LABORATORIO N 9: BIOINFORMÁTICA APLICADA AL ESTUDIO DE PROTEÍNAS

Transcripción

1 LABORATORIO N 9: BIOINFORMÁTICA APLICADA AL ESTUDIO DE PROTEÍNAS OBJETIVO GENERAL Adquirir destreza en el manejo de herramientas bioinformáticas para el estudio de proteínas. Familiarizarse con el análisis de modelos estructurales y su interpretación en conjunto con resultados espectroscópicos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Emplear técnicas de búsqueda por similitud en bases de datos bioinformáticas y de reconocimiento de familias proteicas y dominios estructurales para determinar la posible función de una secuencia incógnita. Utilizar herramientas de modelado por homología para obtener información estructural a partir de una secuencia proteica. Correlacionar el modelo estructural obtenido con información proveniente de estudios espectroscópicos de la proteína. INTRODUCCIÓN Los avances en técnicas de secuenciación en las últimas dos décadas han llevado a un crecimiento exponencial en el número de secuencias biológicas conocidas, tanto de ADN como de ARN y proteínas. La Bioinformática, un campo de estudio interdisciplinario que combina la biología, ciencias de la computación, matemática y estadística, tiene como objetivo asistir en la organización, acceso e interpretación de esta enorme cantidad de información. Las secuencias biológicas obtenidas son depositadas en la actualidad en bases de datos de libre acceso a través de internet, tales como GenBank del NCBI (EE UU) o la perteneciente al EMBL (Europa). Estas bases de datos están organizadas en entradas, cada una de las cuales está compuesta por una secuencia biológica acompañada de una variedad de información relevante sobre la misma, como autores, publicaciones vinculadas, organismo de procedencia, fecha de ingreso a la base de datos, etc. Distintas herramientas bioinformáticas son empleadas comúnmente para el estudio de proteínas. Al trabajar con proteínas de función o estructura desconocidas, la búsqueda de proteínas homólogas (mediante herramientas como Protein BLAST), permite encontrar secuencias similares que dan pistas sobre el rol de la proteína en cuestión y su grado de conservación en distintos organismos. A partir de estas comparaciones se puede determinar también la familia de proteínas a la cual podría pertenecer una secuencia incógnita, así como también identificar la presencia de dominios conservados de función conocida, que permitan postular de forma tentativa las funciones principales que podría realizar la proteína en cuestión. 1

2 De forma similar a los datos de secuencia, la información de estructura tridimensional obtenida mediante técnicas tales como cristalografía de rayos X, RMN y criomicroscopía electrónica, se encuentra recopilada en una base de datos de libre acceso denominada Protein Data Bank (PDB). Cada entrada del PDB no sólo contiene la estructura tridimensional en cuestión, sino también abundante información sobre la calidad de la estructura obtenida y la metodología utilizada. A pesar de que el número de estructuras resueltas depositadas en el PDB ha crecido a gran velocidad, alcanzando más de entradas en la actualidad, alrededor del 99% de las secuencias de proteína conocidas carecen de una estructura asociada. Para remediar el desfasaje entre la información estructural y de secuencia se han desarrollado distintas técnicas que permiten predecir la conformación tridimensional de una proteína en base a su secuencia de aminoácidos. Si bien toda la información que determina el plegamiento de una proteína está teóricamente contenida en su estructura primaria, el problema del cálculo De Novo de la conformación nativa presenta una gran complejidad y aún no ha sido resuelto completamente. En general los métodos de predicción de novo exploran el espacio conformacional de la proteína, buscando minimizar una función de energía que representa el balance de todas las interacciones existentes en cada disposición tridimensional del polipéptido. Aplicando ciclos iterativos de generación de una nueva conformación y cálculo de su energía asociada se busca llegar al mínimo de energía correspondiente a la conformación nativa de la proteína. Desafortunadamente, este tipo de estrategias requieren un enorme poder de cálculo y por el momento sólo son aplicables a proteínas relativamente pequeñas. Como ejemplos de esta metodología se pueden destacar los proyectos de computación distribuida Rosetta@home y Folding@home, los cuales emplean tiempo de cálculo en computadoras personales donado por gente de todo el mundo para llevar a cabo la predicción estructural de novo de distintas proteínas. Otros métodos, denominados de Modelado por Homología, se apoyan en estructuras existentes obtenidas para proteínas homólogas, utilizándolas como punto de partida para determinar una estructura posible de la proteína de interés. Distintos servidores de acceso gratuito, tales como Swiss-Model, brindan la posibilidad de realizar este tipo de modelados rápidamente con sólo proveer la secuencia proteica correspondiente, ya que realizan automáticamente la búsqueda de homólogos con estructura conocida y los cálculos necesarios con mínima intervención por parte del usuario. Los modelos estructurales obtenidos por este tipo de métodos generalmente constituyen una aproximación razonable a la estructura real de la proteína, especialmente cuando los homólogos de estructura conocida presentan una identidad de secuencia superior al 50% con la proteína de interés. 2

3 DESARROLLO EXPERIMENTAL Su amiga Bruna, que trabaja en un laboratorio de microbiología, le cuenta que en su grupo de trabajo encontraron un plásmido esencial para la sobrevida de una cepa particular de la enterobacteria Klebsiella oxytoca. Después de enviarlo a secuenciar encontraron dentro del plásmido una secuencia codificante para una proteína putativa de función desconocida. Dadas las herramientas disponibles en su laboratorio, solamente se hicieron experimentos de knock-out, que indicaron que las mutaciones de pérdida de función en ese gen son letales para la bacteria. Debido a su falta de experiencia en bioquímica de proteínas, Bruna acude a usted para que lo ayude a encontrar más pistas sobre la posible función de esta proteína desconocida. Para esto le envía la secuencia del gen en cuestión (la secuencia génica está contenida en el archivo DNA_incognita.txt en la carpeta del práctico): ATGCTTTATCCACTCTTCATTTTTAAAACTGAAAGCGGCTATGACGGCTATTTTCCCGAT CTTGACGGCTGCTTCTTTGCTGGTGATACCGTAGAGAAAGCGGTGAAGAATGCTGAACAG GCTTTCGGACAACACATGGAAGTGTTAACAGAGCAAGGGCAGCATGTACCAGCACCAAGT GATCCGGCATTTTATTTGGCAGATCCAAGATTAGCTGAAGATGGTGGCTTTCTTGCTTTG GTGGAACTCGATCCATCATA Usted habla con su jefe, que le dice que no lo le interesa la colaboración porque no tiene buena relación con el director de su amiga, así que decide empezar a trabajar a escondidas. Como no puede usar los recursos del laboratorio para realizar clonados y purificaciones de proteínas que requieren mucho tiempo y dinero, decide comenzar a hacer un estudio bioinformático para luego convencer a su jefe de que el proyecto puede valer la pena y le permita hacer experimentos. Como dispone de un gen codificante para una proteína de función desconocida, decide primero realizar una traducción del mismo, para obtener la secuencia aminoacídica correspondiente, y luego buscar otras proteínas similares para obtener algún indicio de su función. Para realizar la traducción de genes utilizar - Esta herramienta permite realizar la traducción in sílico de secuencias de ADN. Traduce los genes en sentido directo e inverso, en los tres marcos de lectura posible (siempre y cuando encuentre un codón de iniciación). A continuación guardar la secuencia de aminoácidos obtenida e ingresar a para realizar una búsqueda mediante BLAST. - Esta herramienta de búsqueda de secuencias por homología permite encontrar secuencias similares a la de partida, ya sean secuencias de 3

4 proteína o ácidos nucleicos. En este caso, utilizaremos la herramienta Protein BLAST, que busca proteínas similares a una secuencia de proteína de partida (denominada query). - Se pueden utilizar distintas bases de datos de NCBI para la búsqueda, emplear la base de datos non-redundant protein sequences (nr). Esta base de datos contiene secuencias de proteína no reduntantes, en la que cada secuencia está contenida una única vez (una proteína o gen puede haber sido incorporada múltiples veces a la base de datos general por parte de distintos autores). - Los resultados de Protein BLAST también dan indicios de a qué familia de proteínas se asemeja la secuencia de partida, mediante reconocimiento de dominios conservados. - BLAST también permite encontrar homólogos con estructura conocida. Para ello, repetir la búsqueda en Protein BLAST, pero utilizando la base de datos Protein Data Bank proteins, que contiene las secuencias de todas las proteínas de estructura conocida. Para obtener más información sobre su proteína, decide recurrir a continuación a Pfam ( una base datos de familias de proteínas. Para encontrar a qué familia corresponde la proteína, ir a Sequence Search y pegar la secuencia de aminoácidos. Esta herramienta reconocerá a qué familias presenta similitud la proteína, y resume información relevante sobre su función. En la pantalla de resultados de la búsqueda, hacer click sobre Show en la columna Show/hide alignment, para mostrar el alineamiento de la proteína de interés (fila #SEQ) a la secuencia consenso de la familia detectada (fila indicada como #HHM). Los residuos en mayúsculas en la secuencia consenso corresponden a posiciones más conservadas. En ese momento vuelve a reunirse con Bruna y usted le comunica que ya sabe por qué mueren sus células al perder la proteína: es parte de un sistema Toxina- Antitoxina, y el gen esencial que estaba estudiando codifica la antitoxina que impide la acción letal del otro componente. No sólo eso, sino que también hay proteínas homólogas con estructura conocida, por lo que cree que se puede modelar su conformación tridimensional si le interesa tener información estructural de la misma. Bruna al tiempo vuelve a comunicarse y le comenta que, gracias a la información que le dio la vez pasada, pudo seguir investigando en más profundidad el sistema. Logró identificar en el plásmido que estaba estudiando el gen que codifica para la toxina (archivo secuencia_tox.txt en la carpeta del práctico), y le cuenta además que obtuvo por mutagénesis al azar dos mutantes termosensibles de la antitoxina, uno contiene un reemplazo de una fenilalanina en posición 16 por alanina 4

5 (mutante F16A), y en el otro está sustituido el residuo de fenilalanina 25 por lisina (mutante F25K). Las células que producen estas variantes de la proteína pueden crecer correctamente a 20 C pero mueren cuando se cultivan a la temperatura de crecimiento óptima de Klebsiella (37 C). Por lo tanto deduce que por algún motivo el incremento de temperatura inactiva a la antitoxina, pero desconoce los motivos específicos por los que esto ocurre. Sabiendo que ya algunos grupos purificaron proteínas similares, su amiga le pregunta si puede encontrar alguna explicación para el fenotipo termosensible que causa cada mutación. Usted acude nuevamente a su jefe, que le dice que no le molestaría hacer algunos experimentos con la proteína, pero que primero necesita que le muestre que realmente vale la pena invertir tiempo en purificarla. Usted decide entonces realizar un modelado por homología para tener información de dónde pueden estar las mutaciones y ver si así puede plantear una explicación posible de los resultados observados. Para modelado de proteínas acceder a - Seleccionar Start Modelling, pegar la secuencia de aminoácidos de la antitoxina en Target Sequence, y hacer click en Search for Templates. - Elegir en la página siguiente los homólogos a utilizar para el modelado, y hacer click en Build Models - Como resultado se obtienen modelos estructurales en formato PDB, basados en las diferentes estructuras homólogas identificadas, que se pueden abrir con cualquier programa de visualización del que se disponga. - Descargar la estructura de los modelos obtenidos y los homólogos de partida. - Mapear en la posición de ambas mutaciones tanto en modelos de la proteína incógnita como en la estructura de partida en ausencia y presencia de la toxina. - Analiza el entorno de cada residuo mutado buscando pistas sobre su posible rol en el fenotipo observado. Cuáles pueden ser las causas de la termosensibilidad observada para los mutantes F16A y F25K? La información obtenida a partir de los modelos deja satisfecho a su jefe, que le da el OK para hacer los experimentos necesarios. Luego de unos meses de trabajo logra clonar las proteínas de interés en vectores de sobreexpresión y optimiza la expresión y purificación de las mismas. En primer lugar decide chequear si se encuentran bien plegadas por lo que adquiere espectros de dicroísmo circular a 20 C 5

6 en el UV cercano y UV lejano de la antitoxina salvaje (WT) y las 2 variantes, encontrando que los mismos no presentan diferencias importantes. Teniendo en cuenta que las proteínas mutantes pierden su función ante un aumento en la temperatura de crecimiento, decide evaluar la estabilidad térmica de las mismas. Para ello adquiere espectros de CD en el UV lejano de estas proteínas en función la temperatura, en un rango entre los 20 C y 60 C. La Figura 1 muestra los espectros completos obtenidos para la variante F16A (a) y F25K (b), así como la elipticidad a 222 nm para las 3 proteínas en función de la temperatura (c). Le permiten los datos de dicroísmo circular explicar el fenómeno de termosensibilidad observado para los dos mutantes de la antitoxina? Figura 1 Adicionalmente, lleva a cabo estudios de fluorescencia de la toxina y antitoxina por separado, y de mezclas equimolares de las mismas, a diferentes temperaturas (Figura 2 a, b y c). Utiliza un λ excitación = 280 nm, y registra espectros de emisión entre 290 y 450nm. Los espectros de fluorescencia de la antitoxina libre no muestran 6

7 variaciones importantes entre los mutantes y la proteína WT, y por lo tanto se presentan como Antitoxina sólo los espectros de emisión de la proteína salvaje. Qué puede concluir respecto de qué efecto es responsable de la pérdida de función del mutante F25K en base a estos datos? Para poner a prueba su hipótesis realiza medidas de anisotropía de fluorescencia utilizando una concentración fija de la toxina (3 µm), a la cual titula con cantidades crecientes de la antitoxina WT, o de los mutantes F16A o F25K. Lleva a cabo estas medidas a 30 C, utilizando λ exc = 295 nm, y λ em = 350 nm (Figura 2 d). F16A? Por qué incrementa la anisotropía al adicionar antitoxina WT y el mutante Qué ocurre cuando se agrega el mutante F25K de la antitoxina? Concuerdan estos resultados con lo observado en los experimentos anteriores de fluorescencia? Figura 2 A partir de los resultados anteriores su jefe le pide que trate de obtener datos estructurales de la interacción, por lo que decide mapear el sitio de unión de la toxina 7

8 15 N LABORATORIO N 9: Bioinformática de Proteínas y la antitoxina. Para ello purifica las distintas variantes de la antitoxina con marcaje isotópico de 15 N, y la toxina sin marcar. Primero decide evaluar la calidad de las muestras por lo que registra un espectro 1 H- 15 N-HSQC de las distintas variantes a 30 C (Figura 3). Figura 3 Qué información se puede obtener a partir de estos espectros? Coincide con lo informado por dicroísmo circular? Luego realiza los experimentos de asignación sobre la antitoxina salvaje de manera de disponer de los datos necesarios para poder determinar la superficie de interacción con la toxina. A continuación realiza un espectro de la antitoxina en presencia de la toxina sin marcar (una porción del mismo se muestra en la Figura 4), observando cambios en el espectro 1 H- 15 N-HSQC (azul) con respecto al de la antitoxina libre (verde). 1 H 8

9 Figura 4 Luego grafica la relación de las intensidades en presencia de la toxina (Int-Tox) respecto a las intensidades en esa misma posición del espectro en ausencia de la misma (I 0 ) obteniendo el perfil mostrado en la Figura 5. Relación de intensidades en presencia de toxina vs en ausencia de la misma 1,2 1,0 0,8 Int-Tox/Io 0,6 0,4 0,2 0, N de Residuo Figura 5 Qué residuos son los que se ven afectados por la unión? Son los esperados basados en el modelo? Qué resultados esperaría obtener haciendo este experimento a 30 C con los mutantes F16A y F25K de la antitoxina? 9