PROCESAMIENTO DE SEMEN CAPRINO PARA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: UNA REVISIÓN

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1 PROCESAMIENTO DE SEMEN CAPRINO PARA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: UNA REVISIÓN RESUMEN. de la Vega, A.C. 1 Revista TAURUS 6: ISSN La inseminación artificial es una biotécnica dependiente de la calidad del semen que se pueda almacenar para tal fin. En el caso del caprino, el procesamiento del mismo (dilución, enfriamiento y conservación) presenta algunas dificultades que determinan una menor eficiencia de uso respecto a otras especies pecuarias, como por ejemplo el bovino. Esto es debido a la estacionalidad típica de los caprinos y a la presencia de ciertas sustancias en el plasma seminal, que reaccionan con algunos componentes de uso común en los diluyentes de semen. Para solucionar este problema se procede al lavado del material seminal antes de su dilución, aunque algunos investigadores opinan que este paso es innecesario. Finalmente, para la criopreservación del semen se postulan diferentes modalidades de adicionar el crioprotector, usándose casi por excelencia el glicerol. La criopreservación permite un mejor aprovechamiento de los machos genéticamente superiores. El avance de la IA en los caprinos depende, en gran medida, de que el semen pueda criopreservarse en forma adecuada, con un diluyente que mantenga un máximo de viabilidad y fertilidad espermática.. Por lo tanto, cumpliendo con los cuidados necesarios durante el procesamiento y mejorando los puntos críticos señalados, se podría lograr un importante incremento en el uso de esta biotecnología. 1. INTRODUCCIÓN. Los caprinos constituyen la ganadería típica de las zonas áridas y semiáridas, consideradas marginales para otro tipo de ganado Su capacidad de adaptación le permite sobrevivir en regiones de baja productividad forrajera (18). En nuestro país, la raza más difundida es la denominada Criolla, que, con sus diferentes biotipos regionales, representa un medio de subsistencia de suma importancia como productora de carne y de leche, presentando una gran variabilidad genética que permitiría iniciar un exitoso proceso de selección y mejoramiento genético. Para esto, es indiscutible la importancia de la inseminación artificial (IA) como herramienta para el logro de avances genéticos significativos. A su vez, la implementación de la IA implica el desarrollo de técnicas de procesamiento y conservación de semen, principalmente la criopreservación. De este último aspecto depende el futuro de la IA, dado que por la marginalidad de algunas zonas productoras, no resulta sencillo practicar esta biotécnica sin contar con semen congelado. El primer paso en el procesamiento es la dilución, cuyos objetivos fundamentales son dos: a) extender el volumen del semen, para poder fraccionar las dosis de inseminación; b) proveer a los espermatozoides de un medio que les permita sobrevivir por períodos más o menos prolongados, frescos o congelados, sin pérdida significativa de su fertilidad (12). La dilución del semen caprino presenta algunas dificultades que, comparado con el bovino, resulta más problemática (4, 19, 26). Esto debido, fundamentalmente, a la presencia de algunas sustancias en el plasma seminal que, al combinarse con ciertos componentes de los diluyentes, afectan la viabilidad espermática (3, 24, 28). A esto se suma la variación estacional de la calidad seminal en el macho caprino. Los diluyentes para semen pueden clasificarse en tres grandes grupos (1): a) Aquellos que contienen yema de huevo, adicionada a algún componente salino o un azúcar (3, 5, 6, 30, 34). 1 Ingeniero Zootecnista. Docente de Reproducción y Mejoramiento Animal. Facultad de Agronomía y Zootecnia (Departamento de Producción Animal) UNT. Av. Roca 1900 (4000) S.M. de Tucumán.

2 b) Aquellos constituidos básicamente por leche bovina descremada (3, 21, 24). c) Los sintéticos o de composición diferente a los dos anteriores (16, 33). El objetivo del presente trabajo es estudiar algunos aspectos relacionados con el procesamiento del semen caprino, principalmente aquellos que presentan cierto grado de dificultad, condicionando o limitando el logro de resultados positivos a gran escala. 2. PRINCIPALES INCONVENIENTES EN EL PROCESAMIENTO Variaciones estacionales de la calidad seminal. Así como el comportamiento reproductivo de las cabras es estacional, la calidad del semen producido por los machos mantiene la misma estacionalidad (3, 17). Los caprinos son reproductores de días cortos, las hembras ciclan hacia fines del verano y durante el otoño, manteniéndose en anestro durante el resto del año. Esta estacionalidad depende, entre otras cosas, de la raza y la latitud. Razas de climas templados (altas latitudes) presentan una estacionalidad más manifiesta. En tanto que las razas de zonas tropicales y subtropicales (más cercanas al Ecuador) presentan temporadas reproductivas más prolongadas, llegando en algunos casos a comportarse casi como reproductores continuos. Entre 30º y 40º de latitud la estacionalidad es poco marcada, en tanto que a latitudes menores es prácticamente nula (29). La raza Criolla de Guadalupe registra ovulaciones durante 9 meses al año en más del 90 % de los animales, en tanto que los meses restantes la actividad ovárica es cercana al 80 % (7). De igual manera, el macho manifiesta una libido mayor durante el otoño, época que coincide con la mejor calidad seminal. Tanto el volumen eyaculado como la motilidad y la concentración son mayores en otoño e invierno (marzo - agosto en el hemisferio austral) que en primavera y verano (septiembre - febrero) (26, 38). El semen producido en primavera sería menos resistente ante los procesos de criopreservación, por lo que se dificultaría marcadamente su conservación. El período de congelabilidad sería mayor en cercanía de los Trópicos y del Ecuador (25). Esta estacionalidad de los machos tiene también variaciones raciales, siendo las razas criollas de zonas subtropicales unas de las que menos marcado presentan este fenómeno (7). En razas españolas, si bien existen diferencias, se postula que la calidad del semen es aceptable todo el año (29, 32). Karatzas y colaboradores (23), en una latitud similar al caso anterior (alrededor de los 35º N), obtuvieron resultados satisfactorios procesando semen fresco en la estación no reproductiva (hacia fines de la primavera y durante el verano), tanto con razas de zonas subtropicales como originarias de regiones templadas. Recurriendo a tratamientos fotoperiódicos que permitan controlar las horas de luz a que se encuentran sometidos los animales, se logra mejorar la producción de esperma, incrementando el número total de células y, por ende, las dosis logradas para IA (13, 14, 15) Interacción de los diluyentes con los componentes del semen Utilización de la Yema de Huevo. La yema de huevo (YH) se utiliza ampliamente para la dilución del semen de diferentes especies. En bovinos constituye un clásico, dado el alto nivel de factores de protección espermática que se le atribuyen. Este efecto protector sería debido a la presencia de lipoproteínas, lecitinas y glucosa; lo que permitiría el mantenimiento de la viscosidad del semen, formaría un barniz protector alrededor de los espermatozoides y proveería de nutrientes a los mismos (12, 36). Sin embargo, en el caso de los caprinos, la presencia de una fosfolipasa A en el plasma seminal, proveniente de las glándulas bulbouretrales, cataliza la hidrólisis de las lecitinas. Esto da como resultado la liberación de lisolecitinas y ácidos grasos al medio de dilución, los cuales resultan tóxicos para los espermatozoides (3, 6, 19, 24). Roy (35) llamó a este compuesto factor coagulador (FC), debido al efecto que produce sobre la YH. Aparentemente, la acción de este FC se intensificaría con el paso del tiempo, por lo que la toxicidad no se manifiesta de inmediato sino que se produce en el transcurso del proceso (8). En tanto, el semen obtenido mediante electroeyaculación tendría un mayor contenido de FC (17), esto seguramente por la menor concentración seminal en las muestras logradas por esta vía, determinada por la mayor secreción de las glándulas anexas. Así mismo, el contenido de FC durante la época reproductiva sería mayor que el resto del año (22).

3 Algunos autores concluyen que existen diferencias individuales en el contenido de FC del plasma seminal de los distintos machos (19, 31). Esto es que algunos animales pueden no presentar la fosfolipasa A entre los componentes de sus eyaculados. De igual manera, podrían presentarse diferencias raciales en dicha composición. En un semental en que se comprobó previamente la inexistencia del FC en el semen, no se registraron diferencias significativas diluyendo sin yema o con porcentajes variables de la misma (19). En tanto que en otra experiencia el diluyente con YH fue claramente superior a otro que en su reemplazo contenía ácido cítrico (8), tal como se refleja en el cuadro nº 1. Cuadro nº 1: Promedio de motilidad progresiva utilizando diluyentes con y sin yema de huevo (Conejo et al) (8). DILUYENTE UTILIZADO n % Motilidad Citrato de sodio - Ácido cítrico 96 11,6 a Citrato de sodio - Yema de huevo 96 61,5 b n = número de eyaculados analizados. Diferencias altamente significativas en los valores de motilidad por efecto del diluyente utilizado (p<0.01). Se realizaron numerosas experiencias con diferentes contenidos de YH en el diluyente, considerándose como adecuados niveles del 2 ó 2,5 % (25). Algunos resultados aparecen como contradictorios, tal el caso del obtenido por Gómez y colaboradores (19), quienes llegan a la conclusión que los niveles bajos de YH (5 y 10 %) son perjudiciales, en tanto que los niveles altos no (15 y 20 %). En general se recomienda recurrir al lavado del semen caprino cuando se utilicen diluyentes conteniendo YH, para eliminar el plasma seminal y con él el FC (3, 24). Su práctica permite obtener buenos resultados (2), aunque también se informa respecto a tratamientos exitosos sin lavado previo (8, 25) Utilización de Leche descremada. La leche descremada (LD) es otro compuesto clásico en la preparación de diluyentes para semen (36), considerado como uno de los que mayor perspectiva tendría para ser utilizado en caprinos (20). Se indica que el eyaculado caprino puede ser diluido directamente en leche descremada, previamente calentada en un baño de María a punto de ebullición durante 15 minutos y enfriada a temperatura ambiente (3). Este paso es necesario para inhibir la lactenina, presente en la leche y que resulta tóxica para los espermatozoides (24), cumplido el mismo se podría utilizar la leche sin inconvenientes. El proceso de calentamiento, además, promueve el desdoblamiento de la lactosa a glucosa y galactosa, que los espermatozoides pueden utilizar como fuente energética de mayor disponibilidad (20). Numerosos autores informaron sobre el uso exitoso de diferentes diluyentes elaborados a partir de leche bovina descremada, generalmente en polvo (3, 20, 21). Sin embargo, investigaciones recientes indican sobre la presencia de una lipasa bulbouretral en el plasma seminal del caprino. Esta actuaría sobre los triglicéridos de la leche, catabolizando la formación de ácido oleico, que sería responsable del deterioro de los espermatozoides caprinos cuando se diluyen en leche descremada (28). Estos resultados llevan a plantear la necesidad de recurrir al lavado del semen aún cuando se diluya con LD Utilización de otros tipos de diluyentes. Roca y colaboradores (33) probaron utilizar caseína estabilizada en reemplazo de la YH o la leche. Comparando con un diluyente Tris - yema, no encontraron diferencias significativas en los resultados de los parámetros de calidad utilizados para la evaluación. Así mismo, al utilizar diferentes combinaciones de cuatro sustancias amino-orgánicas y cuatro bases (16), se concluyó en que es factible conservar el semen caprino, tanto a 5ºC como a 15ºC, con algunas de ellas. Las combinaciones que permitieron los mejores resultados fueron Tes - Tris y Pipes - Tris, cuyos resultados se observan en el cuadro nº 2. En promedio,

4 el Tris permitió obtener mejores resultados combinado con cualquier sustancia amino-orgánica, comparado con otras bases como NaOH, K 2 HPO 4 o KOH; encontrándose diferencias significativas (p<0.01) entre bases, no así entre diferentes sustancias amino-orgánicas (16). Gómez y colaboradores (19), en un trabajo en que se compararon diferentes niveles de YH en diluyentes a partir de saliva artificial y mucílago de Opuntia, obtuvieron los mejores resultados cuando el contenido de yema era nulo (0 %), por lo que se puede concluir que es factible utilizar estos diluyentes para conservar semen caprino (cuadro nº 3). Cuadro nº 2: Porcentaje de motilidad obtenido a distintos tiempos post-dilución utilizando una base Tris a diferentes temperaturas de conservación (Dunner y Vázquez) (16). TES - TRIS PIPES -TRIS TIEMPO 5ºC 15ºC 5ºC 15ºC 0 hs. 81 % 81 % 2 hs. 69 % 63 % 69 % 70 % 4 hs. 56 % 67 % 58 % 72 % 24 hs. 41 % 43 % 32 % 46 % No hay diferencias significativas entre las distintas sustancias amino-orgánicas. Efectos significativos de la temperatura de conservación (p<0.01). Tes = ácido N-Tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfónico. Pipes = ácido piperazina-n, N`-bis(2)-etanosulfónico. Tris = Tris (hidroximetil) aminometano. Cuadro nº 3: Comparación de 4 niveles de yema de huevo en diluyentes a base de saliva artificial y mucílago de Opuntia. (Gómez et al) (19). % de Yema de Huevo % de Motilidad 0 55,9 a 5 11,4 c 10 14,5 c 15 39,2 b Efectos altamente significativos de los niveles de yema de huevo sobre la motilidad espermática (p<0.01) Lavado del Semen. Ritar y Salamón (30) plantean la necesidad de eliminar el plasma seminal previo al procesamiento del semen, especialmente si se utiliza YH. Esto se logra mediante la centrifugación de la muestra (700 g/minuto), luego de una dilución previa en un medio de lavado (solución Krebs-Ringer-Fosfato); es lo que se conoce como "lavado" del semen. Resulta conveniente realizar un doble centrifugado, para resuspender finalmente en el diluyente deseado (3, 24). La concentración final debería estar en el orden de las 500 x 10 3 células/mililitro (26).

5 Numerosos autores coinciden en afirmar que, a pesar de lo engorroso del proceso, resulta imprescindible lavar los espermatozoides caprinos debido al efecto benéfico del mismo sobre la calidad de la muestra almacenada (9, 10, 27); esto se aprecia en el cuadro nº 4. Sin embargo, se producen efectos nocivos sobre las células espermáticas; según Mascarenhas (26), las pérdidas por muerte celular pueden estimarse entre un 6 y un 15 % del total de espermatozoides. Esto llevó a que no pocos investigadores indagaran diferentes caminos para evitar este procedimiento. Así se informan resultados en que el lavado del semen no mejora la calidad espermática en forma significativa (4, 11, 33). También, en el caso de la raza Murciano - Granadina, se concluye que es innecesario tal proceso (34), lo que se aprecia en el cuadro nº 5. Tuli y Holtz (38), incluso, observaron menores pérdidas de motilidad en semen sin lavar, comparado con el lavado. Cuadro nº 4: Calidad del semen caprino, sometido o no a lavado, incubado a 37 ºC (Mateos y Pérez) (27). TIEMPO 0 hs. 2 hs. 4 hs. 6 hs. TRATAMIENTO L NL L NL L NL L NL Motilidad (%) 30,6 c 16,5 d 21,3 c 9,5 d 7,9 c 0,1 d 0,7 0 CM (0-5) 3 2,8 2,9 2,3 1,7 a 0,1 b 0,2 0 L= semen lavado. NL= semen no lavado. CM= calidad de movimiento, se califica en una escala de 0 a 5. Diferencias entre tratamientos para cada una de las horas: a-b: p<0.01 (altamente significativas), c-d: p<0.05 (significativas). Cuadro nº 5: Valores promedio para los diferentes parámetros estudiados según tratamiento y tiempo post-dilución (Roca et al) (34). TIEMPO 0 hs. 6 hs. 24 hs. 48 hs. TRATAMIENTO L NL L NL L NL L NL Motilidad (%) 86,6 87,0 86,7 85,5 85,7 86,2 79,3 78,1 CM (0-5) 4,3 4,4 4,3 4,2 4,2 4,1 3,9 3,5 Acros. Norm. (%) 93,7 95,3 88,6 89,5 85,4 85,8 84,2 83,4 L= semen lavado. NL= semen no lavado. CM= calidad de movimiento, se califica en una escala de 0 a 5. Efecto altamente significativo (p<0.01) del tiempo de conservación para todos los parámetros de calidad seminal. No existen diferencias significativas entre tratamientos (L vs. NL). Resulta recomendable proceder al lavado del semen de manera rutinaria, teniendo en cuenta que, como ya se comentó, existen diferencias individuales en el contenido de FC en el plasma seminal (19, 31). Esto podría explicar los resultados discordantes que presenta la literatura.

6 3. AVANCES EN CRIOPRESERVACIÓN. El crioprotector más utilizado es el glicerol, el cual actúa ingresando a las células y reemplazando al agua intracelular, su alta permeabilidad le confiere capacidad para atravesar la membrana plasmática. Este fenómeno de difusión se desarrolla durante el período denominado "glicerolización", que se lleva a cabo generalmente a 5ºC y debería durar mínimo una hora (12). Comparado con DMSO, las muestras diluidas con glicerol presentaron mejor comportamiento, aumentando la motilidad y el porcentaje de espermatozoides vivos a medida que el glicerol reemplazaba porcentualmente al DMSO en el diluyente, y logrando una diferencia significativa cuando contenía únicamente glicerol (37); sin embargo, la fertilidad no se vio estadísticamente afectada. Los protocolos de dilución de semen son diversos. Se puede trabajar en forma fraccionada, agregando un diluyente A sin glicerol a temperatura de extracción (el 50 % de la dilución final) y un diluyente B, con el doble de la concentración de glicerol requerida, cuando se equilibra la temperatura a 5ºC (el 50 % restante para completar la dilución) (3, 12). Otros investigadores, utilizando un solo diluyente conteniendo la concentración final de glicerol y agregándolo al semen tibio, lograron inseminaciones exitosas (25). Otra modalidad descripta es la dilución en dos fracciones (50 % cada una) pero con el glicerol presente en ambas, a los 30ºC se agrega con una concentración del 3 % y a los 5ºC con un 11 % del crioprotector (6). También se recomienda fraccionar en tres partes el agregado de diluyente, al semen tibio se le adiciona una primera fracción con una concentración del 2 % de glicerol (50 % del total), a los 18ºC se agrega un 25 % de diluyente con un 6 % de glicerol y, estabilizada la muestra en 5ºC, se completa la dilución con la misma concentración anterior (21). Tuly y Holtz (38) aconsejan agregar la totalidad del glicerol a 37ºC, pero en forme fraccionada. Aún considerando la variabilidad de protocolos, resulta claro que la mayoría considera conveniente adicionar el crioprotector en varias fracciones. La concentración recomendada para el mismo se encuentra entre 4 y 7 % (4, 24, 26, 27, 31, 38). Salvo Gómez y colaboradores (20), que al trabajar con diferentes niveles de glicerol concluyeron que la concentración óptima es del 12 %. Con semen criopreservado se lograron resultados alentadores. Porcentajes de preñez del 68 % en primoinseminación fueron informados por González Stagnaro (21). Con semen recolectado durante la estación no reproductiva, se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre fresco y criopreservado respecto al porcentaje de parición (65 % vs. 53 %) (23). En tanto que con semen fresco se alcanzó un 76 % de nacimientos (34). 4. CONCLUSIÓN. Las dificultades marcadas llevan a que los resultados obtenidos no sean siempre los esperados y, aunque la IA en caprinos es una realidad, indican que es necesario continuar investigando sobre el tema a fin de lograr un diluyente económico, de fácil utilización y que garantice un resultado satisfactorio en un amplio marco de aplicación, mejorando los índices reproductivos logrados en la actualidad. Que la IA en los caprinos pueda seguir avanzando, depende en gran medida de que el semen pueda criopreservarse en forma adecuada, con un diluyente que mantenga un máximo de viabilidad y fertilidad espermática. La criopreservación permite un mejor aprovechamiento de los machos genéticamente superiores, los trabajos realizados indican que es posible alcanzar resultados satisfactorios, no muy alejados de los valores logrados con semen fresco. Por lo tanto, cumpliendo con los cuidados necesarios durante el procesamiento y mejorando los puntos críticos señalados, se podría lograr un importante incremento en el uso de la inseminación artificial. 5. BIBLIOGRAFÍA. 1. Armienta Trejo G. y Garza E Evaluación de diferentes niveles en los componentes de un diluyente preservador de semen refrigerado en caprinos. XXII Informe de Investigación, Inst. Tecnol. y de Estudios Sup. de Monterrey (ITESM). Monterrey, México. p: Azawi O.I., Al-Dahash S.Y. and Juma F.T Effect of different diluents on Shami goat semen. Small Ruminant Research 9 (4):

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