TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS. Claudia Etchebehere Cátedra de Microbiología Facultad de Química y Facultad de Ciencias 2008

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1 TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS Claudia Etchebehere Cátedra de Microbiología Facultad de Química y Facultad de Ciencias 2008

2 BIBLIOGRAFÍA Brock, Biología de los microorganismos, 8 a, 9 a o 10 a ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria) Prescott, Harley and Klein, Microbiología, cuarta edición. Capítulo 19).

3 TEMARIO Taxonomía y concepto de especie en procariotas Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting) Filogenética: clasificación y relación evolutiva gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos Relación entre taxonomía clásica y filogenética. Diversidad bacteriana. Ejemplos. Identificación de una cepa

4 TAXONOMÍA Taxos=estructuración u orden, nomos=ley Comprende: Clasificación estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud Nomenclatura asigna nombres a los taxones Identificación determina a que taxones pertenece un organismo que se aisló

5 Para que sirve clasificar los microorganismos? Ordenar los conocimientos Lenguaje común Descubrir organismos no descriptos Caracterizar aislamientos (por ejemplo patógenos) Estudios evolutivos

6 Taxonomía Caracterización exhaustiva Aplicación de teoría y método de clasificación Formación de grupos taxonómicos (taxones) Nomenclatura Identificación Caracterización por número limitado de tests adecuados al problema Comparación con spp conocidas Asignación a una sp No identificado: estudio taxonómico

7 Identificación de un aislamiento Cultivo puro Estudios morfológicos (macro y micro, Gram) Estudios bioquímicos, enzimas vías de degradación, metabolismo, relación con el oxígeno. Comparación con cepas ya caracterizadas Asignación de especie

8 Definición de especie Unidad taxonómica básica Grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo o de una sola célula

9 Definición de especie en Bacterias Definición en revisión continua Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN bacteria 1 -ADN bacteria 2 > 70% - ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN 1 -ADN 2 ) Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas) En el futuro definición genómica de especie.

10 Determinación del % de hibridación ADN-ADN Absorbancia Abs. relativa 260 nm Longitud de onda (nm) temperatura (ºC) ADN simple hebra ADN doble hebra desnaturalización T m = 86ºC ADN doble hebra ADN simple hebra Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion T m : punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN- ADN o de ADN- ARN

11 Cinéticas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

12 Hibridación genómica como herramienta taxonómica

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14 RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA Taxones: Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie importancia en estudios clínicos y ecológicos

15 Nomenclatura Sistema binomial de nomenclatura (Linneo) Escherichia coli Escherichia coli o E. coli

16 Jerarquía taxonómica de la bacteria Allochromatium warmingii Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Chromatiales Chromatiaceae Bacterias Gram negativas Bacterias fotótrofas púrpuras Allochromatium Allochromatium warmingii Bacterias púrpuras del azufre Secuencia del gen 16S rrna

17 Categorías de clasificación a nivel de subespecie (tipificación) Variedades o tipos serovariedad o serotipo (antígenos distintos) fagovariedad (tipificación por fagos) biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) patovariedad (patogenicidad) morfovariedad (diferencias morfológicas) genomovariedad (grupos con ADN similares)

18 Manuales de microorganismos Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 1923 (1ed)-1994 (9ed) Bergey s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)- 1989(vol 4) Bergey s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed (vol 1-vol 5) The Prokaryotes (

19 PUBLICACIONES International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology (validación del nombre)

20 COLECCIONES DE MICROORGANISMOS (cepas tipo y otras) ATCC (American Type Culture Collection) DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colección alemana) CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

21 Taxonomía bacteriana CLÁSICA caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.) % G+C ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

22 Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico Morfología: forma, tamaño y tinción Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y ph óptimos, fuentes alternativas de C, N y S Movilidad: tipo y disposición de flagelos Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad

23 Características genotípicas clásicas Contenido G+C % G+C = G + C x 100 G + C + A + T Determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía (HPLC) Permite distinguir dos organismos, si tienen diferente % G+C entonces son de diferente especie (difieren mas del 10%) Si presentan similar G+C no se puede afirmar nada

24 Rangos de composición de bases de ADN

25 TAXONOMÍA NUMÉRICA Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos Se basa en un gran número de caracteres Cada carácter tiene igual peso La similitud es función de la proporción de caracteres comunes

26 TAXONOMÍA NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60) - coeficiente de semejanza = a + d. a + b + c + d a: número de caracteres positivos en ambas cepas b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1 c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2 d: número de caracteres negativos en ambas cepas Se construyen matrices de semejanza y dendrogramas

27 Taxonomía molecular Basada en el estudio de moléculas Caracteres Genotípicos Hibridación ADN-ADN Molecular fingerprinting (huella molecular) Caracteres Fenotípicos Quimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos (FAME), otros

28 Hibridación ADN-ADN - depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - determinación por: % hibridación de ADN 1 -ADN 2 Δ T m del híbrido - es el criterio actual de definición de especie

29 Molecular fingerprinting secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestión con enzimas de restricción resolución a nivel de sub-especie.

30 CARACTERES FENOTIPICOS Marcadores quimiotaxonómicos Características - análisis químico con equipamiento especializado - no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos - alto grado de discriminación - presentes en distintas estructuras celulares

31 Marcadores quimiotaxonómicos - Pared: peptidoglicanos en Gram + - Membrana externa Gram negativos: -lipopolisacáridos - Membrana citoplasmática: -ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), -lípidos polares, ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas. - Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas. - Sistema fotosintético: bacterioclorofilas. - Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

32 Desventajas de una clasificación artificial No permite inferir propiedades No permite comprender microorganismos que no se han cultivado en el laboratorio No permite estudiar el origen y evolución de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)

33 Clasificación natural Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica. Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas

34 POLIFÁSICA Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc) - moleculares (marcadores quimiotaxonómicos) - perfil de proteínas totales y enzimas Genotípicos: -clásicos: % G+C - moleculares: hibridación DNA-DNA, fingerprinting (ej. Perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN) Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

35 Taxonomía polifásica

36 CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA CARACTERIZACIÓN TENIENDO EN CUENTA LA EVOLUCIÓN.

37 Bases de la filogenética molecular El uso de secuencias moleculares para estudios filogenéticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporción de éstos permanece fijo en las moléculas.

38 CARACTERES FILOGENETICOS Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies) Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución

39 PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO distribución universal (presente en todos los organismos) función homóloga en todos los organismos capacidad de alinear secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables ausencia de transferencia horizontal cantidad de información suficiente

40 Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese) Subunidad beta de ATPasa RecA Factor de Elongación Tu Genes funcionales

41 ARNr Procariotas Nombre Tamaño Ubicación (nucleótidos) 5S 120 Subunidad mayor del ribosoma 16S 1500 Subunidad menor 23S 2900 Subunidad mayor

42 Secuencia del ARNr 16S Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral

43 Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli Líneas gruesas: dominios de conservación universal Líneas normales: dominios de conservación intermedia Líneas punteadas: regiones hipervariables

44 Árbol filogenético Un árbol filogenético es una hipótesis de relación evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis filogenética resultante.

45 Cómo se construye un árbol filogenético? 1-Extracción de ADN, PCR y secuencia

46 2-Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas Organismos A B C D secuencias ARN CGU AGA CCU GAC C CUU CCU AGA GCU GGC CAA C CAA GAC GUG GCA C CAU GCU AGA UGU GCC Secuencia del organismo problema secuencias obtenidas de la base de datos Posiciones mas variables Posicion mas conservada Posiciones que van a ser comparadas

47 Árboles filogenéticos Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos (MEGA) Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva Similitud de secuencias implica similitud en los genes

48 Secuencias sin alinear en programa Clustal IX

49 Secuencias alineadas en programa Clustal IX

50 Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a partir del gen 16S ARN

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52 Definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S Definición especie: % de hibridación ADN 1 -ADN 2 > 70% En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70% especies diferentes

53 Relación entre la similitud de secuencias del 16S ARNr y la hibridización genómica de ADN entre pares de organismos.

54 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA Alineamiento y corrección de la secuencia Comparación con bases de secuencias ( Diferencia de secuencia con la cepa mas similar > 3% < 3% Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes diferentes pruebas fenotípicas similares Hibridación ADN-ADN NUEVA ESPECIE <70% >70% NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE

55 Caracterización de especies nuevas

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57 Secuencias signaturas o firma en ARNr Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos Ejemplos: AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria CACACACCG (posición 1400) en Archaea C (posición 47) en gamma-protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

58 Secuencia del gen ARNr 16S Se emplea frecuentemente para: COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: Candidatus METODOS RÁPIDOS DE CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACION.

59 ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS A PCR gen especifica Plásmidos con inserto Ligación de fragmentos de interés en el vector de clonado Transformación de cepas E. coli B DNA ambiental Gen amplificado de los microorganismos A y B Seleccion y análisis de clones por: RFLP, secuenciado, etc. Amplificación y clonado del gen del ARNr de 16S para su posterior secuencia

60 MICROORGANISMOS NO CULTIVADOS

61 FISH: Fluorescence in situ hybridisation sonda fluoróforo muestra Fijacion blanco (rrna) Microscopio de Epifluorescencia Deteccion Fijacion permeabilizacion Celulas hibridadas Hibridación Ribosomas Lavado Sondas de oligonucleotido fluorescentes 17

62 ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL

63 Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya Bacteria Archaea Eucarya Peptidoglicano Sí No No Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester Operones Sí Sí No RNA polimerasa Una (4 subun) Varias (8-12 subun) Tres (12-14 subun) Ribosomas 70S 70S 80S trna iniciador Formilmetionina Metionina Metionina Ribosoma sensible a: Toxina diftérica No Sensible Sensible Cloranfenicol Sensible No No Kanamicina Estreptomicina

64 Árbol del ARNr 16S Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria Muchos de los linajes profundos son anerobios o microaerofílicos Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria

65 ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL Termofilia en todos los miembros de la rama Termofilia en algunos miembros de la rama

66 Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis) Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicación, transcripción y traducción

67 Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre sí) Fotótrofos anoxigénicos Representantes de ambos géneros poseen clorosomas con similar función y estructura posibles explicaciones: transferencia lateral evolución independiente el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

68 Árbol del Dominio Bacteria

69 DOMINIO BACTERIA Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales) Mas de 400 géneros Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 géneros

70 DOMINIO BACTERIA

71 DOMINIO BACTERIA Aquifex Bacterias autótrofas y termófilas Bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus) Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato Deinococci Altamente resistentes a la radiación (D. radiodurans) Bacterias verdes del azufre (Chlorobium) Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del ácido cítrico Planctomycetes Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación, compartimentalización celular (membrana nuclear), annamox fisiología única, Candidatus Cyanobacteria Bacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica

72 DOMINIO BACTERIA Gram positivos bajo GC G+C < 50% Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus Gram positivos alto GC G+C > 50-55% Géneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium

73 DOMINIO BACTERIA PROTEOBACTERIAS Alfa: metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas, litótrofas (Nitrobacter), fij. N 2, bacterias rojas no del S fotosínteticas Beta: litótrofas de NH 3 (Nitrosomonas) Delta: Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras

74 Etapas en el ciclo celular de Hyphomicrobium

75 Ciclo de Myxobacterias

76 Ejemplos de diversidad: estructura y función Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas) Membranas: diferente composición (Mycobacterium) Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formación de hifas (Streptomyces) Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa) Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias) Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio) Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.: decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

77 DOMINIO ARCHAEA 40 géneros 3 linajes separados: Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos) Crenarchaeota (termófilos) Korarchaeota (solo secuencias ambientales)

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79 Taxones definidos previamente coherentes filogenéticamente Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria) Caracteres filogenéticamente no valiosos para definir taxones superiores: Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad, morfología compleja (helicoidal, gemación micelio, apéndices)

80 Por qué hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)? Son ancestrales Son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya Representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

81 Cómo surge una nueva especie bacteriana?

82 Concepto polifásico de especie: Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes Concepto ecotipo (Cohan, 2004): Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genómicamente coherente que difiere genéticamente de otros subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas. Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados de las bases de datos proteómicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificación de las especies.

83 ORIGEN DE LA VIDA Origen de la tierra 4600 millones de años Condiciones de la Tierra primitiva: CH 4, CO 2, N 2 NH 3 y muy poco O 2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H 2 S Temperatura > 100 C Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos) Vida primitiva: organismos con ARN? (sin ADN) Célula moderna: ADN ARN Proteína

84 Estromatolitos