron ensayos que llevan la marca CE. 45 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

6 Estado Número de muestras negativas previstas LIAISON Anti-HBs II resultados positivos Anticuerpos anti-hcmv 15 0 Anticuerpos anti-ebv (VCA) 2 0 Anticuerpos anti-hsv-1/2 6 0 Anticuerpos contra el virus de la rubeola 12 0 Anticuerpos contra el virus del sarampión 4 0 Anticuerpos contra el virus de la parotiditis 7 0 Anticuerpos anti-vzv 3 0 Anticuerpos anti-hcv 3 0 Anticuerpos HIV 2 0 Anticuerpos anti-hav 8 0 Anticuerpos anti-toxoplasma gondii 6 0 Anticuerpos anti-treponema pallidum 5 0 Factor reumatoide (inmunoglobulinas anti-fc) 19 0 Autoanticuerpos anti-nucleares (ANA) 19 0 Anticuerpos anti-saccharomyces cerevisiae (ASCA) 7 0 Anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) 7 0 Total Precisión con los instrumentos LIAISON La repetibilidad y la reproducibilidad del ensayo (es decir las variaciones intra-ensayo e inter-ensayo) han sido determinadas utilizando muestras en diferentes concentraciones de analito. La variabilidad observada no ha dado lugar a una clasificación errónea de las muestras. Los resultados se refieren a los grupos de pacientes tomados en consideración; no se trata de prestaciones garantizadas porque pueden existir diferencias entre los diferentes laboratorios. Repetibilidad. Para evaluar la repetibilidad se han analizado veinte replicados en la misma sesión analítica en el laboratorio donde se desarrolló el kit. Repetibilidad A B C D E F G Control positivo Número de determinaciones Media (mui/ml) 8,7 20,7 87, ,0 Desviación estándar (mui/ml) 0,5 1,1 3,7 2,3 6,9 10,2 37,9 2,2 Coeficiente de variación (%) 6,3 5,2 4,3 1,9 4,0 4,0 4,8 3,7 Valor mínimo (mui/ml) 8,0 18,2 82, ,4 Valor máximo (mui/ml) 9,7 22,5 95, ,5 Reproducibilidad. Para evaluar la reproducibilidad se han analizado veinte replicados en días diferentes (una o dos sesiones analíticas al día) utilizando tres lotes diferentes de integral. Los ensayos se realizaron en dos sitios, en el laboratorio donde se desarrolló el kit (sitio 1) y en un laboratorio independiente (sitio 2) utilizando los mismos instrumentos. Reproducibilidad - Sitio 1 A B C D E F G Control positivo LOTE Nr. 01 Media (mui/ml) 10,1 19,2 89, ,9 Desviación estándar (mui/ml) 0,7 1,3 6,4 4,6 7,1 14,4 42,8 2,6 Coeficiente de variación (%) 6,5 7,0 7,2 3,8 4,1 6,5 5,8 4,5 Valor mínimo (mui/ml) 9,2 17,4 80, ,0 Valor máximo (mui/ml) 11,4 21, ,9 LOTE Nr. 02 Media (mui/ml) 9,9 21,6 82, ,9 Desviación estándar (mui/ml) 0,6 1,1 4,6 3,8 7,1 13,7 33,1 2,9 Coeficiente de variación (%) 6,3 5,1 5,6 3,6 4,4 6,5 5,3 5,2 Valor mínimo (mui/ml) 8,8 19,4 74, ,5 Valor máximo (mui/ml) 10,8 23,6 92, ,6 LOTE Nr. 03 Media (mui/ml) 9,6 21,7 87, ,2 Desviación estándar (mui/ml) 0,5 1,1 4,2 5,8 9,7 13,4 79,3 4,8 Coeficiente de variación (%) 5,3 5,1 4,8 5,0 5,7 5,7 11,5 8,4 Valor mínimo (mui/ml) 8,9 19,7 79, ,3 Valor máximo (mui/ml) 10,8 24,0 94, ,2 Coeficiente de variación inter-lotes (%) 2,5 6,7 3,8 5,5 3,2 5,3 8,6 1,2 46 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

7 Reproducibilidad - Sitio 2 A B C D E F G Control positivo LOTE Nr. 01 Media (mui/ml) 10,6 18,5 78, ,5 Desviación estándar (mui/ml) 0,8 1,2 5,2 6,5 8,8 11,7 52,9 2,4 Coeficiente de variación (%) 7,5 6,2 6,6 5,9 5,6 5,0 8,3 4,9 Valor mínimo (mui/ml) 9,0 16,4 71,1 92, ,1 Valor máximo (mui/ml) 12,2 20,8 87, ,9 LOTE Nr. 02 Media (mui/ml) 9,0 19,8 78, ,8 Desviación estándar (mui/ml) 0,5 1,4 4,0 6,6 8,8 15,0 36,3 3,5 Coeficiente de variación (%) 5,7 7,1 5,2 6,2 5,6 6,4 5,9 6,6 Valor mínimo (mui/ml) 8,2 17,1 70,3 95, ,1 Valor máximo (mui/ml) 10,3 22,8 87, ,9 LOTE Nr. 03 Media (mui/ml) 9,1 19,5 79, ,7 Desviación estándar (mui/ml) 0,6 1,2 5,8 7,0 10,4 13,5 57,4 3,4 Coeficiente de variación (%) 7,1 6,0 7,2 6,3 6,7 5,5 8,7 6,6 Valor mínimo (mui/ml) 8,0 17,9 64,2 94, ,2 Valor máximo (mui/ml) 10,7 22,2 90, ,1 Coeficiente de variación inter-lotes (%) 9,5 3,4 0,8 1,8 1,1 3,4 3,4 3, Precisión con los instrumentos LIAISON XL La repetibilidad y la reproducibilidad del ensayo (es decir las variaciones intra-ensayo e inter-ensayo) han sido determinadas utilizando las muestras de referencia en diferentes concentraciones de analito. La variabilidad observada no ha dado lugar a una clasificación errónea de las muestras. Repetibilidad. Para evaluar la repetibilidad se han analizado veinte replicados en la misma sesión analítica. Repetibilidad Control positivo Media (mui/ml) 8,67 10,3 22,3 82, ,0 Desviación estándar 0,5 0,3 1,9 3,6 5,9 26,1 20,7 1,3 Coeficiente de variación (%) 5,9 3,0 8,6 4,4 4,0 6,3 2,8 2,4 Valor mínimo (mui/ml) 7,54 9,83 17,6 73, ,4 Valor máximo (mui/ml) 9,69 11,1 26,6 87, ,0 Reproducibilidad. Para evaluar la reproducibilidad se han analizado veinte replicados en días diferentes (una o dos sesiones analíticas al día). Reproducibilidad Control positivo Media (mui/ml) 9,02 10,4 22,2 78, ,5 Desviación estándar 0,5 0,4 1,7 2,5 3,3 23,6 36,8 2,1 Coeficiente de variación (%) 5,3 4,3 7,5 3,2 2,4 5,4 5,2 4,0 Valor mínimo (mui/ml) 7,55 9,57 18,5 72, ,6 Valor máximo (mui/ml) 9,65 11,0 24,3 82, ,5 47 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

8 15.4. Veracidad La veracidad del ensayo ha sido controlada mediante el test de dilución. Test de dilución. Se han analizado diluciones en serie de seis sueros de concentración elevada de anticuerpos anti-hbs realizadas con el diluyente de muestras. Las concentraciones medidas de anticuerpos anti-hbs obtenidas en función de las concentraciones esperadas han sido analizadas con la regresión lineal. Los coeficientes de correlación (r) estaban comprendidos entre 0,996 y 1,000. Dilución Concentración esperada, mui/ml Concentración medida, mui/ml % Recuperación Dilución Concentración esperada, mui/ml Concentración medida, mui/ml % Recuperación no diluido 463 no diluido > 1,000 1:2 231, : :4 115, :4 278, :8 57,9 60, :8 139, :16 28,9 30, :16 69,6 74, :32 14,5 15, :32 34,8 39,3 113 no diluido 484 no diluido > 1,000 1:2 242, : :4 121, :4 460, :8 60,5 72, :8 230, :16 30,3 36, :16 115, :32 15,1 17, :32 57,5 52,3 91 1:64 28,7 23,4 81 no diluido 677 no diluido > 1,000 1:2 338, : :4 169, :8 497, :8 84,6 72,2 85 1:16 248, :16 42,3 38,3 90 1:32 124, :32 21,2 18,1 87 1:64 62,2 54,5 88 1:128 31,1 27, Efecto gancho con altas concentraciones Cuando se ensayen muestras que contengan unas concentraciones de anticuerpos sumamente elevadas con un método sandwich, se pueden obtener unos niveles aparentes de anticuerpo inferiores al nivel real por efecto gancho. Para cuantificar las muestras correctamente, las muestras que contienen niveles mayores que el del intervalo de ensayo deben ser diluídas con una muestra negativa o con el diluyente de muestras de LIAISON Anti-HBs II Plus y analizadas de nuevo. Los resultados deben ser multiplicados por el factor de dilución para obtener los niveles de las muestras no diluídas. El kit ha sido desarrollado de modo que concentraciones de anticuerpos anti-hbs hasta mui/ml proporcionen una señal analítica siempre superior al intervalo de ensayo. La presencia de un efecto gancho ha sido evaluada analizando tres muestras positivas para anticuerpos anti-hbs con alto título. Todas las muestras han presentado unos valores de concentración por encima del intervalo de ensayo, como se espera de las muestras con alto título, indicando que la clasificación de las muestras es correcta Especificidad y sensibilidad diagnósticas Poblaciones seleccionadas. La especificidad y sensibilidad diagnósticas fueron evaluadas analizando 518 muestras recogidas de diferentes poblaciones seleccionadas (sujetos nunca infectados por el virus de la hepatitis B, sujetos infectados de forma natural en el pasado por el virus de la hepatitis B y personas vacunadas contra el virus de la hepatitis B) Las muestras se han examinado con diferentes métodos de comparación y se han empleado la regla del consenso general y los datos clínicos y serológicos para establecer los resultados esperados. No se incluyeron nueve muestras en el análisis de datos, ya que seis de ellas no fueron resueltas utilizando los métodos de referencia y las tres restantes resultaron concordantes con los métodos de referencia, pero incoherentes con los resultados previstos. Entre la población presumiblemente negativa estudiada, se obtuvieron un resultado positivo, un resultado dudoso y 295 resultados negativos. Especificidad diagnóstica: 99,33% (intervalo de confianza al 95%: 97,59-99,92%). En la población presumiblemente positiva estudiada ninguna muestra ha resultado negativa y 106 muestras han resultado positivas (sujetos infectados de forma natural en el pasado por el virus de la hepatitis B) - sensibilidad diagnóstica: 100% (intervalo de confianza al 95%: 96,58-100%). En la población presumiblemente positiva estudiada ninguna muestra ha resultado negativa y 106 muestras han resultado positivas (personas vacunadas contra el virus de la hepatitis B) - sensibilidad diagnóstica: 100% (intervalo de confianza al 95%: 96,58-100%). Asimismo, la sensibilidad diagnóstica fue evaluada en 34 paneles de seroconversión que comprendían 210 recogidas (seguimiento de vacunación), cada una de ellas comenzando con una recogida negativa y presentando reducidos intervalos de recogida. La prueba muestra una equivalencia sustancial en el momento de detección con respecto a los métodos de referencia. Población prospectiva. La especificidad y sensibilidad diagnósticas fueron evaluadas analizando 861 muestras de sujetos, recogidas y enviadas al laboratorio para analizar los anticuerpos anti-hbs. Las muestras se analizaron entre sí con un método de comparación y de consenso para establecer los resultados esperados. Entre la población presumiblemente negativa estudiada, se obtuvieron 277 resultados negativos y ninguno positivo - especificidad diagnóstica: 100% (intervalo de confianza al 95%: 98,68-100%). En la población presumiblemente positiva estudiada, cuatro muestras han resultado negativas y 578 muestras han resultado positivas después de repetir el análisis de muestras discrepantes - sensibilidad diagnóstica: 99,31% (intervalo de confianza al 95%: 98,25-99,81%). 48 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

9 LIAISON Control Anti-HBs II (310221) 1. FINALIDAD DEL ENSAYO Los controles LIAISON Anti-HBs II (negativo y positivo) deben ser usados en los ensayos de quimioluminiscencia (CLIA) LIAISON para verificar la fiabilidad de los ensayos. Las prestaciones metodológicas de los controles LIAISON Anti-HBs II no son definidas con otros ensayos o instrumentos automáticos diferentes que LIAISON y LIAISON XL. Instrumentos LIAISON. El certificado de análisis contiene informaciones específicas sobre el lote de los controles, que debe introducirse manualmente en el software del instrumento antes de cargar los frascos de los controles en el instrumento. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada. Instrumentos LIAISON XL. Los códigos de barras del certificado de análisis contienen informaciones específicas sobre el lote de los controles y deben ser leídos por el lector manual de los códigos de barras del instrumento LIAISON XL antes de cargar los frascos de los controles en el instrumento. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada. 2. MATERIALES SUMINISTRADOS Control negativo (2 x 2,5 ml) Suero/plasma humano que no contiene anticuerpos anti-hbs con tampón TRIS, 0,2% ProClin 300 y conservantes. Control positivo (2 x 2,5 ml) Suero/plasma humano que contiene bajos niveles de anticuerpos (humanos) anti-hbs, suero fetal bovino, EDTA, 0,2% ProClin 300 y conservantes. Todos los reactivos se suministran listos para su uso. El intervalo de las concentraciones para cada control está impreso en el certificado de análisis e indica los límites definidos por DiaSorin para los valores de los controles obtenidos con test fiables. Cada laboratorio es responsable de adoptar límites diferentes para cumplir exigencias específicas. 3. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Sólo para uso diagnóstico in vitro. Los controles no son específicos para lote de kit. Se pueden intercambiar también con lotes diferentes de integral de reactivos. Todos los materiales utilizados para elaborar los componentes de este kit se han analizado y se han encontrado no reactivos a la presencia de HBsAg, anti-vhc, anti-vih-1 y anti-vih-2. Sin embargo, visto que ningún método de análisis puede asegurar que los agentes patógenos estén ausentes, todo el material de origen humano se deberá considerar potencialmente infeccioso y manipularlo como tal. Observe las precauciones necesarias para la manipulación de los reactivos de laboratorio. Los residuos deben eliminarse de acuerdo con la reglamentación local. 4. NORMAS DE SEGURIDAD No coma, beba, fume o se maquille durante la ejecución del ensayo. No pipetee las soluciones con la boca. Evite el contacto directo con el material potencialmente infeccioso usando batas de laboratorio, gafas de protección y guantes desechables. Lávese cuidadosamente las manos al terminar el ensayo. Evite salpicaduras o formación de aerosoles. En caso de que esto sucediera, cada gota de reactivo se debe eliminar con una solución de hipoclorito sódico al 5% y el medio utilizado se deberá tratar como material residuo potencialmente infeccioso. Todas las muestras, los reactivos biológicos del kit y los materiales usados para efectuar el ensayo se deben considerar capaces de transmitir agentes infecciosos; por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país. Los reactivos que contienen ProClin 300 se clasifican como irritantes según las Directivas Europeas aplicables: R 43 - Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. S 24 - Evítese el contacto con la piel. S 37 - Úsense guantes adecuados. S 60 - Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. 5. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD En el momento de su llegada, los controles se deben mantener a 2-8 C en posición vertical para evitar el contacto de la solución con la tapa del frasco. No congele. Si los controles se conservan sellados y en posición vertical, ellos son estables a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. Después de la apertura, los controles son estables durante cuatro semanas si se conservan refrigerados a 2-8 C entre dos usos sucesivos. Evite la contaminación bacteriana de los controles. Los controles no se deben usar pasada la fecha de caducidad indicada en las etiquetas de los frascos. 6. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Coloque los frascos de los controles en las gradillas C del instrumento LIAISON. Con una solución de control es posible realizar por lo menos 13 test. El volumen mínimo de control necesario es 550 μl (150 μl de control μl de volumen muerto). En el momento del uso, acondicione los controles a temperatura ambiente (20-25 C) antes de la apertura de los frascos y déjelos en el área de las muestras del instrumento sólo durante el tiempo requerido para realizar el test de control de calidad. Después del uso, tape los frascos lo antes posible y manténgalos a 2-8 C en posición vertical. Durante la manipulación de los controles, adopte las precauciones necesarias para evitar la contaminación microbiana. 7. MANIPULACIÓN Hágase referencia al manual operativo del instrumento para la manipulación correcta. Anti-HBs II-es.fm LIAISON Control Anti-HBs II (310221) 49 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011

10 8. VALORES ESPERADOS En el certificado de análisis se indican los intervalos y valores previstos de concentración de anti-hbs en los controles. Estos se han establecido considerando la variabilidad de las sesiones analíticas respecto a la curva predefinida memorizada por el fabricante, a fines de garantizar la precisión de los resultados analíticos y obtener indicaciones sobre la estabilidad y el deterioro de los reactivos. Si los valores experimentales de los controles están repetidamente fuera de los intervalos predefinidos, con mucha probabilidad, el ensayo se ha llevado a cabo de forma incorrecta. Anti-HBs II-es.fm LIAISON Control Anti-HBs II (310221) 50 / 60 ES - 200/ , A- 12/2011