TÉCNICAS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL CÓRDOBA (IRAC) TÉCNICAS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS Belascoain María Gabriela Díaz Érica Teresa Hüter Soledad Trabajo Final Para optar al Título de Especialista en Reproducción Bovina CÓRDOBA,

2 Resumen El objetivo de esta revisión es brindar información sobre las diferentes técnicas de criopreservación de embriones bovinos, analizando las ventajas y desventajas de cada una de ellas en lo que respecta a su realización, costos, instalaciones y porcentajes de preñez. La criopreservación es el proceso por el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente a la temperatura de ebullición del nitrógeno líquido (-196 C), para disminuir las funciones vitales de una célula u organismo y poder mantenerlo en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. Esta técnica presenta ventajas biológicas y comerciales, permitiendo transportar embriones a cualquier lugar del planeta donde se encuentren las vacas receptoras; logrando muy buenos porcentajes de preñez que varían según la calidad del embrión y la técnica aplicada. El proceso de criopreservación se clasifica en equilibrado y no equilibrado, según se utilicen técnicas que logren o no un equilibrio osmótico entre el medio y el agua intracelular antes de la congelación del embrión. Dentro de la criopreservación en equilibrio se encuentra la técnica tradicional con tres variantes: estándar, de un paso y transferencia directa. En la primera el tiempo de exposición al crioprotector es de diez a treinta minutos; siendo una técnica relativamente lenta al igual que las otras dos variantes, su mayor desventaja es el tiempo requerido para la descongelación ya que se necesitan hacer pasajes por soluciones con distintas concentraciones de glicerol y sucrosa, haciendo esto también elevar su costo. En la variante de un paso el tiempo requerido para la descongelación es menor, la desventaja es que muchas veces no se logran homogeneizar correctamente las soluciones contenidas en la pajuela, haciendo esto variables los porcentajes de preñez. En la transferencia directa se requiere menor tiempo de exposición al crioprotector que en la estándar; la descongelación es más rápida no requiriendo el pasaje por las distintas soluciones, haciendo también esto disminuir los costos de dicha técnica. Los porcentajes de preñez son similares a los de la estándar. En la criopreservación no equilibrada hay mayor deshidratación y penetración del crioprotector previo al enfriamiento, lo que las hace más rápidas que las equilibradas. Dentro de esta hay dos variantes: rápida y vitrificación. En la primera los porcentajes de preñez son bajos comparados con las demás técnicas. En la vitrificación los porcentajes de preñez son aun variables, por estar todavía en desarrollo, pero en algunos casos similares a la técnica estándar. 2

3 BENEFICIOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES Gracias a los avances desarrollados a nivel mundial en el campo de la reproducción asistida, es factible obtener un incremento en el número de embriones obtenidos de una hembra donante. Con la ayuda de tratamientos hormonales superovulatorios, se logra la preñez y el nacimiento de las crías al transferirlos a receptoras sincronizadas. De esta manera, se alcanza un mayor número de descendencias a partir de un animal con excelentes cualidades, tanto productivas como genéticas. (2) Considerando que, en general, el promedio de una vaca donante de embriones es de aproximadamente 8 a 10 ovocitos recolectados, que de ellos se obtiene 6 a 7 embriones transferibles, dando 3 a 4 gestaciones exitosas y que la tasa de preñez es del orden de 60% utilizando embriones frescos y 30 a 40% con embriones criopreservados (4), la potencialidad exponencial que tiene este método de reproducción asistida logra maximizar la explotación de la especie bovina. El uso de la criopreservación de embriones dentro del proceso de transferencia de embriones, brinda una herramienta de suma utilidad, ya que a través de esta técnica podemos conservar durante un prolongado período de tiempo un embrión de excelente calidad, que permite utilizarlo cuando y donde se produzcan las condiciones favorables para lograr la preñez de las receptoras, o ser usada en algún lugar lejano de donde fue colectado. Desde la primera criopreservación de embriones de mamíferos lograda con éxito en los años 70, este campo ha alcanzado grandes avances, todos dirigidos a estandarizar técnicas simples y rápidas en su ejecución, económicas, aplicables a campo y lo más importante, que ocasionan el menor daño posible al embrión (2). En la actualidad la criopreservación ya cuenta con equipos que realizan parte del proceso automáticamente utilizando diferentes programas y productos. La posibilidad de congelar abre las perspectivas para el intercambio comercial entre países respetando las regulaciones sanitarias, facilitando y abaratando el transporte de estos, brindando de esta forma los beneficios de un material genético altamente valioso (9). La transmisión potencial de enfermedades a través de los embriones es considerablemente menor que a través del semen o de animales vivos, gracias a la presencia de la zona pelúcida integra del ovocito, aunado a un adecuado procedimiento de lavado del embrión, previo a la congelación (2). Esto conlleva a que la exportación de embriones sea mucho más segura y económica que la compra de ganado en pie, sin embargo es necesario adoptar medidas estrictas de cuarentena para prevenir la contaminación de los embriones y reducir el riesgo de la trasmisión de enfermedades. (8) ETAPAS DE LA CRIOPRESERVACIÓN Básicamente, la criopreservación embrionaria contempla cuatro etapas: a) suspensión de los embriones en soluciones a la que se les ha adicionado crioprotectores, b) enfriamiento en condiciones tales que eviten la formación de cristales intracelulares cuando se sumergen en nitrógeno liquido (-196 ºC), c) entibiamiento de los embriones a temperaturas fisiológicas para reasumir las funciones y, d) remoción de los crioprotectores (dependiendo del criopreservante del que se trate (4). 3

4 Figura 1. Termo y tanque con nitrógeno liquido para almacenamiento de embriones bovinos. CRIOPROTECTORES Un crioprotector es un compuesto químico que permite la mantención de un tejido o de células por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los crioprotectores difieren en la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes. (3) En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores: Permeables o intracelulares: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma. Impermeables o extracelulares: De alto peso molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sacarosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares. Estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua. A su vez éstos se dividen en impermeables de alto y de bajo PM, los de bajo PM deben combinarse con los permeables para proteger efectivamente a las células durante el congelado. Los de alto PM protegen a las células durante congelado y descongelado alterando la formación de cristales de hielo a un tamaño y forma inocua. Los crioprotectores previenen la deshidratación total y la degeneración proteica (causada por la congelación del agua intra y extracelular durante el proceso). Además, no deben ser tóxicos a los embriones. Para reducir el daño osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la alta concentración de sales, se esta dejado de utilizar G y DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con sacarosa o trealosa que ha demostrado ser menos tóxico. El DMSO es muy tóxico a temperatura ambiente, pero si se aplica a baja temperatura es el 4

5 que posee mejor resultado, lo que lo hace muy riesgoso por lo que no se recomienda usarlo. Dado su bajo peso molecular, el EG tendría una mayor velocidad de penetración y, por ende, necesitaría menor tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico. El estado de desarrollo embrionario tiene gran incidencia en la velocidad de penetración del crioprotector. Al respecto, Leibo (1977) demostró que la permeabilidad de los embriones a los crioprotectores se incrementa luego de la fecundación, aumentando a medida que el desarrollo embrionario progresa. Esto se debería a la diferencia que existe en la relación área/volumen en un embrión en los primeros estadios del desarrollo. CONSERVACIÓN DE EMBRIONES Un paso indispensable en la transferencia de embriones es la conservación temporal de los embriones recolectados de una donante antes de ser transferidos o congelados, ésta se realiza en un medio de Solución Buffer Fosfato (PBS), suplementado con 10% de suero fetal bovino que representa una fuente de proteínas que reduce la tensión superficial, favorece la sedimentación, evita que los embriones se adhieran a algún elemento utilizado para su manipulación, incorpora sustancias promotoras del crecimiento que favorecen su desarrollo, absorbe e inhibe metales pesados tóxicos que puedan estar presentes en el medio. La viabilidad embrionaria declina después de 12 horas. Los embriones de bovinos mantenidos en un medio no nutritivo por un largo tiempo y a temperatura ambiente decrecen ampliamente su capacidad de desarrollo, este desarrollo puede ser preservado si los embriones se refrigeran de 0 a 4 ºC por no más de 24 horas técnica denominada refrigeración la cual se efectúa vehiculizando los embriones en PBS envasados en pajuelas de 0.25 ml y colocadas en un refrigerador. Se utiliza hielo y agua para regular el descenso de la temperatura. La refrigeración de embriones puede ser considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la criopreservación. TÉCNICAS DE CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES 5

6 Figura 2. Esquema de correlación de las diferentes técnicas de criopreservación de embriones bovinos Criopreservación en equilibrio Como su nombre lo indica, las técnicas de criopreservación en equilibrio deben lograr un "equilibrio" entre la tasa a la cual el agua sale de la célula (deshidratación) y la tasa a la cual ese agua es incorporada a los cristales de hielo extracelular. La técnica Tradicional perteneciente a este tipo de criopreservación incluye las técnicas Estándar, de un paso y de Transferencia Directa de los cuales se hará una corta descripción. Tradicional Los crioprotectores (CP) utilizados en esta técnica son normalmente permeables. Los más frecuentemente utilizados son: glicerol y etilenglicol. Durante la fase inicial de preenfriamiento, los embriones se exponen a la presencia del crioprotector en una fase que denominamos de equilibración. La respuesta inmediata del embrión ante la presencia de un CP permeable es una rápida disminución de volumen por pérdida del agua intracelular, hasta que se alcanza el equilibrio. Este fenómeno se debe a la hiperosmolaridad inicial de la solución extracelular y a que los embriones son mucho más permeables al agua que a los crioprotectores; la contracción se detiene cuando se alcanza el equilibrio entre la salida de agua y la entrada del CP. A medida que el CP penetra en el embrión, éste se expande gradualmente a causa de una reentrada de agua para el mantenimiento del equilibrio osmótico. La mayoría de los embriones mamíferos se congelan con la técnica tradicional utilizando crioprotectores permeables y con tasas de congelación lentas y de descongelación relativamente rápidas. Los procedimientos convencionales de congelación lenta incluyen los siguientes pasos: Identificación y clasificación de los embriones. 6

7 Figura 3. Búsqueda e identificación de los embriones recolectados. Embriones bovinos Lavado de los embriones según las normas de la IETS. Figura 4. Lavado de los embriones. Exposición de los embriones a temperatura ambiente (22ºC) a concentraciones molares de un crioprotector permeable de bajo peso molecular (PM) como G y EG, hasta que alcanza un equilibrio entre la solución crioprotectora y el embrión, la duración de este periodo va a depender del crioprotector, el tiempo optimo para el EG es entre 5 y 10 minutos y para el G es entre 10 y 20 minutos. Durante este tiempo en que se equilibran los embriones se pueden ir cargando en las pajuelas, sellarlas e identificarlas. Inducción de la formación de cristales (seeding) entre -5 y -7ºC. Descenso lento y controlado de la temperatura (0,3 a 1,0ºC/min) hasta los -30 o - 35ºC. Colocación en nitrógeno líquido (NL) donde pueden permanecer almacenados infinitamente. Descongelación controlada a alrededor de 250ºC/min. Remoción del crioprotector a temperatura ambiente (en el caso del G) Transferencia del embrión a una receptora. Dentro de los sistemas de equilibrio (inicialmente diseñados para la congelación de embriones in vivo), la técnica más utilizada en el caso de la producción de embriones in vitro (EPIV) es la congelación en EG 1,5M en presencia de sacarosa. El equilibrio se alcanza a -7ºC (Tº de seeding) para después, realizar un descenso de la temperatura hasta los -32ºC a una velocidad de 0,3ºC/min. (5). 7

8 Figura 5. Esquema representando los cambios de volumen celular en embriones congelados/descongelados en glicerol 1,5 y colocados en solución de sacarosa 1,0 M antes de colocarlos en medios de mantenimiento, o directamente colocados en medio de mantenimiento. Las flechas esquematizan la dirección del flujo de agua y glicerol y el grosor de las mismas esquematizan la diferencia de velocidad del flujo, debido a diferencias en la permeabilidad. TE = transferencia. (11) La descongelación es relativamente rápida por ejemplo a Baño Maria a 20-37ºC durante segundos. Inmediatamente de realizada la descongelación, el crioprotector debe ser retirado del embrión para evitar el shock osmótico. En un principio la extracción se efectuaba de manera escalonada, colocando los embriones sucesivamente en soluciones decrecientes del crioprotector o incorporando progresivamente PBS; en la actualidad se logro extraer el crioprotector en una sola etapa, empleando sacarosa que actúa como una contrafuerza osmótica restringiendo el movimiento de agua a través de las membranas. Los embriones congelados con el método tradicional con glicerol o con etilenglicol deben ser descongelados rápidamente para una óptima sobrevida. Un protocolo típico de descongelación incluye mantener las pajuelas durante 5 a 10 segundos en el aire (lo que evita que se rompa la zona pelúcida) y luego sumergirlas en agua a 25-37ºC hasta que el hielo este completamente derretido en aproximadamente 30 segundos. La descongelación completamente al aire resulta en una reducción de la viabilidad embrionaria, mientras que la descongelación directamente en agua resulta en una alta incidencia de fracturas de la zona pelúcida. Los porcentajes de preñez son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección del embrión hasta el comienzo de la congelación. La viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho periodo es mayor a 3 horas. 8

9 Con respecto a los periodos de desarrollo embrionario se han obtenido mejores resultados con mórulas tempranas que con blastocitos y blastocitos expandidos (Dochi y col., 1998). Según estos autores los estadios más avanzados serian más sensibles a sufrir daño durante la congelación por tener un mayor grado de diferenciación celular y presencia de líquido en el blastocele. En oposición a esto Prather y col (1987) sostienen que los estadios mas avanzados son los que presentan mejor viabilidad post-descongelación y postulan que el avance en el desarrollo implicaría un grado inherente de viabilidad lo que les concedería a estos embriones menor posibilidad de sufrir degeneración celular. Por su parte, Arreseigor y col. (1998) obtuvieron porcentajes de preñez de 57,1% en los embriones de calidad pre-congelación excelente, 52,9% de los de buena y 31,2% en los de calidad regular. La congelación Tradicional incluye las técnicas Estándar, de un paso y de Transferencia Directa de los cuales se hará una corta descripción. Estándar La técnica de congelación estándar posibilitó a Wilmut y Rowson (1973) obtener el primer ternero nacido de la transferencia de un embrión congelado. A la técnica estándar se le han efectuado desde entonces distintas modificaciones tendientes a su simplificación. En la técnica de congelación estándar la exposición de los embriones al medio de congelación (PBS + G) debe realizarse a temperatura ambiente (20-22 C), en un solo paso, de 10 a 30 minutos de duración. Este período incluye el envasado de los embriones en pajuelas plásticas de 0.25cc. Lo que permite realizar rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o "seeding". Las pajuelas deben ser colocadas en un equipo de congelación a -7 C durante 5 minutos para equilibrar la temperatura de las pajuelas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la pajuela con una placa metálica o hisopo enfriado con nitrógeno líquido (NL 2 ); el agente refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido, alcohol, etanol o metanol enfriado por medio de un compresor. El no inducir la cristalización conduce a la formación de cristales de hielo bajo un estado de súper enfriamiento y a una elevación repentina de temperatura (se genera calor latente de 10º - 15 ºC), resultando un severo trauma físico que puede dañar las células. Una vez efectuada la cristalización, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de estabilización) y luego se desciende a una velocidad de entre 0.1 y 0.5 C hasta -30 ó -35 C para establecer un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular, en este momento las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en nitrógeno líquido. De un paso Desde el momento en que se demostró que la sacarosa podía ser utilizada para retirar el crioprotector de los embriones, surgió la posibilidad de diseñar una técnica de 9

10 extracción que se adaptara al trabajo en condiciones de campo. Para evitar que durante la extracción del crioprotector el embrión esté en contacto con el medio externo, Leibo (1982) y Renard y col. (1982), implementaron el denominado método de congelación de embriones en un paso o "one-step". Este procedimiento se basa en el uso de un crioprotector no permeable, como la sacarosa, que permite la remoción de un crioprotector permeable, como el glicerol. Con esta técnica, se pueden transferir los embriones directamente a la hembra receptora sin la necesidad de una evaluación microscópica previa a la transferencia y sin el repetido shock osmótico que sufren las células cuando se usa el método en etapas; de esta manera se erradica el procedimiento de dilución o extracción del crioprotector. No obstante, al prescindir de la evaluación morfológica post descongelación, es razonable esperar que los resultados de preñez sean inferiores. En este caso, los medios de congelación (1,5 M de glicerol) y dilución (0,5 a 1,0 M de sucrosa) son incluidos en la misma pajuela, pero separados por burbujas de aire. Después de la descongelación, la pajuela se agita con el fin de mezclar ambas soluciones y de esta forma el glicerol abandona el embrión como resultado del gradiente de concentración causado por la solución de sacarosa. Como la sacarosa no es permeable, el embrión se contrae a medida que el agua y el glicerol salen de las blastómeras. El embrión eventualmente se rehidrata con los fluidos del útero de la hembra receptora una vez que ha sido transferido y alcanza nuevamente su volumen osmótico. Esta técnica representa una gran ventaja práctica, dado que posibilita transferir embriones congelados de manera similar a lo que ocurre con la inseminación artificial. La tasa de preñez lograda con este método se aproxima a la que se alcanza con las técnicas tradicionales, pero los resultados son variables. Pareciera ser, que la causa principal de esta variabilidad se debe a la dificultad de mezclar ambas soluciones crioprotectoras dentro de la pajuela. Cuando el glicerol es extraído, la viabilidad embrionaria puede ser afectada al no lograr una mezcla homogénea de las distintas soluciones unidas a una pérdida ocasional del embrión, porque éste se puede adherir al algodón que la pajuela tiene en uno de sus extremos. Además, se ha demostrado que las altas concentraciones de sucrosa causan daño al embrión cuando existen elevadas temperaturas. (2) De Transferencia Directa Una versión de la técnica de un paso, es la llamada técnica de transferencia directa, en el cual se emplean crioprotectores altamente permeables tales como el etilenglicol o el 1,2 propilenglicol. En tal sentido, las pajuelas son descongeladas y el embrión es transferido directamente al útero de las receptoras. Como estos crioprotectores son altamente permeables, los embriones que son congelados y descongelados sufren un daño osmótico muy leve cuando son transferidos directamente a un ambiente isosmótico (útero). El uso de otros crioprotectores como el glicerol utilizado en el método anterior, con mayor peso molecular y tasa de permeabilidad lenta, estaría contraindicado ya que causaría un elevado shock osmótico. Esta técnica simplifica sustancialmente el procedimiento de la transferencia embrionaria, ya que permite la transferencia de los embriones directamente al útero de las receptoras, sin extraerlos de la pajuela en la que fueron congelados. Además, reduce el 10

11 tiempo requerido para realizar la técnica y disminuye los costos. En cuanto a la tasa de preñez, no difiere mucho a la obtenida con la técnica tradicional en los cuales se remueve el crioprotector antes de la transferencia (2). Figura 6. Disposición de las distintas soluciones en el interior de la pajuela en los protocolos de transferencia directa. PBSS = solución buffer fosfato suplementada con suero o albúmina sérica, G = glicerol, S = Sacarosa, EG = etilenglicol (1) Criopreservación no equilibrada El término no equilibrada, se usa para describir la criopreservación por procedimientos en los cuales las células y los tejidos no están en equilibrio con las altas concentraciones de crioprotectores permeables y no permeables, antes de un enfriamiento rápido. Las altas concentraciones de crioprotectores causan una rápida deshidratación de las células y el enfriamiento ocurre antes del equilibrio osmótico entre el medio y el embrión. Los procedimientos de criopreservación no equilibrada, difieren de los procedimientos equilibrados en el logro de una mayor deshidratación y penetración de los crioprotectores previo al inicio del enfriamiento, logrando este enfriamiento en un solo paso. Los procedimientos no equilibrados de criopreservación poseen dos variantes: la criopreservación rápida y la vitrificación, dependiendo si forma o no hielo en la solución durante la criopreservación. (2) Rápida Esta técnica es usada para describir la criopreservación de células que han sido parcialmente deshidratadas antes de ser sometidas a una tasa de enfriamiento rápido de 1250 ºC/min. Un prerrequisito fundamental para criopreservar embriones exitosamente por este método, es usar una solución compuesta de una mezcla de 2 a 4,5 M de crioprotectores permeables, tales como el glicerol, el propanediol, el dimetilsulfóxido o el etilenglicol, y 0,25 a 0,5 M de crioprotectores no permeables tales como la sacarosa, la trehalosa, la lactosa o la galactosa (Gordon, 1994). Después de un período de equilibrio (30 segundos a 3 minutos), los embriones en un estado parcialmente deshidratado son enfriados en temperaturas intermedias de 21ºC durante 35 minutos antes de ser sumergidos en nitrógeno líquido. En contraste con la vitrificación, el agua extracelular se congela y la osmolaridad de la 11

12 solución de congelación aumenta, causando mayor pérdida de agua desde las blastómeras del embrión. La criopreservación de embriones bovinos por esta técnica ha proporcionado tasas de preñez bajas (33,3%), si se compara con los métodos convencionales de congelación lenta o de vitrificación. (2) Vitrificación La vitrificación es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos, tejidos y embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriada no cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar al vidrio, tomando de ahí su nombre. Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en NL no requiere más de 10 minutos. En condiciones practicas, la vitrificación se logra mediante la inmersión directa en NL. Esto representa una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 2500ºC/min, resultando necesario el empleo de soluciones altamente concentradas de uno o mas CP permeables que pueden ser toxicas para las células. (1) Durante el proceso de vitrificación, el embrión esta sometido a deshidratación durante el enfriamiento e hidratación durante el descongelamiento. Esto se debería a que a medida que desciende la temperatura, se va formando mayor número de cristales de hielo provenientes de agua pura intracelular, y así la concentración del soluto va aumentando en los espacios que aún no se congelan. Este choque osmótico es conocido como "efecto solución", y puede llegar a ser dañino para la sobrevivencia del embrión debido a la pérdida del equilibrio de las soluciones intra y extracelulares, respuestas químicas y osmóticas de las células a dichos efectos. El máximo daño en el embrión durante el enfriamiento ocurre de -15 a -16 ºC debido a la fase de transición de la membrana lipídica. Esta fase se ve afectada por la fusión de los liposomas afectando el termocomportamiento de las membranas en la transición de líquido a gel y la velocidad de penetración de los crioprotectores. El daño celular incluye pérdida de microvellosidades, disrupción de la membrana plasmática, cambios mitocondriales, hinchamiento del retículo endoplásmico, pérdida de uniones entre células así como fractura de zona pelúcida. La etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación en etilenglicol es la mórula compacta y blastocito temprano de embriones producidos in vivo o in vitro, así como también se ha demostrado que embriones producidos in vitro tienen menor tolerancia a la congelación debido a la formación de hielo intracelular, aumento en la concentración de lípidos y enzimas que digieren la zona pelúcida, lo que los hace más sensibles al enfriamiento y a la invasión de virus, bacterias y hongos. Otro aspecto a considerar es la calidad de los embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular. 12

13 Figura 7. Pasos en la vitrificación de un embrión bovino. La pajilla Francesa (0,25 ml) se carga por succión solución de sacarosa aire solución de vitrificación + embrión aire-sellado térmico. La pajuela se sumerge en nitrógeno liquido para vitrificación. (8) Técnicas de Vitrificación: Antes de la vitrificación, los embriones deben ser equilibrados con el crioprotector a temperatura ambiente. La técnica descrita por Sheffen y col. en 1986 indica que la exposición a la solución de equilibrio (SE) (10% G + 20% PG en PBS) debe realizarse a temperatura ambiente (20 ºC), durante 10 minutos y la exposición a la SV (25% G + 25% PG) a 4 ºC. Dobrinsky y col. en 1991 deshidrataron al embrión en SE (10% G y 25% PG) por 7 minutos a 20 ºC, pasando a SV (25% G y 25% PG) manteniendo la misma temperatura hasta introducirlo al NL. (3) En 1987, Massip y col. obtuvieron el nacimiento del primer ternero producto de la transferencia de un embrión vitrificado. El protocolo original (Figura 5) resultó apto para vitrificar mórulas compactas y blastocistos tempranos pero no, blastocisto. (1) Figura 8. Protocolo de vitrificación desarrollado por Massip y col en 1987 (1) 13

14 Dochi y col. en 1990 y Kasai en 1996 equilibraron mórulas y blastocistos bovinos (SE) (10% G + 20% 1 2 Propanodiol) durante 10 minutos, luego los expusieron a SV (25% G + 25% 1-2 Propanodiol + sucrosa 1M en PBS), inmediatamente después de cerrada la pajuela se introdujo lenta y progresivamente en el nitrógeno para que se produzca simultáneamente la vitrificación de los compartimentos extra e intracelulares, lo que posibilitó también transferir los embriones a campo. Utilizando estas soluciones se obtuvo porcentajes de preñez del 50%, demostrando que son soluciones estables con poca tendencia a cristalizar durante el enfriamiento. (3) Sommerfeld y Niemann en 1999 vitrificaron embriones bovinos producidos in vitro (IVP) con EG M, teniendo porcentajes de preñez del 42%. Dochi y col. en 1995 utilizaron 40% EG, 20% PVP y 11,3% trealosa, para determinar la toxicidad de la vitrificación con relación a la temperatura y tiempo de exposición. El tratamiento fue llevado a cabo a 20 ºC, durante 5 minutos, en PBS, obteniendo tasas de preñez del 84%. (3) Vajta y col. en 1996 equilibraron embriones de 7 días en SV al 50% (12.5% EG y 12.5% DMSO + 75% PBS) a temperatura ambiente durante 5 minutos, fueron transferidos a SV al 100% (25% EG y 25% DMSO) a 4 ºC durante 20 segundos y posteriormente sumergidos en nitrógeno, obteniendo altas tasas de preñez con blastocistos tempranos. Dhali y col. en 2000 utilizaron una combinación de EG 3.5M y DMSO 3.4M con un tiempo de equilibrio de 3 minutos obteniendo tasas de preñez del 69%. Yang y col. en 2000 probaron la adición de PVP (10%) y Trealosa (0.3M) obteniendo porcentajes de preñez del 50% en embriones producidos in vitro y 55% en embriones producidos in vivo. (3) Los crioprotectores pueden ser removidos de los embriones en tres y seis pasos en forma escalonada, hasta lograr una concentración final de PBS sin crioprotector. Saito en 1994 utilizó dos pasos sacarosa 0.5M. y 0.25M, manteniendo al embrión durante cinco minutos en cada una. El embrión también puede transferirse en forma directa. En los últimos trabajos realizados en vitrificación se ha intentado reducir al máximo el daño celular, por los crioprotectores, su concentración y su volumen. Esto llevó a Vajta y col. en 1997 y 1998 a ensayar una técnica de vitrificación denominada OPS (Open Pulled Straw) que consiste en adelgazar una pajuela plástica de 0.25 ml, calentándola sobre una platina y estirándola en su parte central hasta que su diámetro interior llegue a mm. Luego de enfriada la pajuela es cortada en su parte más delgada. El embrión es recogido por la parte más fina de la pajuela mediante capilaridad y luego esta es inmediatamente sumergida en NL. Embriones de 8 días sobrevivieron al cultivo en un 81% utilizando este método. (3) Kong y col. en 2000 vitrificaron en una ultra mini pajilla ( mm de diámetro) para reducir el daño por el alto volumen de la SV, obteniendo tasas de preñez a la descongelación y cultivo del 72%. (3) Recientemente Martino y col. en 1996 ha ensayado el uso de diferentes tipos de contenedores para vitrificación de embriones, como son las gradillas de cobre para microscopio electrónico y Matsumoto y col. en 2001 las mallas de nylon.(3) En estos contenedores se logró vitrificar de 15 a 65 embriones a la vez. Los resultados obtenidos 14

15 utilizando estas técnicas de vitrificación fueron similares a sus controles y ofrecen una nueva alternativa para criopreservar gran número de embriones.(2) Análisis comparativo de las distintas técnicas La mayoría de los embriones mamíferos se congelan por la técnica tradicional utilizando crioprotectores permeables ya que tiene la ventaja de realizarse una descongelación relativamente rápida a 20-37ºC durante segundos, presentar buenos porcentajes de preñez entre (45-60 %) al utilizar embriones de calidad excelente y buena, pero presenta el inconveniente de que inmediatamente de realizada la descongelación, el crioprotector debe ser retirado del embrión para evitar el shock osmótico, lo que hace que se requiera un tiempo mayor que al utilizar otros métodos más directos. A su vez requiere una cámara de congelación que a pesar de que se la puede programar con varios programas de congelación tiene un costo de U$S 6500 aproximadamente que encarece la aplicación de esta técnica. Figura 9. Congeladora de embriones CL 2200 Mediante la variante de la tradicional llamada de un paso se puede transferir los embriones directamente a la hembra receptora sin necesidad de realizar el procedimiento de dilución o extracción del crioprotector. No obstante ello, se prescinde de la evaluación morfológica post descongelación, por lo que es razonable esperar que los resultados de preñez sean inferiores que en el del método tradicional propiamente dicho. Esta técnica representa una gran ventaja práctica, dado que posibilita transferir embriones congelados de manera similar a lo que ocurre con la inseminación artificial. La tasa de preñez lograda con este método se aproxima a la que se alcanza con las técnicas tradicionales, pero los resultados son variables, por la posible mala homogenización de las soluciones. Cuando el glicerol es extraído, la viabilidad embrionaria puede ser afectada al no lograr una mezcla homogénea de las distintas soluciones unidas a una pérdida ocasional del embrión, porque éste se puede adherir al algodón que la pajuela tiene en uno de sus extremos. Además, se ha demostrado que las altas concentraciones de sacarosa causan daño al embrión cuando existen elevadas temperaturas (2). En el de transferencia directa las pajuelas son descongeladas y el embrión es transferido directamente al útero de las receptoras, al igual que en el método de un paso. Pero como los crioprotectores (E y PG) que se usan son altamente permeables, los embriones que son congelados y descongelados sufren un daño osmótico muy leve cuando son transferidos directamente a un ambiente isosmótico (útero). Este método simplifica sustancialmente el procedimiento de la transferencia embrionaria, ya que permite la 15

16 transferencia de los embriones directamente al útero de las receptoras, sin extraerlos de la pajuela en la que fueron congelados. Además, reduce el tiempo requerido para realizar la técnica y disminuye los costos. En cuanto a la tasa de preñez, ésta se acerca a la obtenida con la técnica tradicional. (2) De los procedimientos no equilibrados de criopreservación, la criopreservación rápida requiere la preparación de las pajuelas en relativamente poco tiempo, unos 35 minutos con los embriones antes de ser metido directamente en el NL. Pero las tasas de supervivencia son bajas (33,3%), si se compara con los métodos convencionales de congelación lenta o de vitrificación. (2) En la vitrificación todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en NL no requiere más de 10 minutos. Pero puede causar daño celular, como ser, pérdida de microvellosidades, disrupción de la membrana plasmática, cambios mitocondriales, hinchamiento del retículo endoplásmico, pérdida de uniones entre células así como fractura de zona pelúcida en el embrión durante el enfriamiento entre -15 a -16 ºC. Básicamente en la práctica la diferencia entre los CP más difundidos (EG y G) es la forma de descongelado, al usar G se usa una mezcla de ambos sistemas, el convencional y el simplificado que es el que incluye la sucrosa en el envasado, en la que se coloca G y la sacarosa separadas por las burbujas de aire quedando en el medio el embrión en la solución de G, se agita la pajuela y se transfiere el embrión. En la que solo contiene G, se descongela, se debe sacar el sellador, y empujar el tapón de algodón de la pajuela para hacer que el embrión salga a una capsula de Petri que contenga la primera solución de dilución, pasando sucesivamente a la siguiente solución de la siguiente manera: 1) A la solución que contiene 6.6% glicerol +0.3 M sucrosa en la que se deja durante 5 minutos. 2) Luego a la de 3.3 %glicerol +0.3 M sacarosa por durante 5 minutos. 3) A la de 0.3 M sacarosa durante 5 minutos. 4) Luego tres pasajes por Holding y se carga el embrión en la pajuela que se va a usar para TE. Por lo que además de tener que usar la serie de soluciones mencionadas anteriormente se requiere disponer de una fuente de energía eléctrica, un microscopio cuyo valor ronda los U$S 4000, una heladera para los medios y soluciones, micropipetas para manipular los embriones, placas de Petris, sellador de pajuelas, disponer de un ayudante capacitado que realice el proceso de descongelamiento y cargado de pajuelas y/o una planificación detallada por el tiempo que esto requiere, etc. Comprado con el uso de EG con el cual al usarlo como CP solo se requiere descongelar la pajuela y directamente transfiere. 16

17 Figura 10. Microscopio Olympus Cx40 Trinocular Inmunoflurescencia. Figura 11. MicropipetaVolumen Fijo para manipulación de embriones. Bibliografía 1) Cabodevila J., Teruel M, Criopreservación de embriones bovinos. En: Biotecnología de la reproducción. (ed.) Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria INTA. Argentina, pp ) Cabrera P., Fernández A Criopreservación de Embriones: una herramienta básica en la Reproducción Asistida. Revista de la Facultad de Ciencias Veterinaria Central de Venezuela Venezuela. Publicado en internet, disponible en Activo agosto ) Crioprotectores. Publicado en internet, disponible en Revista de la Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Central de Venezuela. 4) De los Reyes S. M Las biotecnologías en la reproducción animal. Avances en producción animal Nº 21 (1-2):

18 5) Diez Monforte C Congelación de embriones producidos In Vitro. Publicado en internet, disponible en animal.com.ar/informacion_tecnica/transplante_embrionario/08- congelacion_embriones.htm Activo Agosto ) Hafez E. S. E Y Hafez B Cap 30. Preservación y criopreservación de gametos y embriones. En: Reproducción e inseminación artificial en animales. (ed.) Mc Graw-Hill Interamericana, México, pp ) Hasler Jonh F., The freezing, Thawing, and Transfer of Cattle Embryos. Factors Affecting Calf Crop.Biotechnology of Reproduction. Ed. CRC.Estados Unidos.pp ) Jainudeen M. R., Wahid H., Hafez E. S. E Cap. 29. Inducción de ovulación, producción y transferencia de embriones. En: Reproducción e inseminación artificial en animales. (ed.) Mc Graw-Hill Interamericana, México, pp ) Roa N. A., Linares T., Tamasaukas R Métodos y aplicaciones de la criopreservación de oocitos y embriones en bovinos y otros mamíferos. Una revisión. Revista Científica, FCV-LUZ/ Vol. VIII, Nº 1, ) Ruiz j, Correa J Desarrollo partenogenético in vitro con ovocitos vitrificados bovinos.. Publicado en internet, en Activo Agosto ) Ungerfeld R Reproducción en los animales domésticos. Tomo II. Melibea ediciones. Montevideo, Uruguay, pp Esta información no es parte de la monografía es por si se decide poner en las diapositivas al exponer el Trabajo Costos de Insumos CONGELADORA DE EMBRIONES CL 2200 $6.200 Dólares más envió desde Bogota Colombia Precio al 08/09/2009 de Implementos Ganaderos 18

19 Microscopio Olympus Cx40 Trinocular Inmunoflurescencia Precio: U$S (Artículo usado) Ubicación:Capital Federal Precio: $ 140 (Artículo nuevo) MicropipetaVolumen Ubicación: Capital Federal (Zona Hospital De Clinicas) micropipeta-volumen-fijo-_jm 19