UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

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1 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EFECTO DE DISTINTOS TIEMPOS DE EQUILIBRIO SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA PRE Y POST-CONGELACIÓN DE SEMEN BOVINO DE TOROS REPRODUCTORES HOLSTEIN FRIESIAN Informe final de investigación presentado como requisito para optar el Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR CARLOS ANDRÉS ANCHATUÑA QUINGA TUTOR Dr. JORGE ADALBERTO MOSQUERA ANDRADE QUITO, FEBRERO 2017

2 DEDICATORIA A Dios Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis objetivos. A mis padres Carlos y María Por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi educación, tanto académica, como de la vida, por su apoyo incondicional en todo momento. A mis hermanos Stalin y Daniel Por estar conmigo siempre y apoyarme, los quiero mucho. A mis familiares Mis queridos abuelos Isidro y Beatriz por ser mi guía y apoyo siempre. A mis tios César, Inés, Consuelo y Bersabé por haberme ayudado a culminar este proyecto. A mis amigos Que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación profesional y que hasta ahora, seguimos siendo amigos: Luis Romero, Daniel Arcos, Diego Caroa, Sofia Monteros y especialmente a Teresa Quisilema por compartir los buenos y malos momentos. Y a todos aquellos que participaron directa o indirectamente en la elaboración de esta tesis, familiares y amigos que no recordé al momento de escribir esto. Gracias a ustedes! Carlos Andrés ii

3 AGRADECIMIENTOS A mi tutor, Dr. Jorge Mosquera por su paciencia, sus consejos y conocimientos que permitieron la realización de este trabajo. Al Ministerio de Agricultura, Ganaderia, Acuacultura y Pesca por haberme permitido realizar este trabajo en tan importante institución. A la Central Nacional de Producción y Mejoramiento Genético El Rosario por cederme sus instalaciones para la realización de este trabajo. Al equipo de Genética de la Central Nacional de Producción y Mejoramiento Genetico El Rosario : Dra. Maricela Veloz, Dr. Francisco Gallegos, Dra. Cristina Ramos, Ing. Sebastian De Trinidad, Karla Sonnenholzner y Cristian Moya por sus conocimientos y ayuda para la realización de este trabajo. Al Ing. Marcelo Hernández por el porte de sus conocimientos para la culminación de este trabajo. A todos los docentes de la Facultad, por proporcionarme su sabiduría dentro y fuera de las aulas. iii

4 DERECHOS DE AUTOR Yo, Carlos Andrés Anchatuña Quinga en calidad de autor del trabajo de investigación Efecto de distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad espermática pre y post-congelación de semen bovino de toros reproductores Holstein Friesian autorizo a la Universidad Central del Ecuador, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior. En la ciudad de Quito, a los 07 días del mes de Febrero del Carlos Andrés Anchatuña Quinga Cd. N iv

5 INFORME DEL TUTOR En mi carácter de Tutor del Trabajo de Investigación, presentado por el señor: CARLOS ANDRÉS ANCHATUÑA QUINGA, para optar por el Título o Grado de Médico Veterinario y Zootecnista, cuyo título es EFECTO DE DISTINTOS TIEMPOS DE EQUILIBRIO SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA PRE Y POST-CONGELACIÓN DE SEMEN BOVINO DE TOROS REPRODUCTORES HOLSTEIN FRIESIAN. Considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe. Quito, a los 07 días del mes de Febrero del 2017 Dr. JORGE ADALBERTO MOSQUERA ANDRADE CI: v

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9 ÍNDICE GENERAL Titulo... pág. DEDICATORIA... II AGRADECIMIENTOS... III DERECHOS DE AUTOR... IV INFORME DEL TUTOR... V LISTADO DE GRÁFICOS... XI LISTADO DE TABLAS... XII LISTADO DE CUADROS... XIII RESUMEN... XIV ABSTRACT... XV CAPÍTULO I... 1 INTRODUCCIÓN... 1 CAPÍTULO II... 3 OBJETIVOS... 3 GENERAL... 3 ESPECIFICOS... 3 CAPÍTULO III... 4 MARCO TEÓRICO... 4 Crioconservación de semen... 4 Antecedentes... 5 Métodos de crioconservación... 5 Efectos de la crioconservación sobre el espermatozoide... 6 Tiempo de equilibrio... 7 Diluyentes... 8 Evaluación de semen... 9 Semen fresco... 9 Evaluación macroscópica... 9 Evaluación microscópica Motilidad espermática Sistema de Análisis Seminal Computarizado (CASA) CAPÍTULO IV MATERIALES Y METODOLOGÍA MATERIALES Físicos Biológicos Químicos ix

10 Suministros de oficina METODOLOGÍA Ubicación Tipo de investigación Factores en estudio Características de las unidades experimentales Preparación de toros reproductores Procedimientos Protocolo para análisis de semen Análisis macroscópico Análisis microscópico Análisis seminal - CASA Tiempo de equilibrio Análisis pre-congelación Análisis post-congelación Tinción de vitalidad (Eosina-Nigrosina) Análisis estadístico CAPÍTULO V RESULTADOS Y DISCUSIÓN a) Motilidad Espermática Total b) Motilidad Espermática Progresiva c) Espermatozoides Vivos/Muertos d) Morfología (Espermatozoides Normales/Anormales) CAPÍTULO VI CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS ANEXO 3. REGISTRO DE ANÁLISIS SEMINAL PRE Y POS CONGELACIÓN PARA LOS DIFERENTES TIEMPOS DE EQUILIBRIO ANEXO 4 FOTOGRAFÍAS x

11 LISTADO DE GRÁFICOS Pág. GRÁFICO. N 1 Comparación de la Variable Motilidad Espermática Total Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino. GRÁFICO N 2 Comparación de la Variable Motilidad Espermática Progresiva Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino. GRÁFICO N 3 Comparación de la Variable Espermatozoides Vivos Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino. GRÁFICO N 4 Comparación de la Variable Espermatozoides Normales Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino xi

12 LISTADO DE TABLAS TABLA N 1 Pág. Unidades experimentales de laboratorio según los tiempos de equilibrio. 15 TABLA N 2 Color y densidad del semen bovino. 16 TABLA N 3 Análisis de la motilidad espermática masal 16 TABLA N 4 Evaluación de la motilidad espermática individual. 17 xii

13 LISTADO DE CUADROS Pág. CUADRO N 1 Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en la pre-congelación con diferentes tiempos de equilibrio. 21 CUADRO. N 2 Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en la post-congelación con diferentes tiempos de equilibrio. 22 xiii

14 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EFECTO DE DISTINTOS TIEMPOS DE EQUILIBRIO SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA PRE Y POST-CONGELACIÓN DE SEMEN BOVINO DE TOROS REPRODUCTORES HOLSTEIN FRIESIAN Autor: Carlos Andrés Anchatuña Quinga RESUMEN Tutor: Dr. Jorge A. Mosquera. A Fecha: 17 de Enero del 2017 La crioconservación de semen es una importante biotecnología que tiene como objetivo la conservación de material genético por tiempo indefinido. Durante la congelación y la descongelación de semen los espermatozoides sufren muchos daños que pueden reducir su calidad hasta en un 50%. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad espermática pre y post-congelación de semen bovino. Se utilizó el semen de un grupo de toros de la raza Holstein Friesian, colectados con vagina artificial; el semen fue diluido y envasado en pajuelas de 0.5 ml, las que fueron puestas en refrigeración a una temperatura de 5ºC durante 7 tiempos de equilibrio diferentes (2, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 horas); un grupo de pajuelas fue analizado al término de cada tiempo de equilibrio y otro grupo sometido a crioconservación y analizado 72 horas post congelación. Se evaluó motilidad, viabilidad y anomalías espermáticas. En los valores obtenidos se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre pre y post congelación. La motilidad espermática total y progresiva pre congelación tuvieron resultados más altos a las 2 horas de tiempo de equilibrio, mientras que en la post congelación los mejores resultados se dieron a las 4 horas de tiempo de equilibrio. En la vitalidad espermática pre congelación se obtuvo mayor porcentaje de espermatozoides vivos a las 2 horas (78.23%) y en los resultados post congelación (68.69%) dentro de las mismas 2 horas de tiempo de equilibrio. Con respecto a las anomalías espermáticas el mejor tiempo de equilibrio con mayor porcentaje de espermatozoides normales fue a las 2 horas tanto para la pre congelación (86.42%) como para la post congelación (82.60%). Palabras clave: bovinos, semen, tiempo de equilibrio, calidad espermática, crioconservación. xiv

15 xv CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR FACULTY OF VETERINARY MEDICINE CAREER OF VETERINARY MEDICINE EFFECT OF DIFFERENT EQUILIBRATION TIMES ON THE SPERM QUALITY PRE AND POST-FREEZING OF SEMEN BOVINE OF REPRODUCERS BULLS HOLSTEIN FRIESIAN" Author: Carlos Andrés Anchatuña Quinga ABSTRACT Tutor: Dr. Jorge A. Mosquera. A Date: January 17, 2017 Cryopreservation of semen is an important biotechnology field which objective is to indefinitely preserve genetic material. During the process of freezing and thawing semen the sperms suffer many damages that might reduce their quality by up to 50%. The objective of this work is to evaluate the effect of different equilibrium times on pre and post-freezing sperm quality of bovine semen. Semen of a group of Holstein Friesian bulls was used, collected using artificial vagina. The semen was diluted and packaged in 0.5 ml straws, which were refrigerated at a temperature of 5 C during 7 different equilibratig times (2, 4, 8, 12, 16, 20 and 24 hours); a group of straws was analyzed at the end of each equilibrating time and another group put into cryopreservation and analyzed 72 hours post-freezing. Motility, viability and sperm abnormalities were evaluated. Significant differences between pre and post freezing variables were found. Total sperm motility and progressive sperm motility showed higher pre-freezing scores at 2 hours of equilibrium time, while on postfreezing the best results were obtained at 4 hours of equilibrium time. About pre freezing sperm vitality, the highest percentage of living sperm was gotten at 2 hours (78.23%) the same as post-freezing results (68.69%) at 2 hour of equilibrium time. About spermatic anomalies, the best equilibrium time with the highest percentage of normal sperm was 2 hours for both pre-freezing (86.42%) and post-freezing (82.60%). Key words: bovine, semen, equilibrium time, sperm quality, cryopreservation Translated by MSc. Bersabé Quinga xv

16 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN Para que la industria ganadera sobreviva en la economía actual, el ganado debe manejarse de tal manera que se pueda lograr un comportamiento reproductivo más eficiente (Háfez, 2000). En el ganado bovino, el macho reproductor juega un papel muy importante, dependiendo del método que se utilice puede servir a varias hembras y mucho más si se utilizan las técnicas de biotecnología. Sin embargo, su éxito o fracaso en la reproducción dependerá de su salud sexual, de su capacidad para la monta y de la calidad espermática que éste posea (Galina & Valencia, 2008). La crioconservación de semen es una importante biotecnología reproductiva, que busca promover la conservación del germoplasma masculino por tiempo indeterminado; junto con la inseminación artificial proporcionan un ahorro en la economía para el productor, al reducir los costos que implicaría el mantener un macho reproductor, así como los riesgos de contagio de enfermedades de transmisión sexual (Castelo et al., 2008). Durante la crioconservación, los espermatozoides sufren muchos cambios que pueden dañar la integridad de los mismos, lo que se puede ver reflejado en la disminución de la fertilidad (González, 2004). El tiempo de equilibrio es aquel en el que los espermatozoides permanecen en contacto con el diluyente a temperatura de 5ºC, previo a la congelación, el que puede durar entre 2 a 24 horas (Suárez & Coral, 2012). Varios estudios han determinado que la calidad espermática post-congelación varía en función del tiempo de equilibrio. Berndstone y Foote en 1972 propusieron un tiempo de equilibrado de 3 a 5 minutos con una temperatura de 5ºC ó 25ºC, ya que demostraron que durante este tiempo el 1

17 glicerol penetra en los espermatozoides de toro (Muiño, 2007). El esperma se puede mantener a 5ºC durante 24 horas antes de la crioconservación sin alterar la fertilidad del semen (Purdy et al., 2010). En otro estudio, donde se probaron 3 diferentes tiempos de equilibrio a 0, 2 y 4 horas a una temperatura de 5ºC, se obtuvieron los mejores resultados a las 4 horas de equilibrio con mayor supervivencia de espermatozoides (Leite et al., 2010). Aún existe una controversia acerca de cuál sería el tiempo de equilibrio recomendado en el que se obtendría una mayor calidad espermática posterior a la congelación. Actualmente en el Ecuador se han venido realizando estudios sobre calidad de semen bovino, midiendo relaciones directas entre las características andrológicas del reproductor y el semen, probando diferentes tipos de diluyentes y adicionando varias sustancias al momento de la dilución de semen. Sin embargo, en el país no existen trabajos donde se analicen las características espermáticas de muestras seminales sometidas a distintos tiempos de equilibrio. En el presente trabajo, se analizaron las características seminales pre y postcongelación probando distintos tiempos de equilibrio para determinar el efecto que éste ejerce sobre la calidad espermática. 2

18 CAPÍTULO II OBJETIVOS GENERAL Evaluar el efecto de distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad espermática pre y post-congelación de semen bovino. ESPECIFICOS Realizar y comparar el espermatograma, mediante análisis CASA, de bovinos reproductores antes y después de la congelación de semen sometido a diferentes tiempos de equilibrio. Determinar el tiempo de equilibrio en el que se obtenga la mejor viabilidad espermática pre y post-congelación en los distintos grupos de pajuelas con semen bovino. 3

19 CAPÍTULO III MARCO TEÓRICO Crioconservación de semen La crioconservación es una técnica mediante la cual el material biológico puede ser mantenido viable por tiempo indefinido (Medina et al., 2007); junto con la inseminación artificial proporcionan un ahorro en la economía para el productor, al reducir los costos que implicaría el mantener un macho reproductor, así como los riesgos de contagio de enfermedades de transmisión sexual (Castelo et al., 2008). Durante la crioconservación, los espermatozoides sufren muchos cambios que pueden dañar la integridad de los mismos, lo que se puede ver reflejado en disminución de la fertilidad (González, 2004). Se trata de un complejo proceso el cual integra varios factores como la dilución, la congelación, la descongelación y la fisiología propia del semen de cada especie, a los que se debe prestar mucha atención si lo que se busca son unos resultados satisfactorios (Castelo et al., 2008). La crioconservación de semen es importante para la preservación del germoplasma masculino de animales de valor zootécnico que pueden morir inesperadamente (Ribeiro-Peres et al., 2014). La aplicación de los procedimientos de crioconservación ha sido más exitosa en bovinos que en otras especies de animales domésticos, y tiene como finalidad obtener preñeces por inseminación artificial de manera tan eficaz como después del apareamiento natural (Háfez, 2000). 4

20 Antecedentes El semen de animales domésticos se ha sometido a criopreservación exitosamente desde hace más de 30 años y desde entonces se han venido mejorando continuamente (Háfez, 2000); sin embargo, la historia de la crioconservación comienza con el descubrimiento del espermatozoide que se remonta al año de 1677, cuando el científico holandés Anthony Van Leeuwenhoek reporta a la Real Sociedad de Londres haber encontrado células móviles en el semen humano. Casi 100 años después Abbe Lázaro Spallanzani (1775), sacerdote y profesor, reportó que los espermatozoides humanos, de potros y de ranas podrían ser congelados en la nieve por 30 minutos y posteriormente reactivados con calor para la recuperación de su movilidad. Paolo Mantegazza (1866) observó que el semen puede ser preservado al reducirse la temperatura y demostró que los espermatozoides del semen humano sobrevivieron luego de una congelación a -17ºC; éste fue uno de los primeros reportes de recuperación de células de mamíferos después de haber sido expuestas a bajas temperaturas en un punto de congelación. Chang y Walton en 1940 sugirieron utilizar la reducción de temperatura para deprimir la actividad metabólica de los espermatozoides y así prolongar su vida. Phillips en 1939, utiliza por primera vez la yema de huevo como sustancia crioprotectora, la que evita el shock térmico que sufren los espermatozoides al ser sometidos a la congelación (Bonadonna, 1986; Bwanga, 1991) El desarrollo de la criopreservación fue paralelo al de la inseminación artificial en animales, hasta llegar a hoy en día en el que las dos se encuentran fuertemente relacionadas. Métodos de crioconservación Un gran número de protocolos de congelación se han desarrollado principalmente debido a la diferencia que existe entre especies. Por esta circunstancia, las técnicas y procedimientos actuales deben ser validados 5

21 empleando el semen de la especie de interés, para de esta forma lograr su conservación a largo plazo sin afectar significativamente su calidad (Medina et al., 2007). Existen dos métodos de congelación de semen, el convencional y el automatizado. Método convencional.- las pajuelas con semen son colocadas sobre una gradilla metálica y refrigeradas en una nevera doméstica a una temperatura de 4ºC durante 4 horas; luego, las pajuelas pasan a una caja de poliestireno que contiene nitrógeno líquido; aquí las pajuelas son colocadas a 6 cm sobre la superficie del nitrógeno durante 20 minutos. Para finalizar, las pajuelas son sumergidas en nitrógeno líquido y, posteriormente, pasan a ser almacenadas en un termo de nitrógeno (Vasconcelos-Filho, 2010). Método automatizado.- luego del envase, las pajuelas son refrigeradas y congeladas utilizando un equipo automatizado de congelación de semen; la curva de congelación es dada por el software que posee el equipo y puede ser predeterminada por recomendaciones del fabricante o modificada por el operario según crea conveniente. Luego de la congelación, las pajuelas son sumergidas en nitrógeno líquido y finalmente almacenadas en un termo de nitrógeno líquido (Ribeiro-Peres et al., 2014). Efectos de la crioconservación sobre el espermatozoide Durante la crioconservación, los espermatozoides sufren muchos cambios que pueden dañar la integridad de los mismos, lo que se puede ver reflejado en disminución de la fertilidad comparada con semen fresco (González, 2004). El efecto negativo se ve reflejado sobre la calidad espermática posdescongelación, principalmente en la pérdida de viabilidad o daño funcional de los espermatozoides sobrevivientes. La baja viabilidad se debe a varios factores como: cambio de temperatura, estrés osmótico, la formación de hielo intracelular y la toxicidad (Watson, 2000). 6

22 El congelamiento demasiado rápido puede causar un choque térmico y la formación de cristales de hielo intracelulares; por el contrario, si la congelación es muy lenta, las concentraciones de sal aumentan a medida que el agua se congela. El incremento de la presión osmótica durante un largo periodo de congelación puede dañar las proteínas y lipoproteínas que posee el espermatozoide (Háfez, 2000). Entre un 40 y 50% de la población de espermatozoides no sobrevive al proceso de crioconservación y posdescongelación; sin embargo, un porcentaje de espermatozoides sobrevivientes han sufrido daños que los vuelven incapaces de fecundar. Por tal motivo, el protocolo de congelación no solo debe tener por objetivo el conseguir solo un mayor número de células vivas sino también que conserven su integridad (Stornelli & Stornelli, 2001). Tiempo de equilibrio Se define al tiempo de equilibrio como el tiempo en el cual los espermatozoides permanecen en contacto con el diluyente de congelación a una temperatura de 5ºC antes de ser congelado; durante este tiempo el crioprotector y otros componentes de los diluyentes penetran la célula hasta que se logra un balance de concentraciones (Díaz et al., 2015). Se plantea que el tiempo de equilibrio ayuda a la estabilización de la membrana de los espermatozoides para que pueda tolerar el intercambio de agua que se produce durante la congelación (Patt & Nath, 1969). Varios estudios plantean diferentes beneficios y desventajas del tiempo de equilibrio, variando los efectos sobre los espermatozoides según el tipo de diluyente, las concentraciones de azúcar, de glicerol y velocidad de enfriamiento de la muestra de semen, además de variar según la especie (Salamon & Maxwell, 2000). Berndstone y Foote, en 1972 demostraron que el glicerol penetra en los espermatozoides en un tiempo de 3 a 5 minutos a una temperatura de 5ºC o 25ºC (Muiño, 2007). El esperma puede mantenerse a 5ºC durante 24 horas antes de la crioconservación sin alterar su fertilidad pero tampoco la mejoran 7

23 (Purdy et al., 2010). Varios estudios mencionan que un tiempo de equilibrio más prolongado da como resultado mejor calidad espermática poscongelación, mientras que otros coinciden en que el tiempo recomendable seria entre 2 a 4 horas de tiempo de equilibrio (Díaz et al., 2015; Leite et al., 2010). Sin embargo, aún existe la controversia entre cuál sería el tiempo de equilibrio óptimo en el que se obtendría la mejor calidad espermática después de la congelación. Diluyentes El empleo de medios conservadores permite prolongar la viabilidad de la célula espermática, rentabilizar los eyaculados obtenidos y conservar las dosis por un periodo prolongado de tiempo (Mesa, 2012). Salisbury, VanDermark & Lodge, en 1982 afirman que las primeras sustancias que se utilizaron para la dilución de semen fueron soluciones salinas o azucaradas. Durante décadas se han venido estudiando diferentes soluciones con las cuales poder diluir semen, de bovinos principalmente; en 1950 existían diluyentes que permitían conservar semen solamente por un periodo de 4 días a una temperatura de 4ºC; luego se descubrió los beneficios de utilizar la yema de huevo, la cual brindaría la ventaja de disminuir el metabolismo de la célula espermática y prolongar su fertilidad a 5ºC. Háfez (2000) describe las funciones que deben realizar los agentes que forman parte de un buen diluyente: a. Aportan nutrimentos como una fuente de energía, b. Protegen contra el efecto nocivo del enfriamiento rápido, c. Son amortiguadores que impiden cambios perjudiciales en el ph al formarse ácido láctico, d. Mantienen la presión osmótica apropiada, el balance electrolítico e inhiben la proliferación bacteriana, e. Incrementan el volumen del semen de modo que éste pueda emplearse para múltiples inseminaciones y, f. Protegen a las células espermáticas durante la congelación. 8

24 Evaluación de semen Semen fresco El semen es una combinación de las secreciones de los testículos, de las vías espermáticas de conducción y de las secreciones de las glándulas accesorias. Contiene espermatozoides y diversas proporciones de secreción que aportan los diferentes órganos y glándulas del aparato genital masculino, denominadas en conjunto plasma seminal (Palma, 2006). Evaluación macroscópica Las características macroscópicas que se evalúan en el semen de bovinos son: volumen, color, densidad, olor y ph. Volumen.- se observa directamente sobre el tubo graduado, teniendo en cuenta que un toro mayor de 2 años debe tener un eyaculado de no menos de 4ml. El volumen puede variar entre 2 y 12ml (Gómez & Migliorisi, 2015). Color.- se consideran normales los colores que van del blanco al amarillento, siendo patológicos los colores rosado, amarronado y verdoso (Gómez & Migliorisi, 2015). Densidad.- se encuentra relacionado con la cantidad de espermatozoides que contiene; puede variar, desde un semen acuoso traslucido con menos de esp/mm3 hasta un cremoso con esp/mm3 (Ver Tabla 2) (Gómez & Migliorisi, 2015). ph.- Refleja el balance entre las diferentes secreciones, principalmente entre el ph alcalino de vesículas seminales y el ácido de la próstata (López Garcia et al., 2012). El ph del semen bovino varía normalmente en un rango muy estrecho entre 6,2 7,5 con un promedio de 6,8 (Gómez & Migliorisi, 2015). Olor.- Las muestras de semen recolectadas higiénicamente, de toros sanos y fértiles, tienen un débil olor sui géneris (Carpio, 2015). 9

25 Evaluación microscópica Las características microscópicas a evaluar en el semen de bovinos son: motilidad masal, motilidad individual, vitalidad, morfología y concentración espermática. Motilidad espermática Para que un espermatozoide sea capaz de fecundar a un ovocito ha de reunir una serie de requisitos, entre ellos, tener motilidad progresiva. Dicho parámetro ha sido y sigue siendo el más utilizado para valorar la calidad de un eyaculado o de una dosis seminal. Un eyaculado con un porcentaje bajo de espermatozoides móviles, o ausencia de motilidad, automáticamente será descartado para su conservación (Muiño, 2007). Motilidad Masal.- Por movimiento en masa se entiende al movimiento en onda de todos los espermatozoides, observado en los eyaculados densos (Carpio, 2015). Para su valoración se usa el semen fresco, colocando una gota de éste sobre un porta objetos precalentado a 37ºC en una plancha térmica a la misma temperatura y se observa bajo el microscopio con una lente 40x (Palma, 2006). El movimiento en masa va a depender de tres factores: concentración, porcentaje de células con movimiento progresivo y velocidad de movimiento de los espermatozoides (Muiño, 2007). Para evaluar se usa una escala de 1 a 5, evaluando como 1 al semen que no presenta ondas y 5 cuando las ondas se mueven rápidamente formado remolinos (Gómez & Migliorisi, 2015). Motilidad individual.- La motilidad individual de una muestra de semen se expresa como el porcentaje de células móviles bajo un campo microscópico. Debido a que el semen bovino es muy concentrado, no se puede realizar este análisis con semen fresco, por lo tanto, se lo debe diluir, colocar una gota sobre un portaobjeto temperado a 37ºC y observado al microscopio en una lente de 100x (Carpio, 2015). Morfología.- además de tener una buena motilidad progresiva, los espermatozoides deben ser morfológicamente normales. Cualquier anomalía 10

26 que afecte a algún atributo del espermatozoide puede dificultar su migración en el tracto genital de la hembra, impidiendo la unión con el ovocito (Muiño, 2007). En general, un buen reproductor no deberá tener más del 30% de células anormales en un eyaculado (Gómez & Migliorisi, 2015). Sin embargo, Háfez (2000) menciona que una muestra de semen deberá tener menos del 20% de células anormales para poder ser adecuado para la congelación. Gómez & Migliorisi (2015) describen distintas clasificaciones de las anomalías espermáticas atendiendo a distintos criterios: a. Primarias y Secundarias.- aquellas que se originan dentro del testículo durante la espermatogénesis (Malformaciones primarias) y aquellas que se originan dentro del epidídimo (Malformaciones secundarias). b. Mayores y Menores.- Esta clasificación la propuso Bloom en 1977; aquellas que estaban asociadas con infertilidad (Malformaciones Mayores), y aquellas que no se encontraban relacionadas con la fertilidad en forma directa (Malformaciones Menores). c. Compensables y No Compensables.- En 1994 Saacke y col. propusieron clasificar los defectos como Compensables a aquellos en los que el espermatozoide no llega a la vecindad del ovocito y no evita que otro espermatozoide realice la fertilización y que se compensa aumentando la concentración de la dosis seminal y, No Compensables cuando el espermatozoide está perfectamente capacitado para llegar hasta el ovocito, pero es incapaz de continuar el proceso de fertilización, por lo que no se puede compensar aumentando la concentración en la dosis seminal, ya que si la dosis posee un alto porcentaje de espermatozoides con esta anormalidad no habría diferencia. Concentración.- La concentración de espermatozoides se expresa como el número de espermatozoides por mililitro el que deberá ser de mínimo 100 millones por mililitro (Háfez, 2000). Existe una variabilidad muy grande en la 11

27 concentración de un eyaculado a otro y de un toro a otro, siendo importante conocer el número de espermatozoides por eyaculado, ya que de este parámetro depende el número de hembras a inseminar (Carpio, 2015). Sistema de Análisis Seminal Computarizado (CASA) El Computer Assisted Semen Análisis (CASA) fue desarrollado en la Universidad de Pennsylvania por Liu y Warne en 1977 y perfeccionado en 1980 por Amann y Hammersatedt; se introduce en el mercado a principio de los 80, originalmente para la evaluación de semen humano. Al paso de los años se ha ido perfeccionando y modernizándose. En la actualidad se utiliza mucho en el campo veterinario, tanto en investigación, como en el de la industria de los centros de inseminación artificial (Cuadrado et al., 2012). El sistema está conformado por una cámara de video conectada a un microscopio de fases y a una computadora que digitaliza las imágenes del tamaño y de los movimientos espermáticos. Las imágenes digitalizadas permiten analizar la velocidad de las células, el movimiento rectilíneo, circular o lateral (Brogliatti, 2016) Los sistemas CASA brindan resultados como un espermatograma clásico pero de una manera más rápida y objetiva de los diferentes parámetros como motilidad total, motilidad progresiva, motilidad local, concentración, porcentaje de vivos/muertos y morfología, logrando de esta manera, optimizar el procesamiento de muestras seminales. 12

28 CAPÍTULO IV MATERIALES Y METODOLOGÍA MATERIALES Físicos Sistema CASA, Marca: Minitübe (Software SpermVision ) Impresora automática para pajuelas, Marca: Minitübe, Modelo. EasyCoder Empacadora y selladora de pajuelas, Marca: Minitübe, Modelo: MPP Congelador automático con monitor, Marca: Minitübe, Modelo: IceCube 14 MA Vagina Artificial Camisas y conos de látex Tubos plásticos volumétricos para colecta de semen Porta y cubre objetos Planchas térmicas Micro pipetas Baño María Nitrógeno líquido Tanques de nitrógeno Biológicos Toros reproductores Semen bovino Químicos Diluyente para semen Agua bi-destilada 13

29 Suministros de oficina Registros (hojas de papel bond) Esferográfico Cámara fotográfica Libro de campo Computadora METODOLOGÍA Ubicación La investigación se llevó a cabo en la Central Nacional de Producción y Mejoramiento Genético El Rosario, que forma parte del Proyecto Ganadería Sostenible perteneciente al Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca (MAGAP), la que se encuentra ubicada en la Parroquia de Tambillo, Cantón Mejía, Provincia de Pichincha, a una altitud de 2900 metros sobre el nivel del mar, en las coordenadas 0 25'57.36"S; 78 34'29.85"O (Google maps, 2016). Con una temperatura promedio de 13.1 C (Máxima 21.5 C y mínima 6.4 C), humedad relativa promedio de 84% y precipitaciones de 1500 mm al año (MAGAP, 2016). Tipo de investigación Trabajo de campo y estudio experimental de laboratorio. Factores en estudio En esta investigación se evaluó y comparó el efecto que ejercen distintos tiempos de equilibrio sobre la calidad espermática de semen bovino antes y después de la congelación. Se utilizó siete tiempos de equilibrio, tomando como tiempo mínimo 2 horas, y otros seis tiempos con un intervalo de 4 horas (4, 8, 12, 16, 20, 24 horas). 14

30 Características de las unidades experimentales Bovinos machos reproductores de la raza Holstein Friesian, con edades similares comprendidas entre 2 y 3 años, peso promedio de 700kg y que viven bajo las mismas condiciones de alimentación y manejo. Unidades experimentales de laboratorio.- se utilizó pajuelas de 0.5ml, en total 70 pajuelas de cada toro, 10 para cada tiempo de equilibrio, de las cuales la mitad se analizó antes de la congelación y la otra mitad 72 horas posteriores a la congelación. Tabla 1. Unidades experimentales de laboratorio según los tiempos de equilibrio Tiempos Toro 1 Toro 2 Toro 3 Toro 4 Toro 5 de PreC PostC PreC PostC PreC PostC PreC PostC PreC PostC Equilibrio Número de pajuelas de 0.5ml 2 horas horas horas horas horas horas horas (PreC= pre-congelación, PostC= post-congelación) Preparación de toros reproductores Antes de la colecta de semen para el trabajo práctico se realizó una evaluación de los reproductores y una colecta de limpieza. Procedimientos Protocolo para análisis de semen Después de haber obtenido las muestras de semen, se las pasó al laboratorio para su respectivo análisis. El análisis se realizó manualmente a través de la observación directa, evaluando las características macroscópicas de la muestra, y sus características microscópicas a través del equipo CASA. 15

31 Análisis macroscópico Color y densidad.- estos dos parámetros se midieron tomando en cuenta la siguiente tabla: Tabla 2. Color y densidad del semen bovino Aspecto Valoración Concentración Cremoso Muy bueno (MB) esp/mm3 Blanco lechoso Bueno (B) 400 a esp/mm3 Blanco acuoso Regular (R) 250 a esp/mm3 Traslucido Pobre (P) Menos de esp/mm3 Fuente:(Gómez & Migliorisi, 2015) Volumen.- se tomó dos eyaculados por toro, en cada eyaculado se midió su volumen observando directamente al tubo volumétrico graduado donde se colectó el semen. PH.- sobre una tira indicadora de ph se colocó una gota de semen sin diluir y se procedió a leer. Análisis microscópico Motilidad espermática masal La platina térmica, los cubre y porta objetos estuvieron previamente temperados a 37ºC. Se colocó 5 µl de semen sobre un portaobjetos, cubriéndolos cuidadosamente con un cubreobjetos. La muestra se evaluó inmediatamente con una lente 40x. Se estableció el siguiente criterio para la valoración: Tabla 3. Análisis de la motilidad espermática masal Valor descriptivo Aspecto del modelo % células móviles Criterio evaluativo Muy buena Movimiento en ondas vigorosas >80% ++++ y en remolinos rápidos Buena Remolinos y ondas más lentas 60-80% +++ Regular Sin remolinos, pero con 40-60% ++ oscilaciones generalizadas Mala Escasa o ninguna motilidad <40% + o - Fuente: (Gómez & Migliorisi, 2015) 16

32 Motilidad espermática individual Se realizó una dilución de semen 1:100 (10 µl de semen y 990 µl de diluyente), se tomó una cantidad de 10 µl de esta dilución y se colocó sobre el portaobjetos cubriéndolo cuidadosamente con el cubreobjetos; se observó bajo el microscopio con objetivo de 40x y, de esta forma, se evaluó de la motilidad individual. La valoración se estimó de acuerdo a la siguiente tabla: Tabla 4. Evaluación de la motilidad espermática individual Valor (%) Clasificación Descripción < 30 Pobre Muy lento y errático Aceptable Lineal lento y generalizado Bueno Lineal moderadamente rápido >70 Muy bueno Lineal rápido Fuente: (Gómez & Migliorisi, 2015) Análisis seminal - CASA Se preparó el diluyente mezclándolo con agua bi-destilada y se colocó en el baño María a 37 C. Se calculó la cantidad de diluyente a utilizar, según el volumen de semen que el reproductor haya donado. El microscopio, platinas térmicas, portaobjetos, cubreobjetos y cámaras estuvieron precalentados a 37 C. Una vez estabilizado el semen en el baño María, se extrajo una muestra de 25 µl de semen del tubo graduado con una pipeta y se colocó en un tubo Eppendorf que se encontraba en la platina térmica previamente marcado con el código del reproductor. Usando otra pipeta, se tomó 900 µl del diluyente y se los colocó sobre el semen (25 µl) en el tubo Eppendorf del reproductor en cuestión. Se homogenizó el contenido del tubo Eppendorf, y se esperó que se estabilice. El semen restante que estaba en el Baño María se diluyó, usando una fórmula de dilución 1:1. 17

33 Utilizando una pipeta extrajimos 3 µl del semen diluido del tubo Eppendorf y con mucha precisión, se colocó en una cámara Leja previamente calentada en la platina térmica. Al iniciar el software SpermVision Production se ingresó la información del reproductor, y se procedió a observar la cámara Leja al microscopio enfocando el área donde se encuentra la suspensión a analizar. Luego de obtener el resumen de las características de la muestra de semen con una motilidad total mayor al 70%, se procedió a la impresión y llenado de pajuelas. Tiempo de equilibrio Se separó y etiquetó cada grupo de pajuelas por toro y para los diferentes tiempos de equilibrio. Se colocó todas las muestras debidamente identificadas en refrigeración a 5ºC y se anotó en un registro la hora en la que inicio el tiempo de equilibrio. Se esperó el tiempo de equilibrio (2, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 horas) respectivamente y se realizó el análisis pre congelación del grupo de muestras destinados para este análisis, el otro grupo de muestras ingresó a congelación. Análisis pre-congelación Una vez terminado el tiempo de equilibrio se procedió al análisis de las muestras antes de su congelación. Se escogió las pajuelas de cada lote y se las coloco en el baño María a una temperatura de 37 C. Se colocó el semen en un tubo Eppendorf previamente temperado y se tomó una gota de la muestra. Tomando 10 µl de la dilución, se puso sobre un portaobjetos previamente temperado y se cubrió cuidadosamente con un cubreobjetos y 18

34 Se llevó al microscopio para ser observado y evaluado con un objetivo de 40X. Análisis post-congelación El análisis se lo realizó 72 horas después de la congelación de las muestras. La platina térmica estuvo previamente temperada a 37ºC. Se escogió las pajuelas de cada lote y se descongeló en el baño María a 37ºC. El semen descongelado se colocó en un tubo Eppendorf previamente temperado. Se tomó una cantidad de 10 µl de esta dilución, se colocó sobre el portaobjetos y se cubrió la muestra cuidadosamente con el cubreobjetos. Finalmente se llevó al microscopio para su observación y análisis con objetivo de 40X. Tinción de vitalidad (Eosina-Nigrosina) Luego de extraído el semen y después de observar la motilidad, se tomó una gota de semen y se la colocó sobre un portaobjetos. Se agregó una gota del colorante de eosina, se homogenizó la mezcla y luego se agregó una gota de nigrosina. Luego de 1 minuto se realizó el frotis. Se observó al microscopio sin cubreobjetos con aumento 40x y se procedió al recuento de células vivas y muertas Se contó un total de 200 células distribuidas en el frotis, se estimó el porcentaje de vivos, a partir de las 200 células contadas. Los espermatozoides vivos en el momento de la coloración no se tiñeron. Los muertos se observaron de color rosado. Con el mismo frotis y bajo el mismo principio se realizó el conteo de espermatozoides normales/anormales. 19

35 Análisis estadístico Para el análisis de resultados se realizó ANOVA (análisis de varianza) junto con la prueba LS Means (minimos cuadrados medios) para la comparación entre los resultados obtenidos en la pre y post congelación y conocer si existió diferencia estadísticamente significativa; posteriormente, se utilizó la prueba estadística Duncan para determinar el mejor tiempo de equilibrio con mejores resultados en todas las variables analizadas. Para esto se utilizó el software estadístico SPSS Statistics y Microsoft Excel. 20

36 CAPÍTULO V RESULTADOS Y DISCUSIÓN Previo a la preparación de las dosis seminales para la experimentación se realizó una evaluación de los toros y un análisis inicial del semen para verificar que cumplían con los valores adecuados para su producción y posterior congelación (Ver Anexos 1 y 2). Las variables de estudio de la calidad de semen pre y post congelación fueron: Análisis con Sistema CASA: Porcentaje de Motilidad Espermática Total (MT%), Porcentaje de Motilidad Espermática Progresiva (MP%), Análisis manual: Tinción de vitalidad (relación espermatozoides vivos/muertos) y morfología espermática (Normales/Anormales), Cuadro Nº1. Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en la pre-congelación con diferentes tiempos de equilibrio. Vitalidad Morfología Tiempos de equilibrio (horas) Motilidad Espermática Total (%) Motilidad Espermática Progresiva (%) Espermatozoides Vivos (%) Muertos (%) Espermatozoides Normales (%) Anormales (%) ± 7.40 a ± 9.65 a ± 6.54 a ± 6.54 c ± 1.99 a ± 1.99 a ± 4.47 a ± 8.05 ab ± 6.44 ab ± 6.44 bc ± 3.73 a ± 3.73 a ± 8.06 a ± 9.77 ab ± 6.94 ab ± 6.94 bc ± 3.83 a ± 4.02 a ± 9.43 ab ± ab ± 7.99 ab ± 7.99 bc ± 2.57 a ± 3.29 a ± 7.75 ab ± 7.96 b ± 6.76 abc ± 6.76 abc ± 2.13 a ± 3.30 a ± 4.97 ab ± 5.98 b ± 4.20 bc ± 4.20 ab ± 2.89 a ± 2.89 a ± 5.59 b ± 7.50 b ± 5.05 c ± 5.05 a ± 2.91 a ± 2.91 a Los valores corresponden a Media ± Desv. Est. (n=25) abc valores con la misma letra son significativamente similares. Fuente: Investigación directa (2016); Elaboración: El Autor. En el Cuadro Nº1 se muestran los resultados obtenidos en el análisis seminal antes del proceso de congelación al término de cada tiempo de equilibrio para cada una de las diferentes variables que serán descritas mas adelante. 21

37 Cuadro Nº2. Indicadores encontrados de la calidad de semen bovino en la post-congelación con diferentes tiempos de equilibrio. PORCENTAJE Tiempos de equilibrio (horas) Motilidad Espermática Total (%) Motilidad Espermática Progresiva (%) Vitalidad Espermatozoides Vivos (%) Muertos (%) Morfología Espermatozoides Normales (%) Anormales (%) ± 6.53 a ± 8.14 a ± 5.70 a ± 5.70 b ± 2.12 a ± 2.12 b ± 4.27 a ± 7.51 a ± 5.01 a ± 5.01 b ± 2.35 ab ± 4.23 ab ± 7.25 bc ± 2.31 b ± 7.21 b ± 7.21 b ± 3.81 ab ± 3.81 ab ± 5.17 bc ± 8.98 b ± 5.86 b ± 5.86 b ± 4.41 b ± 4.41 a ± 8.39 bc ± 9.00 b ± 8.32 b ± 8.32 b ±2.37 b ± 3.85 a ± 6.02 c ± 8.22 b ± 6.69 b ± 6.69 a ± 3.70 b ± 3.70 a ± 8.24 c ± 9.39 b ± 7.94 b ± 7.94 a ± 4.55 b ± 4.55 a Los valores corresponden a Media ± Desv. Est. (n=25) abc valores con la misma letra son significativamente similares. Fuente: Investigación directa (2016); Elaboración: El Autor. En el Cuadro Nº2 se muestran los resultados del análisis seminal depues de ser sometido al proceso de congelación y descongelación para cada una de las diferentes variables. a) Motilidad Espermática Total Gráfico Nº1. Comparación de la Variable Motilidad Espermática Total Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino MOTILIDAD ESPERMATICA TOTAL TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS) Motilidad EspermáticaTotal Pre congelación Motilidad EspermáticaTotal Post congelación Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor 22

38 El Gráfico Nº1 muestra los valores de los resultados obtenidos de la variable Motilidad Espermática Total antes y después de la crioconservación: estos valores se encuentran descritos en los Cuadros Nº1 y Nº2; según el método estadístico LS Means (Mínimos Cuadrados Medios) existe una diferencia estadísticamente significativa entre los resultados pre y post congelación. Esta diferencia estadísticamente significativa se presenta debido al estrés que sufre la membrana por el cambio de temperatura, las lesiones producidas por el congelamiento de las membranas solo se invierten parcialmente con el descongelamiento (Watson, 2000). La motilidad post congelación se reduce a valores entre 40 a 50% (Háfez, 2000). El método estadístico Duncan clasificó por grupos los resultados en los diferentes tiempos de equilibrio ordenándolos de mayor a menor, para de esta manera determinar cuál fue el mejor tiempo de equilibrio; en el análisis pre congelación se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa entre las 2 y 24 horas de tiempo de equilibrio y ubica como mejor resultado a las 2 horas de tiempo de equilibrio. En los resultados post congelación se obtuvo una mayor MT a las 4 horas de tiempo de equilibrio, aunque no se encontró diferencia significativa entre las 2 y 4 horas, lo que indica que la congelación en cualquiera de estos dos tiempos podrían dar los mismos resultados porque están sujetos al azar. En un trabajo similar realizado con búfalo africano se encontró que un tiempo de equilibrio superior a 4 horas puede ser perjudicial para los espermatozoides (Herold et al., 2006) coincidiendo con los resultados del presente trabajo y de otros autores en que se obtiene mayor motilidad total con tiempos de equilibrio no tan prolongados, como Leite (2010) que probó 3 tiempos de equilibrio (0, 2 y 4 horas) obteniendo mejores resultados a las 4 horas; del mismo modo Galarza, (2013) determinó que existe una mejor MT a las 2 horas de tiempo de equilibrio, si bien los tiempos de equilibrio mayores a 4 horas muestran diferencias estadísticamente significativas no disminuye la motilidad total como para descartar su uso. 23

39 PORCENTAJE b) Motilidad Espermática Progresiva En los Cuadros Nº1 y Nº2 se indican los valores de la motilidad espermática progresiva, en los que se evidenció un efecto negativo provocado por la crioconservación y por esta razón se obtuvieron diferencias altamente significativas entre los resultados pre y post congelación, estos valores se encuentran representados en el Gráfico Nº2. Gráfico Nº2. Comparación de la Variable Motilidad Espermática Progresiva Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen 80 Bovino MOTILIDAD ESPERMÁTICA PROGRESIVA TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS) Motilidad Espermática Progresiva Pre congelación Motilidad Espermática Progresiva Post congelación Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor Con respecto a la variable motilidad espermática progresiva, la prueba estadística Duncan ubica al tiempo de equilibrio pre congelación de 2 horas (73.47%) como el mejor, en el que se obtuvo mayor porcentaje de MP, con una mínima diferencia con el tiempo 4 horas (71.01%) y una diferencia altamente significativa con el tiempo 24 horas (66.05%). Sin embargo, la prueba de Duncan establece relaciones entre todos los demás tiempos de equilibrio, lo que indica que se podrían dar resultados similares entre los tiempos de equilibrio 8, 12, 16 y 20 horas. En los resultados post congelación se obtuvo como mejor tiempo de equilibrio al tiempo 4 horas (61.11%) de MP. A la prueba de Duncan se obtuvo dos grupos, ubicando a los tiempos 2 y 4 horas en el Grupo A y a los tiempos 8, 24

40 PORCENTAJE 12, 16, 20 y 24 horas en el Grupo B, lo que indica que no existe diferencia significativa entre los tiempos que integran un mismo grupo, pero sí existe diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos. A diferencia de la motilidad total, que no diferencia entre movimiento rectilíneo o circular de los espermatozoides, la motilidad progresiva indica la cantidad de espermatozoides que avanzan hacia adelante; por tal motivo esta característica es mucho más importante, ya que se trata del porcentaje de espermatozoides capacitados para alcanzar el óvulo y fecundar. En estudios realizados por Díaz (2015); Galarza (2013) y Leite (2010) obtuvieron mejores resultados a las 2 y 4 horas de tiempo de equilibrio, a diferencia de otros grupos experimentales sometidos a tiempos de equilibrio más prolongados, resultados similares a los q se obtuvieron en el presente trabajo. c) Espermatozoides Vivos/Muertos Con los valores descritos en los Cuadros Nº1 y Nº2 se realizó el análisis estadístico LS Means donde se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en la variable espermatozoides vivos/muertos entre en el semen sin congelar y el que fue sometido al proceso de congelación/descongelación. Gráfico Nº3. Comparación de la Variable Espermatozoides Vivos Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio de Semen Bovino ESPERMATOZOIDES VIVOS TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS) Espermatozoides vivos Pre congelación Espermatozoides vivos Post congelación Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor 25

41 En el gráfico Nº3 se puede apreciar la diferencia que existió en la variable espermatozoides vivos antes y después de ser sometidos al proceso de crioconservación. A la prueba Duncan, en los resultados pre congelación no existieron diferencias significativas entre los tiempos de equilibrio, a excepción del tiempo 2 y 24 horas; el tiempo de equilibrio 2 horas se ubicó por encima de los otros tiempos con un 78.23% de espermatozoides vivos. En los resultados post congelación, los tiempos de equilibrio 2 y 4 horas (68.69% y 68.46% respectivamente) no presentaron diferencia significativa y se ubicaron por encima de los demás tiempos con el mayor porcentaje de espermatozoides vivos. Leite en el 2010 realizó un estudio similar en toros Gyr y obtuvo resultados similares a los del presente trabajo con un mayor porcentaje de espermatozoides vivos en un tiempo de equilibrio de 4 horas; en otro estudio realizado por Díaz en el 2015 indicó que existieron buenos resultados a las 4 horas de tiempo de equilibrio y que no existieron diferencias significativas entre los tiempos de equilibrio más prolongados al igual que en la presente investigación; sin embargo, a diferencia de nuestros resultados Díaz obtuvo una mayor proporción de espermatozoides con membrana plasmática íntegra a las 24 horas de tiempo de equilibrio. Existió una disminución del porcentaje de espermatozoides vivos en el semen sometido a crioconservación con relación al que se evaluó antes del proceso de congelación. De la variable espermatozoides vivos/muertos se menciona que las membranas celulares son las estructuras celulares que sufren mayor daño en los procesos de congelación, debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos (González, 2004; Parks & Graham, 1992). d) Morfología (Espermatozoides Normales/Anormales) En los Cuadros Nº1 y Nº2 se presenta diferencia altamente significativa entre el semen antes y después de la congelación para la variable espermatozoides normales/anormales con una diferencia promedio de 5% para todos los tiempos de equilibrio. 26

42 PORCENTAJE Gráfico Nº4. Comparación de la Variable Espermatozoides Normales Pre y Post Congelación para los Diferentes Tiempos de Equilibrio en Semen Bovino ESPERMATOZOIDES NORMALES TIEMPOS DE EQUILIBRIO (HORAS) Espermatozoides Normales Pre congelación Espermatozoides Normales Post congelación Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor El Gráfico Nº4 muestra claramente la diferencia que existió entre el porcentaje de espermatozoides vivos antes y después de la congelación. En el Cuadro Nº1, con respecto a la variable espermatozoides normales/anormales pre congelación, se obtuvo como mejor resultado al tiempo de equilibrio 2 horas con un porcentaje de 86.42% de espermatozoides normales; sin embargo, el método estadístico Duncan muestra que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre todos los tiempos de equilibrio y los ubica dentro de un mismo grupo. El Cuadro Nº2 muestra los resultados del análisis post congelación, el mayor porcentaje de espermatozoides normales se obtuvo a las 2 horas de equilibrio (82,60%), en este caso la prueba Duncan forma 2 grupos, el Grupo A formado por el tiempo de equilibrio 2 horas y el Grupo B formado por los tiempos 12, 16, 20 y 24 horas mostrando la diferencia que existió entre las muestras en los diferentes tiempos, los tiempos 4 y 8 horas pueden formar parte del Grupo A o B debido a que no poseen diferencia significativa con ambos grupos. Galarza, (2013) realizó un trabajo probando 3 tiempos de equilibrio (2, 5 y 7 horas) y obtuvo resultados similares a los nuestros con un mayor porcentaje 27

43 de espermatozoides normales a las 2 horas de tiempo de equilibrio, al igual que con al variable anterior Leite (2010) tambien coincide con nuestros resultados al haber obtenido mayor número de espermatozoides normales en un tiempo de equilibrio no mayor a 4 horas. Si la proporción de anormalidades espermáticas antes de la congelación es más del 20%, nos encontramos ante un semen de baja fertilidad (Háfez, 2000). La proporción de espermatozoides normales post congelación debe tener un mínimo de 70% (Galarza, 2013). 28

44 CAPÍTULO VI CONCLUSIONES Existieron diferencias entre los resultados pre y post congelación en todos los diferentes tiempos de equilibrio para las diferentes variables (MT%, MP%, espermatozoides vivos/muertos y espermatozoides normales/anormales), siendo menores los resultados post congelación, esto debido a que las muestras seminales ya fueron sometidas al proceso de congelación y descongelación sufriendo cambios drásticos en la integridad de los espermatozoides a diferencia del otro grupo que no se congeló y se mantuvo solamente en tiempo de equilibrio sin sufrir cambios de manera tan drástica. Los mejores resultados para las variables MT% y MP% pre congelación se dieron a las 2 horas de tiempo de equilibrio, y los mejores resultados post congelación para las mismas variables fueron a las 4 horas de tiempo de equilibrio. El mejor resultado para la variable espermatozoides vivos/muertos pre y poscongelación se evidenció a las 2 horas de tiempo de equilibrio. En la variable espermatozoides normales/anormales pre congelación no existió diferencia significativa entre los diferentes tiempos de equilibrio, mientras que en los resultados post congelación para la misma variable se obtuvo menor porcentaje de anormalidades a las 2 horas de tiempo de equilibrio. 29

45 BIBLIOGRAFÍA Bonadonna, T. (1986). Reproducción Animal e Inseminación Artificial (Primera Ed). Buenos Aires: Editorial Hemisferio Sur S.A. Brogliatti, M.. (2016). El impacto de calidad seminal en los programas de IATF. Sintex. Universidad Nacional Del Centro De La Provincia De Buenos Aires, Buenos Aires. Bwanga, C. (1991). Cryopreservation of boar semen. IA literature review. Swedish University of Agricultural Sciences. Retrieved from Carpio, S. (2015). Evaluación de dos diluyentes para la crioconservación de semen bovino: yema de huevo vs leche descremada. Universidad Politécnica Salesiana Sede Cuenca. Castelo, T., Rodríguez, T., & Rodriguez, A. (2008). Considerations on goat semen cryopreservation. Acta Veterinaria Brasilica, 2(3), Cuadrado, F., Cubero, M., & Goméz, C. (2012). Espermatozoides in vitro: Qué Es El Sistema Casa? Retrieved from Díaz, R., Torres, M., Painemil, S., Martins, S., De Andrade, A., Bravo, S., & Sepulveda, N. (2015). Efecto Del Diluyente Y Tiempo De Equilibrio Sobre La Motilidad E Integridad De Membrana Post-Descongelación De Espermatozoides De Carnero. Spermova, 5(1), Galarza, A. (2013). Eficacia De Dos Diluyentes: Tris + Lecitina De Soya (Andromed ) Y Tris + Yema De Huevo (Triladyl ), En La Crioconservación De Semen De Toro De La Raza Jersey En Cuenca Ecuador. Universidad De Cuenca. Galina, C., & Valencia, J. (2008). Reproducción de los Animales Domésticos. México D.F: LIMUSA. 30

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48 Salamon, S., & Maxwell, W. M. C. (2000). Storage of ram semen. Animal Reproduction Science, 62(1 3), Salisbury, G., VanDermark, N., & Lodge, R. (1982). Fisiología de la Reproducción e Inseminación Artificial de los Bovinos. Zaragoza, España: Acribia. Stornelli, M., & Stornelli, M. (2001). Inseminación artificial con semen fresco, refrigerado y congelado; aplicación y desarrollo en caninos. Analecta Vet, Retrieved from nacion_caninos.pdf Suárez, R., & Coral, A. (2012). Técnicas de congelación y sexado del semen bovino y su importancia en reproducción bovina. MVZ Córdoba, 12(23), Retrieved from Vasconcelos-Filho, W. (2010). Eficiência da congelação automatizada na viabilidade de sêmen bovino. Universidade Federal Rural Do Rio De Janeiro Instituto. Watson, P. F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Science, 60 61,

49 ANEXOS Anexo 1. Análisis inicial de comportamiento reproductivo de toros, color y volumen de semen en 2 colectas NOMBRE DEL TORO LÍBIDO NÚMERO DE SALTOS VOLUMEN EYACULADO (Salto 1) ml VOLUMEN EYACULADO (Salto 2) ml VOLUMEN TOTAL ml COLOR Orión 4 2 4,0 6,5 10,5 BC Sham 4 2 6,0 4,5 10,5 BL Onsite 4 2 3,5 4,0 7,5 BA Iconic 4 2 4,0 4,5 8,5 BC Probe 4 2 4,0 6,0 10,0 BL (BC=Blanco Cremoso, BL= Blanco Lechoso, BA= Blanco Acuoso) Fuente: Investigación directa (2016); Elaboración: El Autor. NOMBRE DEL TORO Anexo 2. Análisis inicial de semen fresco de toros ph MM (1-5) MI% CONCENTRACIÓN (millones/ml) Orión ,4 86,89 74,87 Sham ,0 79,37 72,34 Onsite ,5 74,45 67,39 Iconic ,5 83,06 76,24 Probe ,3 86,47 82,35 (MM= Motilidad Masal, MI%= Porcentaje de Motilidad Individual, MT%= Porcentaje Motilidad Total, MP%= Porcentaje Motilidad Progresiva). Fuente: Investigación directa (2016); Elaboración: El Autor. Anexo 3. Registro de análisis seminal pre y pos congelación para los diferentes tiempos de equilibrio. MT % MP % TIEMPO DE EQUILIBRIO (HORAS) MT (%) MP (%) ESPERMATOZOIDES VIVOS (%) VITALIDAD ESPERMATOZOIDES MUERTOS (%) NORMALES (%) MORFOLOGIA ANORMALES (%)

50 (MT%= Porcentaje Motilidad Total, MP%= Porcentaje Motilidad Progresiva). Fuente: Investigación directa (2016) Elaboración: El Autor. Anexo 4 Fotografías Material para colecta de semen Fuente: El Autor. 35

51 Armado de vaginas artificiales Fuente: El Autor. Toros reproductores Holstein Friesian Fuente: El Autor. 36

52 Sala de colecta Fuente: El Autor. Maniquí Fuente: El Autor. 37

53 Colecta de semen Fuente: El Autor. Equipos de laboratorio Fuente: El Autor. 38

54 Análisis de las muestras de semen Fuente: El Autor. Análisis con Sistema CASA Fuente: El Autor. 39

55 Muestras en refrigeración a 5ºC (tiempo de equilibrio) Fuente: El Autor. Congelación de muestras Fuente: El Autor. 40