UNIVERSIDAD VERACRUZANA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CRIOCAPACITACION DE ESPERMATOZOIDES CAPRINOS, PROCESADOS CON DOS DILUYENTES TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE: TESIS COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: Oscar Camacho García ASESORES: Dr. Manuel Barrientos Morales Dr. José Manuel Martínez Hernández VERACRUZ, VER. FEBRERO 2011

2 ÍNDICE GENERAL INDICE DE CUADROS... iv INDICE DE FIGURAS... v AGRADECIMIENTOS... vi DEDICATORIA... vii RESUMEN... viii 1. INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES CONSERVACIÓN DEL SEMEN CAPRINO DILUCIÓN DILUYENTES caracteristicas de los diluyentes Crioprotectores no penetrantes Crioprotectores penetrantes DILUYENTES DE REFRIGERACION LECHE DE VACA YEMA DE HUEVO AGUA DE COCO DILUYENTES DE CONGELACIÓN REFRIGERACIÓN DE SEMEN CAPRINO CONGELACIÓN DE SEMEN CAPRINOY SUS CONSECUENCIAS SOBRE EL ESPERMATOZOIDE EFECTOS DEL CHOQUE FRÍO EFECTOS CAUSADOS POR LA CONGELACIÓN CONSECUENCIAS DEL PROCESO DE CONGELACIÓN SOBRE LAS CÉLULAS ESPERMÁTICAS JUSTIFICACIÓN HIPOTESIS GENERAL OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECIFICOS ii

3 6.-MATERIALY MÉTODOS Material biológico Equipo Obtención de semen Motilidad en masa Motilidad progresiva CONGELAMIENTO CON TRILADIYL Composición Recomendaciones para la aplicación Triladyl para semen caprino: Preparación del diluyente final Predilución y dilución del semen: TÉCNICA PROPUESTA POR WESTENDORF (1975) Componentes de los diluyentes Preparación TÉCNICA DE CONGELAMIENTO DESCONGELACIÓN valoración acrosomal Interpretación Análisis Estadístico RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA iii

4 INDICE DE CUADROS Tabla 1.- Concentración de yema de huevo utilizada por distintos autores para la refrigeración de semen caprino... 9 Tabla 2.- Porcentaje de glicerol utilizado por diversos autores en los diluyentes de congelación de semen caprino Tabla 3.-Clasificación de la motilidad masa para espermatozoides Tabla 4. Estado Fisiológico y acrosomico por tratamiento. Literales diferentes indican (p<0.05) iv

5 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Recolección de semen Figura 2.Motilidad en masa Figura 3. Triladyl Figura 4. Diluyente final de Triladyl Figura 5. Ingredientes para diluyente de la técnica usada por Bwanga en Figura 6. Diluyente A y B de la técnica usada por Bwanga en Figura 7. Interpretación acrosomal Figura 8. Espermatozoides teñidos con Triple Tinción. a. Vivo con acrosoma intacto; b Vivos con reacción acrosomal; c. Muerto con acrosoma intacto; d. Muerto con reacción acrosomal Figura 9. Porcentaje de espermatozoides en semen fresco Figura 10. Porcentaje de espermatozoides en semen estabilizado con Triladyl Figura 11. Porcentaje de espermatozoides descongelados con Triladyl Figura 12. Porcentaje de espermatozoides estabilizados con Bwanga (1990) Figura 13. Porcentaje de espermatozoides descongelados con Bwanga (1990).. 40 v

6 DEDICATORIA A mis padres, ANTONIO Y ESTHER por haberme enseñado e inculcado todo lo que soy, como persona, mis valores, mis principios y mi empeño. Especialmente a tí Madre Querida, la que nunca dejo de confiar en mí, la que estuvo hasta en los momentos más difíciles de mi trayectoria. Por darme esas palabras de amor y de aliento, en cualquier momento. A ti Padre gracias por estar a mi lado y significar tanto para mi, servirme como un pilar y tenerme esa confianza de ser alguien en la vida. Gracias por esta herencia tan hermosa que me regalaron los quiero y los amo mucho, siempre estaré muy agradecido con ustedes. A mi hermana DORA LUZ, por confiar y ser como mi segunda madre, cuidarme y estar a mi lado en mis primeros PININITOS de la educación. A mis hermanos FERNANDO Y ANTONIO, por darme palabras de aliento en los momentos más difíciles de mi carrera profesional y de su apoyo incondicional. En especial a Fernando por preocuparse y brindarme aliento en momentos muy duros de mi vida y estar siempre al pendiente de mí. A ADRIANA por su paciencia, comprensión, su empeño, su fuerza, su apoyo y principalmente por su amor. Y por darme un lindo y hermoso bebe Te amo. A mis cuñados MERECHE y EVA por su confianza y sus palabras de apoyo. vi

7 AGRADECIMIENTOS Agradezco a Dios antes que nada por haberme permitido finalizar con gran éxito esta etapa de mi vida y protegerme en todo momento. A la alta casa de estudios la Universidad Veracruzana por haberme abierto las puertas y permitirme ser parte de ella. A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia por haberme aceptado y cobijado todo este tiempo que permanecí. Al Dr. Manuel Barrientos Morales, investigador de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UV, por haberme permitido realizar este trabajo de investigación y tenerme la confianza. Por todo su apoyo incondicional en todos los momentos de asesoría, por su paciencia y más que nada por la amistad brindada. Al Dr. José Manuel Martínez Hernández, investigador de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UV, por sus críticas constructivas, sus conocimientos, el apoyo incondicional, por el tiempo brindado y por la amistad que surgió. Al Dr. Belisario Domínguez Mancera, investigador de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UV, por haberme permitido laboral a lado de usted, brindarme sus conocimientos y espacios para laborar en el trabajo de investigación así también, como la asesoría del análisis estadístico. Al MVZ M en C María Luisa Méndez Ojeda, por brindarme su amistad, sus buenos concejos, asesorías, críticas constructivas, haberme echado la mano en los momentos más difíciles que pase por la licenciatura y porque no decirlo por sus regaños. A mis queridos amigos y compañeros Cristian Velasco (El chipis), Rey Omar Hernández (El Topo), Abraham Salomón, Félix Gracia (El Gordito) no solo de aula si no de logros, bromas, metas, momentos alegres, tristes les agradezco su paciencia, su ayuda y lo más importante su amistad que hizo que se me hiciera muy ameno el servicio social y la realización de este trabajo de investigación. vii

8 RESUMEN Camacho García Oscar Criocapacitación de espermatozoides caprinos, procesados con dos diluyentes. Trabajo de Tesis de licenciatura. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. Veracruz, Veracruz, México. RESUMEN Con el propósito de evaluar la proporción de espermatozoides con estado acrosomal similar al que tienen aquellos que han pasado por reacción acrosomal, usando dos diluyentes para su criopreservación; se trabajó con semen caprino usando dos técnicas para congelamiento, la recomendada para Triladyl y la propuesta por Bwanga en El parámetro referido se evaluó en tres momentos durante al proceso de criopreservación: Fresco, estabilizado a 5 c y descongelado; se evaluaron los resultados en cada etapa y se hizo un análisis estadístico utilizado el programa STATISTICA v 7.0, para todos los análisis. Utilizando la tabla de contingencia 2X2 del modulo Non-parametrics distribution; para evaluar la diferencia entre grupos dentro del mismo experimento con un nivel de significancia de Se estudiaron 1500 células espermáticas, encontrando 85.33%, 67%, 58%, 56.33% y 40% de espermatozoides vivos con acrosoma intacto, en semen Fresco, Triladyl a 5 C, Bwanga a 5 C, Triladyl descongelados y Bwanga descongelado respectivamente (P<0.05). En este trabajo se encontró que independientemente del tratamiento utilizado en las técnicas de congelación, hubo diferencia entre el porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto, con respecto al semen fresco. En las poblaciones espermáticas tratadas en este estudio no se encontró diferencia estadística para el porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto en semen estabilizado a 5 C. El tratamiento con la técnica por Bwanga (1990) en este trabajo demostró una mayor estabilidad en el porcentaje de espermatozoides vivos con reacción acrosomal, entre las poblaciones estabilizadas a 5 C y las mismas descongelados. Palabras clave: acrosoma, criopreservación, semen, cabras. viii

9 1. INTRODUCCIÓN. La inseminación artificial (IA), es una técnica que consiste en depositar el semen por medios mecánicos en el tracto reproductor femenino, en el momento más oportuno, no existiendo contacto directo entre el macho y la hembra, para la inseminación de la hembra se utiliza semen fresco, diluido o congelado y la fertilización in vitro de los ovocitos (Mc Donald, 1991). Lo anterior ha hecho posible utilizar y difundir intensamente el potencial genético de sementales superiores en la población a un costo razonable. En algunas especies como los bovinos se ha ampliado consideradamente el uso de la técnica desde que se comenzó a utilizar en 1951, dependiendo casi exclusivamente del uso de semen criopreservado, mientras que en otras especies domésticas como los equinos, porcinos y ovinos se utiliza en menor proporción y generalmente en presentación líquida, no congelado (Curry, 2000). Los espermatozoides congelados poseen una menor capacidad de fertilizar que los espermatozoides provenientes del semen fresco, debido en parte a un porcentaje menor de motilidad progresiva después del congelamiento y el descongelamiento; sin embargo, este punto de vista ha cambiado ya que se encontró que aun al realizar una inseminación artificial intracervical con igual número de espermatozoides móviles, el resultado obtenido con el material congelado es inferior. Al respecto, se piensa que el espermatozoide al ser sometido al proceso de congelación sufre daño y solo sobrevive una cierta población de espermatozoides que probablemente son resistentes debido a que 1

10 sus membranas son inusualmente estables, por lo que de esta manera se estaría seleccionando una cierta población viable pero a la vez infértil (Watson, 1995). Los diluyentes del semen deben ser capaces de preservar la viabilidad del espermatozoide durante la transportación, almacenamiento e inseminación, para la sobrevivencia prolongar la vida espermática y por proporcionar un ambiente nutritivo adecuado (Martín-Rillo et al., 1996). Entre las características fisicoquímicas más destacables que debe tener un diluyente está la capacidad de regular el ph, disponibilidad para la utilización del esperma en el momento de reconstruir el producto, además de evitar el daño producido por la disminución de la temperatura y los cambios osmóticos (Gilmero et al., 1998). 2

11 2. ANTECEDENTES 2.1.-CONSERVACIÓN DEL SEMEN CAPRINO La I.A. en ganado caprino es una técnica poco utilizada en nuestro país, limitándose su uso a la utilización de semen fresco y refrigerado, y experimentalmente con semen congelado (Herrera et al., 1994). Sin embargo, los logros conseguidos en ganado ovino (Anel, 1994) y los avances conseguidos en el caprino (Amoah y Gelaye, 1997) han animado a los ganaderos, especialmente a los del sector lechero, a ampliar sus perspectivas de futuro, al implementar la I.A. como técnica imprescindible para mejorar la producción individual. Una de las grandes ventajas que presenta la I.A. es la utilización de sementales de gran valor genético para inseminar un número mayor de hembras que las que podrían cubrir por monta natural (Maxwell y Evans, 1990), debido a que tras la dilución del semen se consigue un aumento del volumen del eyaculado, obteniendo un mayor número dosis seminales. La conservación del semen mediante refrigeración (entre 5 C ó 15 C) o congelación tiene como objetivo fundamental prolongar la viabilidad de los gametos masculinos, durante horas/días o indefinidamente, ya que a temperatura ambiente los espermatozoides degeneran con cierta rapidez debido, principalmente, al agotamiento de las reservas energéticas. La selección del semen previa refrigeración o congelación de los mismos, proporciona dosis seminales con calidad inicial suficiente para ser utilizadas independientemente de la estación del año en que hayan sido obtenidas (Roca et al., 1992; Aguado et al., 1994). El semen eyaculado debe cumplir una serie de valores mínimos (volumen, 3

12 concentración y movilidad) que indiquen la conveniencia de aceptarlos para su posterior conservación DILUCIÓN La dilución de los eyaculados tiene como objeto aumentar el volumen y mantener una concentración espermática adecuada para dar servicio al mayor número posible de hembras. El titulo de dilución depende tanto del volumen de inseminación (varía en función del tipo de inseminación: vaginal, cervical, intrauterina) como de la concentración de espermatozoides móviles con la que queremos inseminar, ya que independientemente del lugar de la inseminación, el número de espermatozoides móviles esta correlacionado con la fertilidad (Maxwell y Evans, 1990; Ritar et al., 1990). La dilución aconsejada en semen caprino varía enormemente entre autores. Algunos investigadores obtienen mejores resultados con títulos de dilución 1:10 mejor que 1:1 (Memon y Ott, 1981; Ritar Sahni y Tiwari, 1992; Ritar y Ball, 1993), existiendo otros trabajos que apuntan a las diluciones superiores a 1:1 como las responsables de un descenso de la fertilidad (Salamon y Bitar, 1982; Park, 1989). La bibliografía no parece aconsejar diluciones superiores a 1:5 de los eyaculados destinados a la elaboración de dosis seminales incluidas en programas comerciales de l.a DILUYENTES Existe una gran variedad de diluyentes y métodos empleados para la conservación del semen caprino; Sin embargo, todos los medios empleados para este fin, prolongan la viabilidad de la célula espermática por un período limitado de tiempo 4

13 (refrigeración) o indefinidamente (congelación), lo que aumenta la rentabilidad del número de dosis obtenidas por eyaculado CARACTERISTICAS DE LOS DILUYENTES Diversos autores informan que los diluyentes empleados en la conservación de células espermáticas deben cumplir una serie de condiciones (Fiser et al., 1981; Abdelhakeam et al., 1991; Pérez Fuentes et al., 1993; Garde et al., 1995): 1. Ser isotónico con el plasma seminal (320 mosm/kg) cuando es utilizado en refrigeración, e hiperosmótico (400 mosm/kg) en congelación. 2. Poseer un pk próximo a 7 y capacidad tampón con el fin de mantener el ph en la neutralidad, compensando la producción de ácido láctico durante la congelación. 3. Contener moléculas que protejan a los espermatozoides frente al frío, clasificadas en función de su capacidad de penetrar la membrana plasmática en: sustancias crioprotectoras penetrantes y no penetrantes. 4. Contener en su constitución una fuente de energía, siendo la glucosa y fructosa las más utilizadas. 5. Estar libre de bacterias y contaminación, para lo cual se utilizan antibióticos en su formulación. 6. Aumentar el volumen substancialmente con el fin de poder realizar múltiples servicios de inseminación. 7. El ph óptimo de los diluyentes empleados en la conservación espermática se mantiene en torno a la neutralidad (Vázquez et al., 1986; Dunner, 1991), lo que hace necesaria la presencia de soluciones tampones para su mantenimiento. Los 5

14 tampones deben tener un pk entre 6 y 8 (preferiblemente 7), máxima solubilidad en agua, deben atravesar selectivamente la membrana plasmática, reducir el efecto de la concentración de sales, tener propiedades quelantes, ser estables y resistir la degradación enzimática (Oraham, 1978). Si bien las soluciones tampones más comúnmente empleadas son el citrato, fosfato y bicarbonato sódico, estudios más recientes muestran los compuestos zwitteriónicos ó anudoorgánicos como el BES, TES, TRIS, HEPES, MES y PIPES con mayor capacidad estabilizadora (Oraham, 1978b; Vázquez et al., 1988; Duner, 1991; Molina et al., 1996). Los azúcares presentes en los diluyentes ejercen un efecto positivo sobre la viabilidad espermática debido a su aporte energético al espermatozoide (Maxwell y Evans, 1990) al ser capaces de metabolizar glucosa, fructosa, manosa y arabinosa, esta última por vía oxidativa y a su acción como crioprotectores, contribuyendo a mantener el equilibrio osmótico (Molina et al., 1990; Dunner, 1991). Otra particularidad de los medios para la conservación espermática es la presencia de crioprotectores. Dichas moléculas, de características bien definidas en cuanto a tamaño y permeabilidad, protegen las estructuras celulares frente a las bajas temperaturas, siendo beneficiosa su adición en refrigeraciones a bajas temperaturas +50 C y necesaria en la congelación. Los crioprotectores pueden clasificarse atendiendo al grado de la siguiente manera: Crioprotectores no penetrantes Son aquellos que al ser incorporados en el medio de dilución recubren la membrana plasmática del espermatozoides protegiendo su estructura de la acción 6

15 del frío. En ningún momento atraviesan la membrana espermática debido a su alto peso molecular o especificidad. Destacan por su utilización los azúcares glucosa, lactosa y fructosa así como, las proteínas de la leche descremada y yema de huevo (Corteel, 1981; Maxwell y Evans, 1990; Salamon y Maxwell, 1995) Crioprotectores penetrantes Son aquellos capaces de penetrar en la célula de forma uniforme evitando el estrés osmótico, produciendo deshidratación celular por sustitución del agua intracelular, amortiguando el incremento de la concentración de solutos del medio extracelular e impidiendo la formación de cristales de hielo en el interior. Destaca por su utilización el glicerol, dimetil-sulfóxido (DMSO), propilenglicol, etilenglicol, metanol y etanol (Deka y Ralo, 1985; Salamon y Maxwell, 1995); Singh et al., 1995, La adición de antibióticos a los distintos diluyentes es opcional, si bien se recomienda su utilización como forma de control de la población de gérmenes presentes en el eyaculado. Los antibióticos más utilizados son la penicilina G- sódica y el sulfato dihidro-estreptomicina DILUYENTES DE REFRIGERACIÓN Los diluyentes de refrigeración son soluciones acuosas tamponadas a las que se les añade una fuente de energía (glucosa, fructosa) y un crioprotector no penetrante, que es opcional dependiendo de la temperatura y tiempo de refrigeración (leche descremada o yema de huevo). Algunos diluyentes de refrigeración incorporan antioxidantes o agentes quelantes de manera experimental, observándose un aumento en el porcentaje de fertilización in vitro 7

16 en los diluyentes que incorporan en su composición SOD (superoxido dismutasa) y catalasa (Hanmerstedt, 1993). Los diluyentes han de preservar la viabilidad espermática a una temperatura de +15 C ó +5 C durante un mínimo de 6 horas. Tiempos mayores de refrigeración implican un beneficio para el inseminador, al posibilitar un aumento del área de trabajo y facilitar el manejo en general LECHE DE VACA La leche de vaca es un diluyente ampliamente utilizado a las características seminales del macho. La leche de vaca puede emplearse tanto entera, descremada, UHT o en polvo para reconstituir, siendo esta última la más universal. Excepto en el caso de la leche UHT, las demás formas de leche han de ser calentadas hasta una temperatura de C durante 8-10 minutos, sin llegar a hervir (tindalización), con el objetivo de anular los factores tóxicos de su fracción proteica (Maxwell y Evans, 1990). El diluyente a base de leche descremada reconstituida más utilizado en la refrigeración de semen caprino es el de Corteel (1981), con buenas propiedades conservantes a una temperatura de +15 C, aunque se muestra ineficaz a +5 C, siendo de complicada elaboración y conservación (Guérin,1990) YEMA DE HUEVO La otra gran alternativa como crioprotector externo a la leche de vaca y constituye la yema de huevo de gallina. Los huevos han de ser frescos, con no más de 4 días desde la puesta hasta el momento de su utilización (Maxwell y Evans, 1990). En el caso de no disponer de huevos frescos se puede utilizar yema de huevo desecada para la realización de los diluyentes (Montero et al., 1995). La concentración de 8

17 yema de huevo utilizada en la conservación de semen caprino es menor que en otra especie (ovina, porcina), debido a las propiedades antes indicadas de la fosfolipasa A, que en presencia de calcio es capaz de hidrolizar las lecitinas de la yema de huevo en lisolecitinas y ácidos grasos libres. La cantidad de yema de huevo utilizada varía según los autores, siendo las concentraciones mayores utilizadas tras la eliminación del plasma seminal (Tabla 1). Tabla 1.- Concentración de yema de huevo utilizada por distintos autores para la refrigeración de semen caprino Diluyente % Yema de Huevo. Referencia. Tris Glucosa Tris Cítrico Glucosa Ritar y Salamon, 1982 Ritar et al., 1990 Tris Fructosa 10 Azawi et al., 1993 Tris Cítrico Fructosa 5 Stojanov et al., 1994 Tris Roca et al., 1994 La incorporación de la yema de huevo se realiza sobre el volumen final del diluyente base, homogeneizándose adecuadamente. Para la eliminación de las partículas groseras se procede a la centrifugación del diluyente a 500 g durante 35 minutos. 9

18 AGUA DE COCO La utilización del agua de coco como diluyente se presenta como un método alternativo en la conservación del semen caprino. Dentro de las alternativas de los diluyentes pobres en fosfolípidos, se ha demostrado que el agua de coco favorece la conservación del semen caprino (Nunes, 1993a). La movilidad y el porcentaje de espermatozoides vivos en semen caprino refrigerado a +4 C con agua de coco son significativamente superiores a los obtenidos con leche. La supervivencia espermática, esta alrededor de las 60 horas en agua de coco frente a las 12 horas en un medio de leche (Nunes, 1993 a), observándose un aumento de la fertilidad en las cabras inseminadas con agua de coco frente a las inseminadas con leche así como un mayor número de nacimientos de hembras (Nunes, 1993 a). El uso de la leche de coco como diluyente de conservación en semen caprino está menos extendido debido a su mayor contenido en fosfolípidos (Nones 1993b), si bien se han encontrado resultados satisfactorios tras su utilización (Balakrishnan y Neelakanta, 1982) DILUYENTES DE CONGELACIÓN La posibilidad de almacenar dosis de semen por un período indefinido de tiempo para su posterior utilización, es una de las mayores ventajas que presenta la congelación dentro de los programas de I.A. Las causas de mayor mortalidad espermática durante la congelación se deben al aumento de la concentración de sales, formación de cristales de hielo en el interior del espermatozoide, cambios en el ph, desnaturalización de proteínas y rotura mecánica de elementos estructurales, durante el proceso del cambio de estado. La protección de los 10

19 espermatozoides durante el descenso de temperatura durante la congelación se consigue mediante la incorporación de crioprotectores al diluyente base, tal y como se indicó en el apartado de diluyentes (Deka y Ralo 1985; Singh et al., 1995; Salamon y Maxwell, 1995). El glicerol es el crioprotector penetrante más ampliamente utilizado debido principalmente a su capacidad tampón con las sales, minimizando el daño electrolítico y la formación de cristales de hielo (Deka y Ralo, 1985a; Salamon y Maxwell, 1995). La adición del glicerol en función de la concentración espermática muestra los mejores resultados post-descongelación (Salamon y Ritar, 1982). Si bien, existen otros crioprotectores utilizados en la congelación espermática como el DM50 o etilenglicol, es el glicerol el que manifiesta resultados posteriores a la descongelación superiores, (Deka y Ralo, 1985a; Singh et al, 1995; Salamon y Maxwell, 1995; Singh et al., 1996) La concentración de glicerol empleada en la preparación de los diluyentes varía según los autores, manteniéndose entre el 3 y 11% (Tabla 2). Dicha variabilidad depende principalmente del diluyente base empleado y su sistema de dilución, así como de la temperatura a la cual se añade dicho diluyente glicerado (Tuli y HoItz, 1994). En general, los mejores resultados pos-descongelación se obtienen tras la utilización de concentraciones intermedias de glicerol (4 y 6%) (Deka y Ralo 1986; Sinha et al., 1992; Tuli y Holtz, 1994). Las concentraciones de glicerol utilizadas en semen ovino también oscilan en este rango, si bien en ovino se puede llegar a anular su adición tras un aumento del porcentaje de la yema de huevo hasta el 30% (Abdelhakeam et al., 1991; Artiga et al., 1993). 11

20 Tabla 2.- Porcentaje de glicerol utilizado por diversos autores en los diluyentes de congelación de semen caprino %Glicerol Diluyente Referencia 3-11 Cítrico Glucosa* Chauhan et al., Tris Glucosa* Pérez y Mateos, BesKOH* Duner, Tris Citrico Glucosa* Ritar y BalI, Leche descremada Sinha et al., Tris Cítrico Glucosa* Ritar et al., Tris Cítrico Glucosa* Ritar y Salamon, Tris Glucosa* Watson, Tris Cítrico Fructosa* Berger, Tris Glucosa* Singh et al., 1995 (*) Diluyentes con yema de huevo. La adición del glicerol se puede realizar en una o varias etapas (Corteel, 1975; Bela y Bao, 1985b; Salamon y Maxwell, 1995; Tuli y Holtz, 1994; Salamon y Maxwell, 1995) y a una temperatura de +37 C, +22 C o +5 C. El efecto tóxico del glicerol es menor si se añade a +5 C, sin embargo, la velocidad de penetración también es menor, por lo que se habrá de aumentar el tiempo de equilibración (Corteel, 1975). 12

21 La adición del glicerol a temperatura ambiente permite una penetración más rápida del agente, si bien ejerce una acción más tóxica sobre los espermatozoides al estar más tiempo en contacto con los mismos (Salamon y Bitar, 1982; Salamon y Maxwell, 1995). La mayoría de los medios utilizados para la crioconservación espermática son hipertónicos con respecto al plasma seminal (Fiser et al, 1981). El aumento de la presión osmótica (PO) de los medios facilita la salida de agua al medio extracelular con el fin de equilibrar las concentraciones a ambos lados de la membrana plasmática, produciendo un mayor grado de deshidratación en el espermatozoide y por consiguiente reduciendo la formación de hielo en su interior, obteniendo unos resultados mejores tras la descongelación (Fiser et al., 1981). Al igual que ya ocurriera con los diluyentes de refrigeración, algunos medios de congelación muestran en su composición antioxidantes como crioprotectores, si bien esta faceta continúa en investigación (Stojanov et al, 1994) REFRIGERACIÓN DE SEMEN CAPRINO La refrigeración implica un descenso de temperatura del eyaculado desde los +3 C (temperatura de dilución) hasta los +15 C ó +5 C (temperaturas de conservación óptimas), siendo la temperatura de refrigeración utilizada inversamente proporcional al tiempo de conservación (Vázquez et al, 1986). El descenso de la temperatura ha de realizarse de forma suave y progresiva. El período de refrigeración del semen caprino está en función de la temperatura, método y diluyente empleado, oscilando entre 2 y 126 horas según los diversos autores (Corteel, 1981; Guérin, 1990; Sahni y Tiwari, 1992; Nunes, 1993a). Sin 13

22 embargo, el descenso de la viabilidad espermática observada a lo largo del tiempo solo hace posible la inseminación con eyaculados refrigerados durante 6-10 horas CONGELACIÓN DE SEMEN CAPRINO Y SUS CONSECUENCIAS SOBRE EL ESPERMATOZOIDE EN LOS PROGRAMAS DE SELECCIÓN DE UNA RAZA Se utilizan dosis de semen congeladas para l.a. La difusión de material genético mejorado sin límite geográfico (debido a su fácil transporte) ni de tiempo, hace que esta técnica sea imprescindible. Los resultados de fertilidad obtenidos con semen congelado son inferiores a los encontrados en semen refrigerado, existiendo grandes variaciones dependiendo de la composición del diluyente, calidad inicial del semen y su tratamiento, lugar de deposición de la dosis, momento de la inseminación, número de inseminaciones, tipo de sincronización, estación del año y raza (Corteel, 1975; Moore et al., 1989; Chauhan y Mjand, 1990; Ritar y BalI, 1993; Sinha et al., 1995). Lo anterior quizás como consecuencia, de los cambios ocasionados por el procesó de congelación-descongelación EFECTOS DEL CHOQUE FRÍO Cuando el semen de ciertas especies de mamíferos es enfriado rápidamente a temperaturas próximas a los 0 C, un gran porcentaje de células espermáticas aparecen inmóviles, se incrementa el número de espermatozoides muertos y de formas anormales, alterándose la distribución de los lípidos de membrana y aumentando el calcio intracelular (Watson 1990). Milovanov en 1934, denominó a este fenómeno choque térmico, conociéndose actualmente como choque frío (Watson, 1990). 14

23 La susceptibilidad de los espermatozoides al choque frío se ve afectada en función de la especie animal de la cual provengan los gametos. En este sentido, se ha observado que las células espermáticas de morueco son altamente sensibles a este fenómeno, siendo las de conejo y humano de las más resistentes (Fiser, 1989). Las membranas celulares y la estructura acrosomal son las regiones espermáticas más afectadas por dicho proceso (Pursel et al., 1972; Holt et al., 1992). De igual modo que la estructura celular sufre alteraciones, la bioquímica espermática es susceptible de modificaciones por el choque frío. Así se han referido cambios en el metabolismo espermático de los carbohidratos (Mann y Lutwakman, 1981), perdida de ciertas enzimas (Moore et al., 1976) eliminación de algunos lípidos de membrana (Pickett et al., 1961) y desequilibrios en la distribución de cationes (Watson, 1990). Este mismo autor indica que el choque frio induce una alteración súbita e irreversible en las membranas celulares, cuyo efecto se ve acentuado por la incubación de las muestras a temperaturas de 37 C, pero no a temperaturas de 21 C a partir de entonces numerosos autores han explicado estos hechos por una pérdida de componentes de membrana que aumenta la permeabilidad celular (Watson, 1979). La susceptibilidad al choque frío viene determinada por el contenido de colesterol en las membranas y por la proporción de ácidos grasos poliinsaturados que están presentes en los fosfolipidos, ya que ambos fenómenos influyen en la fluidez de las membranas celulares (Watson, 1979). La relación colesterol/fosfolipidos es un hecho determinante de la fluidez de la membrana. El colesterol modula la fluidez de membranas por interacción con los ácidos grasos de los fosfolipidos. 15

24 Las especies que tienen elevadas relaciones colesterol/fosfolipidos son las que mejor resisten los cambios de temperatura. Así Darin-Bennett y White (1977), observaron que en las especies resistentes al choque frío, conejo y hombre la relación molar colesterol/fosfolipidos en sus membranas espermáticas era de 0.88 y 0.99 respectivamente; mientras que en las especies catalogadas como sensibles a esta relación es inferior 0.46 (bovino: 0.45 y Oveja 0.30). Con concentraciones similares de ambos grupos de lípidos, se mantiene la fluidez de la membrana y no se produce la separación lateral de las cadenas lipídica, por lo que las proteínas intrínsecas no son desplazadas, conservándose así la integridad del plasmalema. Otros factores que influyen en la sensibilidad al choque frío, además de la especie de la cual procedan los espermatozoides, son el grado de maduración celular (Quinn et al., 1969), la variabilidad individual (Pursel, 1973) y la presencia de plasma seminal (Quinn et al., 1968). Estos parámetros van incidir en la composición de las membranas celulares, originando variaciones en la estructura lipídica de las mismas, siendo estos hechos determinantes en la fluidez de la membrana plasmática. El choque frío va a originar un aumento de la concentración de calcio intracelular que puede desencadenar procesos de fusión de membranas (Watson 1990). 16

25 2.9.-EFECTOS CAUSADOS POR LA CONGELACIÓN. Las suspensiones celulares, al enfriarse gradualmente por debajo del punto de congelación de la solución se congelan y empieza la formación de cristales de hielo en el exterior (espontáneamente o como resultado de la inducción a la cristalización), aumentando la concentración de solutos en el medio extracelular (Mazur, 1980; Watson, 1990). Sin embargo, el contenido de las células queda sin congelar ya que la membrana celular bloquea la expansión del hielo que casi siempre se forma en la solución externa. A medida que disminuye la temperatura el agua celular sale de la célula como respuesta a la mayor presión osmótica externa y se congela. Uno de los factores externos que pueden manipularse para la regulación de esta exósmosis es la velocidad de congelación (Fiser, 1989). Cuando la tasa de congelación es lo suficientemente lenta, los espermatozoides pierden el agua congelable por exósmosis evitándose así, la formación de hielo extracelular; Sin embargo, si las células se enfrían rápidamente el agua celular no abandona la célula antes de congelan entonces tiene lugar la formación de cristales intracelulares. Mazur (1965), propuso que durante la congelación existen dos factores con dependencia opuesta de la velocidad de enfriamiento que van a ser los causante de los daños producidos por este fenómeno en cualquier tipo celular, existiendo una velocidad óptima de congelación fuera de la cual la supervivencia celular se ve comprometida. El empleo de velocidades de congelación superiores a la óptima impide al agua intracelular abandonar la célula antes de congelarse y congelarse provocándose la muerte celular por la formación de cristales de hielo; mientras que cuando se emplean tasas sub optimas de congelación las lesiones se originan 17

26 por la deshidratación celular, que trae consigo una prolongada exposición de las células a elevadas concentraciones de solutos, con deshidratación y aumento de la concentración del crioprotector, cambios de ph y precipitación de sales (Lovelock, 1953) Mazur (1965) denominó a estos cambios EFECTO SOLUCIÓN por el empleo de tasas de congelación lentas. Por lo tanto, se deben utilizar velocidades de congelación intermedias que aumentan la tasa de supervivencia celular posdescongelación (Watson, 1990). La formación de hielo intracelular va a originar la ruptura de ciertas estructuras celulares y la desorganización de las membranas plasmáticas y acrosomal, con alteraciones en la fase lipídica y desplazamiento de las proteínas intrínsecas (Mazur, 1980; Watson, 1990). La concentración de solutos, produce la desnaturalización de los componentes de la membrana plasmática y la deshidratación celular disminuyendo su volumen hasta un mínimo donde se compromete la integridad estructural de la célula (Watson y Duncan, 1988) CONSECUENCIAS DEL PROCESO DE CONGELACIÓN SOBRE LAS CÉLULAS ESPERMÁTICAS. Cuando una muestra seminal es congelada y descongelada un gran número de espermatozoides aparecen fuertemente dañados y por tanto son disfuncionales. Sin embargo, recientes estudios demuestran que aún las células espermáticas que resisten estos procesos pueden ver su función afectada (Watson 1990). Actualmente y a la vista de los trabajos realizados por diferentes autores, (Wheler y Seidel, 1986; Crtser et al 1987; Slavik 1987; Berg et al, 1990;Jabbour y Evans, 1991), se puede deducir que los fenómenos que acontecen en torno a la 18

27 congelación van a alterar la fisiología de las células espermáticas, desencadenado un estado de capacitación prematuro, que origina la reacción acrosomal de una forma acelerada reduciéndose con ello la viabilidad celular y por tanto el poder fecundante de dichas células (Clarke y Jonson, 1987), ya que tras sufrir la reacción acrosomal la vida del espermatozoide se encuentra muy limitada (Yanagimachi, 1988). En la actualidad no se conoce con exactitud la causa desencadenante de este estado prematuro de capacitación. Existe evidencia de un incremento del porcentaje de penetración de ovocitos de hámster libres de zona pelúcida por espermatozoides de ovino incubados en presencia de un 10% de glicerol con respecto a muestras control preincubados en ausencia de dicho crioprotector, estableciéndose el glicerol como agente causal de estos fenómenos (Slavik, 1987); Sin embargo, también se ha demostrado un aumento en la tasa de fertilización de ovocitos homólogos por semen ovino congelado, atribuyéndose este hecho a la inducción in vitro de la capacitación por tampones aminoorgánicos como TES y el TRIS (Berg et al., 1990). No obstante otros estudios realizados en la especie humana (Critser et al., 1987) bovina (Wheeler y Seidel, 1986) o porcina (Clarke y Jonson, 1987) atribuyen estos cambios en la función de la célula espermática a los procesos de congelación y descongelación propiamente dichos. Slavik (1987), reportó que el glicerol sería el desencadenante de estado prematuro de capacitación en el espermatozoide al esterificarse con los ácidos grasos volátiles de los fosfolipidos de la membrana. Estos ácidos funcionan como elementos estabilizadores del acrosoma, por ello tras su eliminación, las 19

28 membranas espermáticas se desestabilizan y la reacción acrosomica se inicia (Lui y Meizel, 1979). Cuando los ácidos grasos se unen al glicerol se altera el equilibrio de los fosfolipidos, los cuales se ha comprobado desencadenan la reacción acrosomica en el cobayo (Fleeming y Yanagimachi, 1981). Según Watson, 1990, de las lesiones originadas en las membranas durante el enfriamiento y la congelación las responsables de estos cambios. Cuando el semen es diluido origina una entrada de calcio al espermatozoide, siendo este influjo proporcional al grado de dilución. Este exceso de calcio va a ser eliminado al exterior por unas proteínas transportadoras llamada Bombas de calcio cuando los espermatozoides se mantienen a temperaturas que oscilan entre los 25 y los 39 C. Otra alternativa es que el proceso de congelamiento por si mismo genera modificaciones en las membranas celulares. Curry (2000), reporta que las membranas citoplasmáticas del espermatozoide congelado tienen una menor capacidad de resistir un estrés osmótico que un espermatozoide fresco. Estudios de criofractura de las membranas espermáticas después del proceso de congelado-descongelado indican cambios morfológicos de carácter irreversible, sugerentes de un proceso de separación de faces presumiblemente inducido por la transición de faces lipídica durante el proceso de enfriamiento y descongelado (de Leeuw, 1990). Buhr (1994), encontró cambios en la fluidez de la membrana plasmática del espermatozoide porcino durante el enfriado, congelado y descongelado y también algunos de estos eran irreversibles. Este aumento en la permeabilidad de la membrana por el enfriamiento se manifiesta permitiendo la 20

29 entrada de calcio al interior de la célula (Watson, 1995), por lo que al parecer la membrana citoplasmática de la cabeza del espermatozoide presenta un estado de capacitación parcial de penetración de la zona pelúcida de ovocitos de hámster inmediatamente después de ser descongelados (Critser et al., 1988), además el análisis de la composición lipídica indica que existe una modificación en la composición de lípidos en la membrana (Buhr et al., 1994). La consecuencia de este proceso de desestabilización de las membranas para el enfriamiento o congelado es que el espermatozoide experimenta una prematura reacción acrosomal, acortándose así la vida reproductiva del espermatozoide y con la consecuente reducción de la fertilidad cuando se insemina cervicalmente (Marshburn et al., 1992). La supervivencia en este caso es limitada por que el espermatozoide capacitado no tiene una vida prolongada, se activa en forma preparatoria a la unión con el ovocito y si esto no ocurre en un corto tiempo, este morirá (Marshburn et al., 1992). El daño producido a la célula espermática durante el proceso de congelamiento ha sido ampliamente estudiado desde diferentes enfoques, algunos investigadores han estudiado la viabilidad espermática durante el proceso de enfriamiento, desde la temperatura de cuarto hasta la formación de hielo (regularmente a -5 c), encontrando que el espermatozoide muestra una pérdida de la integridad de la membrana plasmática y de su función celular cuando es enfriado rápidamente en el rango de temperatura de 0 a 20 C, siendo mayor el daño en el rango de 2 a 12 C, al parecer este daño se continua por debajo de 0 c hasta -10 c, aunque se considera de menor magnitud (Gao et al., 1993; Watson, 21

30 1995). La explicación a este fenómeno no es totalmente clara, pero se supone que en esta etapa los cambios de temperatura ocasionan que los lípidos de la membrana plasmática del espermatozoide sufran un cambio en su estado físico; siendo este una transición de la fase del estado liquido-semicristalino al estado de gel. Esta modificación hace que la membrana se vuelva rígida y pierda elasticidad. Uno de los rangos de temperatura identificados en el cual ocurre este cambio en los espermatozoides de mamíferos, entre 10 c y 17 c (Holt y North, 1994). En los invertebrados acuáticos se han identificado otro rango de temperatura a la que ocurre una transición de faces alrededor 0 c (Crowe et al., 1989). Con estos hallazgos algunos investigadores retrasaron el tiempo de enfriado a la temperatura de 15 c por 3 horas (Maxwell y Jonhson, 1997) al logrado mejorar la viabilidad en los espermatozoides porcinos y otros aumentaron el tiempo de enfriado hasta 0 c y -5 c, han mejorado la viabilidad del semen en cabras (Medrano, 2001). Lo anterior hace suponer que si extendemos el tiempo de enfriado previo a la congelación se permitirá el reacomodo transversal y dominios de la estructura tridimensional lipídica de la membrana plasmática permitiéndole mantener su estabilidad y funcionalidad, disminuyendo la incidencia del proceso de capacitación espermática anticipado, aumentando con esto su capacidad de fertilización en el semen caprino. 22

31 3.-JUSTIFICACIÓN El proceso de criopreservación de espermatozoides ha demostrado, causar cambios similares a la capacitación espermática in vitro en bovinos, porcinos y ovinos, sin embargo la información referente a caprinos es escasa y más aún en climas cálidos. 4.-HIPOTESIS GENERAL. Los cambios parecidos a la capacitación espermática en espermatozoides caprinos son diferentes de acuerdo al diluyente utilizado para su criopreservación. 5.-OBJETIVOS 5.1.-OBJETIVO GENERAL Evaluar la proporción de espermatozoides con estado acrosomal similar al que tienen aquellos que han pasado por capacitación espermática, usando dos diluyentes para su criopreservación 23

32 5.2.-OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Evaluar la proporción de espermatozoides caprinos con cambios similares a los ocurridos durante el proceso de reacción acrosomal en semen fresco de caprino. 2. Determinar la proporción de espermatozoides con cambios similares a los ocurridos durante el proceso de reacción acrosomal en semen congelado utilizando la técnica de Triladyl. 3. Determinar la proporción de espermatozoides con cambios similares a los ocurridos durante el proceso de capacitación espermática al semen congelado utilizando la técnica propuesta por Bwanga (1990). 4. Comparar los resultados de ambas técnicas. 24

33 6.-MATERIALY MÉTODOS El trabajo se realizó en el Laboratorio de Biología de la Reproducción y el modulo de ovinos y caprinos, del Rancho Torreón Del Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana Material biológico 3 eyaculados de un semental caprino Equipo Vagina artificial (MINITUBE). Microscópio óptico (OLYMPUS CX41). Laminillas (portaobjetos y cubreobjetos). Termómetros de mercurio (-10 a 110 C) Baño maría. Termo con nitrógeno líquido (MBE MILENIUM 20/20) Centrífuga (IEC centra GP8R). 25

34 6.3.- Obtención de semen Se colectaron 3 eyaculados de un macho de raza Boer de 2.5 años de edad, con un peso de 56 kilogramos. Se utilizo una vagina artificial, mediante el estímulo térmico (42 C) y mecánico (presión), imita las condiciones de la vagina de la hembra. Antes de la recolección se hizo una limpieza de la zona del prepucio, con agua y toallas absorbentes, secando perfectamente el agua para evitar contaminación del eyaculado (Figura 1). El semen del obtenido fue diluido en solución de Ringer con lactato de sodio, PBS y dextrosa, (Monohidrato, polvo, J.T.Barker ) a 37 C, en una proporción 1:9, para ser transportado al laboratorio, protegido de la luz. Figura 1. Recolección de semen. 26

35 6.4.-Motilidad en masa Para el análisis de motilidad en masa, se coloco una gota de semen sobre un portaobjeto limpio y seco a 37 C; se observo con un microscopio, (óptico OLYMPUS CX41), a un aumento de 10 y 40X. La evaluacion de la motilidad se determinó con base en el vigor de las ondas espermáticas, para dar un valor entre 0 y 5 (Salamon et al., 1990; tabla 3.) Tabla 3.-Clasificación de la motilidad masa para espermatozoides. Valor Clase Descripción 5 Muy buena Ondas y remolinos de movimiento muy rápidos 4 Buena Movimientos vigorosos, pero las ondas y remolinos no son rápidos 3 Regular Ondas de movimiento lento 2 Pobre No se aprecian ondas, pero si movimiento de la muestra 1 Muy pobre Muy poco movimiento 0 Muertos Ningún movimiento Adaptado por Salamon et al., Motilidad progresiva Se utilizo una gota de semen diluido en una gota de solución salina fisiológica sobre un portaobjeto limpio, seco a 37 C, se cubrió con un cubreobjetos y se 27

36 observo al microscopio óptico, a un aumento de 10 y 40X, se observaron varios campos y se valoro el porcentaje de espermatozoides motiles entre 0 y 100 %. (Figura 2) Figura 2. Motilidad en masa. 7.-CONGELAMIENTO CON TRILADIYL 7.1.-Composición Triladyl es un buffer que contiene TRIS, Ácido cítrico, azúcar, Glicerina, agua purísima y antibióticos, de acuerdo a la Directiva 88/407 de la UE (Tilosina, Gentamicina, Espectinomicina, Lincomicina). Triladyl CSS no contiene antibióticos. Sin embargo, se dispone de un mezcla de antibióticos en polvo, adecuado para el procesamiento de semen en dilución de 1 paso, de acuerdo a la norma CSS (Minitube, 2010), Figura 3). 28

37 Figura 3. Triladyl Recomendaciones para la aplicación Colección de semen: Al momento de la colección, la temperatura interna de la vagina artificial no supero los 42º C, para evitar daños celulares producidos por temperatura excesiva Triladyl para semen caprino: Para la preparación del diluyente destinado a la congelación de semen caprino, se requirió menos yema de huevo que para el diluyente destinado a semen bovino u ovino. Se utilizó sólo 5%, lo cual correspondió a un volumen de 60 ml. Las cantidades de Concentrado de Triladyl (250 g) y agua desionizada (750ml) se mantuvieron iguales Preparación del diluyente final El diluyente para su uso se compuso de una parte de Concentrado de Triladyl, tres partes de agua desionizada y una parte de yema de huevo, de modo que el diluyente contuvo 5% de yema de huevo. Se inició la preparación vaciando a un frasco completo de concentrado de Triladyl (250 g) en una probeta graduada, agregándole 750 ml de agua 29

38 desionizada. Esta solución madre es estable y puede conservarse a temperatura de 5º C por hasta una semana. A continuación, se separó completamente la yema de huevo fresca de la clara de huevo y de sus membranas y se pesaron 60 g en una balanza (METTLER TOLEDO). La solución madre se agrego en varios pasos a la yema de huevo, mezclándola cuidadosamente. Para el desarrollo completo de las cualidades de conservación del Triladyl, se tuvo cuidado de que la solución madre se adicionó a la yema de huevo y no en sentido contrario. El diluyente se filtró a continuación por un filtro de diluyente estéril o una compresa de gasa estéril. Figura 4. Diluyente final de Triladyl. 30

39 7.5.-Predilución y dilución del semen: Después de la colección, el eyaculado se coloco en baño-maría de 28ºC a 32º C. Tras el examen macroscópico y la evaluación al microscopio, el eyaculado fue prediluido dentro de su vaso de colección en proporción 1:9 vertiendo lentamente el diluyente a lo largo de la pared del vaso. Una vez calculado el volumen total del diluyente, la mezcla se vertió por la pared interna a un envase temperado de mayor tamaño, previamente enjuagado con diluyente. A continuación se adiciono el volumen de diluyente faltante a la dilución anterior, agitando suavemente el envase para favorecer la dispersión homogénea del semen en el diluyente. (Figura 4) El semen, el diluyente y los envases de vidrio deben estar siempre a igual temperatura que el semen, para evitar un shock térmico de las células espermáticas. El semen prediluido se retiro del baño maría para continuar su proceso a temperatura ambiente. El envasado se efectuó a temperatura ambiente. 8.-TÉCNICA PROPUESTA POR BWANGA (1990) El semen fue procesado de acuerdo con el método de Westerdof modificado por Bwanga et al. (1990). Sin embargo, se uso un 7% de Glicerol en lugar del 4% usado por el autor Componentes de los diluyentes. Para el procedimiento de congelación de semen los diluyentes, fueron preparados el mismo día de su uso y serán los siguientes: 31

40 Diluyente A. 1) Dextrosa 2.5 g. 2) Yema de huevo 10 ml. 3) Agua destilada 50 ml. Diluyente B. 1) Dextrosa 2.5 g. 2) Yema de huevo 10 ml. 3) Glicerol 14 ml. 4) Agua destilada 50 ml Preparación. Diluyente A. En una servilleta se coloco la yema del huevo y con un movimiento de sube y baja, se retiro la mayor cantidad de clara. Posteriormente en un matraz de 125 ml se vaciaron 2.5 g de dextrosa, 10 ml de yema de huevo y 50 ml de agua desionizada. Los ingredientes fueron mezclados inmediatamente. Diluyente B. Se obtuvo la yema de huevo de manera similar al procedimiento anterior. Diluyente A y de igual forma en un matraz de 125 ml se vaciaron 2.5 g de dextrosa, 10 ml de yema de huevo, 14 ml de glicerol y 50 ml de agua desionizada. 32