REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE Congelación

Transcripción

1 REPRDUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUN DE LECHE Congelación J. De la Fuente INIA Reproducción Animal y Conservación Recursos Zoogenéticos jfuente@inia.es Máster Interuniversitario en Zootecni a y Gestión Sostenible: ganadería ecológica e integrada. Instituto de Estudios de Postgrado Universidad de Córdoba Córdoba, Mayo 2009

2 TRANSFERENCIA DE EMBRINES BVINS SELECCIÓN DE DNANTES SUPERVULACIÓN MANIPULACIÓN: BTENCIÓN EVALUACIÓN CNSERVACIÓN TRANSFERENCIA

3 Que es la criopreser vación? Enfriamiento reversible de células hasta una temperatura en la cual cesa la actividad biológica. 3 pasos: * Preparación y enfriamiento * Conservación a baja temperatura * Descongelaci ón

4 Mecanismos de da ño o celular durante la criopreservación Formación de cristales de hielo Daño osmótico Efecto tóxico del crioprotector Fractura de la zona y del embrión Daño en las organelas intracelulares Ruptura de los contactos entre células

5 CRIPRT ECTRES Son necesarios en las soluciones de congelación para prevenir el daño celular durante la congelación y descongelación. Grupos de crioprotectores: 1.- De bajo Pm y permeables, como: Etilenglicol, 1-2 Propanodiol, Glicerol y otros. - Reemplazan el agua intracelular minimizando la formación de cristales. - Regulan la deshidratación y protegen la estructura proteica. 2.- De bajo Pm y no permeables, como: Glucosa, Sacarosa y otros azucares. - Deshidratan las células antes de la congelación minimizando la formación de cristales. - Estabilizan la estructura de la membrana. 3.- De alto Pm no permeables, como: Polivinilpirrolidona, Polivinil alcohol y otros polímeros como el Ficol. - Protegen en congelación/descongelación alterando el tamaño y la forma de los cristales. En la congelación se utilizan concentraciones del ~10% de crioprotectores En la vitrificación se utilizan mezclas de altas concentraciones de crioprotectores; etilenglicol, glicerol y propanodiol ~40%, en combi nación con azucares

6 Adición del crioprotector a la congelación Glicerol btenci ón Glicerol Sacarosa Etilenglicol

7 Equilibrio smótico y formación de cristales en la congelación 20ºC -5ºC Enfriamiento Rápido Lento Supervivencia 100 Hielo intracelular Velocid ad (ºC/min)

8 CURVA DE CNGELACIÓN DE EMBRINES INTRDUCCI ÓN EN EL CNGELAD R CRISTALIZACIÓN TEMPERATURA , ,5 0,5ºC/mi ' ' 73'= 1h 13' TIEMP LN 2

9 CURVA DE DESCNGELACI ÓN DE EMBRINES 20 RETIRADA DEL CNGELADR 10 TEMPERATURA TIEMP LN2

10 Retirada del crioprotector a la descongelación TE

11 DESCNGELACIÓN DE EMBRINES ETILEN GLICL 1,5M TRANSFERENCIA DIRECTA CAMBI DE ESTAD 10 AIRE+ 20 A 27ºC 10% GLICERL 5 6,6% GLICERL + SACARSA 0,3M en PBS+0,4% BSA 5 3,3% GLICERL + SACARSA 0,3M en PBS+0,4% BSA 5 0% GLICERL + SACARSA 0,3M en PBS+0,4% BSA 5 PBS+0,4% BSA 8 0% GLICERL + SACARSA 1M en PBS+0,4% BSA 5 PBS+0,4% BSA TRANSFERENCIA

12 Transferencia de embriones vacunos Frescos Congelados C1 C2 Total C1 C2 Total Descongelados Degenerados 25 (11%) 30* (40%) 55 TE Gestaciones % Gestación *: p<0.001

13 RESULTADS CALIDAD EMBRINES TRANSFERIDS PARTS Nº % GLICERL ETILENGLICL FRESC C1 C2 TTAL C1 C2 TTAL C1 C2+C3 TTAL ,5 a 8 47, , ,4 ab, c 6 25 d 62 48, ,7 b, e 18 39,1 f TTALES ,9 a vs b: P<0.01; c vs d: P<0.01; e vs f: P<0.01

14 Vitrificación - Es el término usado en la criopreservación a bajas temperaturas creando un estado vitreo completo (congelamiento sin cristales de hielo). Para suprimir la formación de cristales al bajar la temperatura, la solución ha de alcanzar una alta viscosidad y eventualmente entrar en una fase vítrea. - Para lograr la vitrificación en tasas de enfriamiento prácticas se necesitan concentraciones multimolares de los crioprotectores permeables (mayor al 30%), la toxicidad de los solutos involucrados es muy alta. -Los métodos para minimizar los efectos tóxicos de altas concentraciones de crioprotectores, incluyen: La equilibración de los embriones en dos pasos El equilibrado a bajas temperaturas La reducción de los tiempos de equilibrio El uso de sustancias como la sacarosa que pueden disminuir la toxicidad.

15 Vitrificación Para alcanzar la vitrificaci ón: Inmersión directa en LN2 en pajuelas de 0.25 a ~2500 C/mi n. Altas concentraciones de crioprotectores (del 30%) implican una alta toxicidad celular al tener que equi librarse con el material biológico. Métodos para disminuir la toxicidad de altas concentraciones de cr ioprotector: Equilibración de embriones en dos pasos. Equilibración a bajas temperaturas. Reducción del tiempo de equi librado. La formaci ón de cristales letales depender á de: El volumen de la muestra a c ongelar. La velocidad de enfri amiento. La viscosidad de la solución. Métodos para vitrificar: Píldoras. pen pull straw (PS). Cryo-loops (CLV).

16 Vitrificación - Resulta mayor el daño producido por la formación de cristales durante la descongelación que durante l a vitrificación. - Incrementar la concentración de solutos con crioprotectores no permeables permite poder disminuir los crioprotectores permeables más tóxicos. - La probabilidad de formaci ón de cristales es directamente proporci onal al volumen e inversa a la viscosidad y a la velocidad de enfriamiento. - Una reducción del volumen de 20 µl (pajuelas de 0.25 ml) a 0.1 µl hace incrementar la velocidad desde 1,200 C/min (inmersión en LN2 de pajuelas de 0.25 ml) a C/min (PS). - El método PS (Vajta, 1998) resulta el mas eficaz actualmente. Aunque el contacto directo con el nitrógeno es una limitante importante, por la posible contaminación. * En la actualidad aun no se puede abordar c omercialmente la vitrificación en las especies domésticas.

17 Congelación rápida - La congelación rápida es la criopreservación de embriones parcialmente deshidratados antes de aplicarles tasas de enfriamiento de aproximadamente ºC/min. - Se utiliza una solución con 2 a 4,5M de un crioprotector permeable (glicerol, propanediol, DMS o etilenglicol), y 0,25 a 0,5M de otro no permeable (sacarosa, tetralosa, lactosa). - Después de un período de equilibración (30 seg. a 3 min.) los embriones en estado de deshidratación parcial se enfrían en vapor de nitrógeno antes de sumergirlos en LN2. - En contraste con la vitrificación, el agua extracelular se congela y la osmolaridad de la solución aumenta, causando la pérdida de agua del embrión. - La congelación de embriones bovinos ha resultado en tasas de supervivencia menores (33,3%) cuando se comparó con métodos convencionales de congelado.

18 VENTAJAS DE LA CNGEL ACIÓN Fin A) Difusión de genes: Incremento de la producción Implantación rápida de cambios en la producción B) Sanidad: Limita la transmisión de enfermedades Permite la limpieza sanitaria de las ganaderías C) Conservación: Animales en peligro de extinción (incrementa el n) Permite la limpieza sanitaria de las ganaderías D) De cobertura mundial ilimitada