TAXONOMÍA Y EVOLUCIÓN BACTERIANA

Transcripción

1 TAXONOMÍA Y EVOLUCIÓN BACTERIANA

2 BIBLIOGRAFÍA Brock, Biología de los microorganismos, 8 a, 9 a o 10 a ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria) Reviews Roselló-Mora R & Amann R. (2001). The species concept for prokaryotes. FEMS Microb Rev 25, Vandamme P. et al (1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev 60,

3 TEMARIO Taxonomía y concepto de especie en procariotas Taxonomía clásica, numérica y polifásica Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting) Filogenética: clasificación y relación evolutiva gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos Relación entre taxonomía clásica y filogenética. Diversidad bacteriana. Identificacion de una cepa

4 TAXONOMÍA Clasificación estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud Nomenclatura asigna nombres a los taxones Identificación determina a que taxones pertenece un organismo que se aisla

5 Taxonomía Caracterización exhaustiva Aplicación de teoría y método de clasificación Formación de grupos taxonómicos (taxones) Nomenclatura Identificación Caracterización por número limitado de tests adecuados al problema Comparación con spp conocidas Asignación a una sp No identificado: estudio taxonómico

6 ESPECIE unidad taxonómica básica grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo

7 ESPECIE BACTERIANA Concepto en revisión continua Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN 1 -ADN 2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN 1 -ADN 2 ) Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas y genómicas)

8 Absorbancia ADN simple hebra ADN doble hebra Longitud de onda (nm) Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion Abs. relativa 260 nm desnaturalización T m = 86ºC ADN doble hebra temperatura (ºC) ADN simple hebra T m : punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN- ADN o de ADN- ARN

9 Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b

10 Curvas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

11 RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA Taxones: Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie importancia en estudios clínicos y ecológicos

12 Sistema binomial de nomenclatura (Linneo) Escherichia coli Escherichia coli o E. coli

13 Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli

14 Categorías de clasificacion a nivel de subespecie (tipificación) Variedades o tipos serovariedad o serotipo (antígenos distintos) fagovariedad (tipificación por fagos) biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) patovariedad (patogenicidad) morfovariedad (diferencias morfológicas) genomovariedad (grupos con ADN similares)

15 Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergey s Manual of Systematic Bacteriology 1 a Ed 1984(vol 1)-1989(vol 4) Bergey s manual of Systematic Bacteriology 2 a Ed 2001(vol 1) The Prokaryotes (

16 PUBLICACIONES International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology COLECCIONES (cepas tipo y otras) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colección alemana) CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

17 Taxonomía bacteriana CLÁSICA caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.) algunos genotípicos: % G+C, hibridación ADN- ADN ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

18 Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico Morfología: forma, tamaño y tinción Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y ph óptimos, fuentes alternativas de C, N y S Movilidad: tipo y disposición de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad

19 Características genotípicas clásicas Contenido G+C % G+C = G + C x 100 G + C + A + T determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía Amplio rango en procariotas: 20 al 80% Poca información para la caracterización taxonómica criterio de exclusión: %GC > 3, probablemente especies diferentes %GC > 10, probablemente géneros diferentes

20 Hibridación ADN-ADN - depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN 1 - ADN 2 Δ T m del híbrido - es el criterio actual de definición de especie

21 NUMÉRICA Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos Se basa en un gran número de caracteres Cada carácter tiene igual peso La similitud es función de la proporción de caracteres comunes

22 NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza = a + d. a + b + c + d a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas

23 Desventajas de una clasificación artificial No permite inferir propiedades No permite comprender microorganismos que no se han cultivado en el laboratorio No permite estudiar el origen y evolución de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosintesis)

24 Clasificación natural Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica. Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas

25 POLIFÁSICA Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc) - marcadores quimiotaxonómicos - perfil de proteínas totales y enzimas Genotípicos: clásicos: % G+C hibridación DNA-DNA nuevos: fingerprinting (ej. perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN) Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

26 Esquema de las técnicas e información más frecuente empleadas en la taxonomía polifásica (Vandamme et al., 1996).

27 CARACTERES FENOTIPICOS Marcadores quimiotaxonómicos Características - análisis químico con equipamiento especializado - no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos - alto grado de discriminación - presentes en distintas estructuras celulares

28 Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo en Planctomyces y Mycoplamas Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

29 CARACTERES FILOGENETICOS Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies) Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución

30 PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO distribución universal (presente en todos los organismos) - función homóloga en todos los organismos - secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables - ausencia de transferencia horizontal - cantidad de informacion suficiente

31 Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) Factor de Elongación Tu Subunidad beta de ATPasa RecA Genes funcionales

32 ARNr en Procariotas Nombre Tamaño Ubicación (nucleótidos) 5S 120 Subunidad mayor del ribosoma 16S 1500 Subunidad menor 23S 2900 Subunidad mayor

33 Arboles filogéneticos

34 Arboles filogenéticos Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva Similitud de secuencias implica similitud en los genes

35 Ejemplo de un árbol filogenético basado en el gen ARNr 16S. La barra indica la sustitución de 10 nucleótidos cada 100

36 Secuencia del ARNr 16S Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral

37 Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli Líneas gruesas: dominios de conservación universal Líneas normales: dominios de conservación intermedia Líneas punteadas: regiones hipervariables

38 ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

39 Características diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya Bacteria Archaea Eucarya Peptidoglicano Sí No No Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester Ribosomas 70S 70S 80S trna iniciador Formilmetionina Metionina Metionina Intrones en trna No Sí Sí RNA polimerasa Ribosoma sensible a: Una (4 subun) Varias (8-12 subun) Tres (12-14 subun) Toxina diftérica No Sensible Sensible Cloranfenicol Kanamicina Estreptomicina Sensible No No

40 Secuencias signaturas o firma en ARNr Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos Ejemplos: AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria CACACACCG (posición 1400) en Archaea C (posición 47) en gamma-protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

41 Arbol del ARNr 16S Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria Muchos de los linajes profundos son anerobios o microaerofílicos Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria

42 Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama

43 Propiedades definidas genéticamente que han cambiado poco Estructura de la pared celular: peptidoglicano solo presente en Bacteria Gram +: linaje filogenéticamente coherente Lípidos de membrana (ésteres o éteres) Metanogénicos: todos pertenecen a uno de los 4 linajes dentro de Archaea

44 Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicacion, transcripción y traducción

45 Microsporidia y Giardia: carecen de mitocondria, son parásitos obligados, tienen genoma un poco mayor que los procariotas.

46 Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes Chloroflexus y Chlorobium ambos poseen clorosomas con similar función y estructura, pero diferentes centros de reacción posibles explicaciones: transferencia lateral evolución independiente el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

47 Arbol del dominio Bacteria

48 DOMINIO BACTERIA Actualmente con mas de 40 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε), Gram positivos (LowGC y HighGC) Origen de mitocondrias (phylum Proteobacteria) y cloroplastos (phylum Cyanobacteria)

49 Relación entre la definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S Definición especie: % de hibridación ADN 1 -ADN 2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70% especies diferentes

50 Secuencia del gen ARNr 16S Se emplea frecuentemente para: COMPLETAR IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS PUROS ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO

51 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA Alineamiento y corrección de la secuencia Comparación con bases de secuencias ( Diferencia de secuencia con la cepa mas similar > 3% < 3% Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes diferentes pruebas fenotípicas similares Hibridación ADN-ADN NUEVA ESPECIE < 70% > 70% NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE

52 Por qué hay tanta diversidad entre los Procariotas (Archaea y Bacteria)? son ancestrales son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

53 Ejemplos de diversidad: estructura y función Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) Membranas: diferente composición (Mycobacterium) Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formacion de hifas (Streptomyces) Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) Diferenciacion celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio) Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

54 Origen de la tierra 4600 millones de años Condiciones de la Tierra primitiva: CH 4, CO 2, N 2 NH 3 y muy poco O 2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H 2 S Temperatura > 100 C ORIGEN DE LA VIDA Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos) Vida primitiva: organismos con ARN? (sin ADN) Célula moderna: ADN ARN Proteína Origen de eucariotas: teoría endosimbiótica