UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA MAESTRÍA EN CIENCIAS: PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS AVANCES

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Luis Miguel Martínez Jiménez
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actividad antidiabética y antioxidante in vitro de extractos

compuestos fenólicos mayoritarios PRESENTA NANCY GIRÓN CRUZ

1 UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA MAESTRÍA EN CIENCIAS: PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS AVANCES Evaluación de la actividad antidiabética y antioxidante in vitro de extractos polares de Justicia spicigera y elucidación estructural de los compuestos fenólicos mayoritarios PRESENTA NANCY GIRÓN CRUZ DIRECTOR DE TESIS DR. RAÚL SALAS CORONADO Huajuapan de León, Oax., Abril 2014

2 CONTENIDO 1. OBJETIVOS 2. METODOLOGÍA 3. RESULTADOS 4. CONCLUSIÓN 2

3 1. OBJETIVOS

4 OBJETIVOS Objetivo General Determinar la actividad antioxidante y antidiabética in vitro de los extractos de Justicia spicigera, así como relacionar esta actividad con los compuestos fenólicos presentes en los extractos. 4

5 Objetivos Específicos 1. Obtener extractos ricos en compuestos fenólicos a partir de las hojas de J. spicigera. 2. Determinar la actividad antidiabética y antioxidante in vitro de los extractos. 3. Elucidar la estructura de los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en los extractos. 4.Correlacionar la actividad antioxidante y antidiabética de los extractos. 5

6 2. METODOLOGÍA

7 METODOLOGÍA 1 Hojas de J. spicigera Limpieza del extracto (SPE) Secado Extracto limpio Molienda y tamizado Fenoles totales Flavonoides totales DPPH Actividad antidiabética Almacenamiento -20 C Elucidación estructural (IR, MS, RMN) Decocción Infusión Ultrasonido: metanol, acetona 70%, etanol 70%, agua Extracto crudo 7 1

8 Obtención y secado de la muestra Metodología J. spicigera Km N O Huajuapan de León 8

9 Obtención y secado de la muestra Metodología Hojas de J. spicigera 9

10 Obtención y secado de la muestra Metodología Malla 0.5mm Secado Molienda Foss Cyclotec Tamizado Malla #60 10

11 Obtención de extractos crudos Metodología 1. Extracción obtenida por Decocción 1. Mezclar a temperatura ambiente. 2. Calentar hasta ebullición. 3. Enfriar y filtrar. 4. Almacenamiento a -20 C. 700 mg polvos 11

12 Metodología 2. Extracción mediante una Infusión 1. Calentar agua hasta ebullición. 2. Mezclar con polvos. 3. Enfriar y filtrar. 4. Almacenamiento a -20 C. 700 mg polvos 12

13 Extracción asistida por Ultrasonido Metodología 100 mg polvo + 1 ml disolvente: H 2 O (H 2 O-US) MeOH (MeOH-US) EtOH 70 % (EtOH-US) Acetona 70% (ACT-US) 35 C por 15 min Almacenamiento -20 C 13 Presión reducida 40 C

14 Extractos crudos Metodología Extracción por: 1. Decocción de hoja fresca 2. Decocción de hoja seca 3. Infusión de hoja seca Extracción asistida por ultrasonido de hoja seca en: 4. H 2 O 5. MeOH 6. EtOH al 70% 7. Acetona al 70% 14

15 Obtención de extractos limpios por SPE Metodología Acondicionamiento Fracción Acuosa Fracción MeOH/H 2 O 15 Lavado MeOH

16 Cuantificación de fenoles totales por el método de Folin Ciocalteu Metodología OH Reactivo de Folin-Ciocalteu W 6+, Mo 6+ R O R Reactivo de Folin-Ciocalteu reducido W 5+, Mo 5+ 16

17 Cuantificación de flavonoides totales Metodología OH HO 6 7 A O C ' 1' OH B 6' 5' 3' 4' OH + NaNO 2 Oxidación R O B O + HNO 2 OH Catequina R O B O + HNO 2 + AlCl 3 Nitrosilación R O B N O Al 3+ O R O B Al 3+ O + NaOH R O B Al 3+ O N O HN O- Complejo colorido 490 nm 17 Mecanismo de acción del método de tricloruro de aluminio, Cruz-Gallegos et al., 2012.

18 % Inhibición Evaluación de la actividad antioxidante in vitro Metodología Método del DPPH ArOH ph ArO Morado máx = 517 nm Amarillo Calcular el valor de EC AE = 1 EC 50 x T EC EC [antioxidante] ppm 18

19 Correlación de Pearson para determinar la relación entre contenido de fenoles y flavonoides totales Metodología Coeficiente de correlación de Pearson. Valor del Coeficiente de Pearson r = 0 r = 1 Grado de Correlación entre las Variables Ninguna correlación Correlación positiva perfecta 0 < r < 1 Correlación positiva r = -1 Correlación negativa perfecta -1 < r < 0 Correlación negativa 19

20 3. RESULTADOS

RESULTADOS Humedad y molienda Réplica Masa

hoja seca (%) 1 0.99 62.73 7.34 2 1.00 65.

21 RESULTADOS Humedad y molienda Réplica Masa inicial (g) Humedad hoja fresca (%) Humedad hoja seca (%) Promedio 1.00 ± ± ± 0.89 Remoción de humedad = 87 % Rendimiento de molienda = % 21

mg EAG/100 g ms Fenoles totales extractos crudos Resultados 800 767.04 ± 0.01 700 618.62 ± 0.01 610.81 ± 0.01 600 509.91 ± 0.01 492.

22 mg EAG/100 g ms Fenoles totales extractos crudos Resultados ± ± ± ± ± ± ± DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US Extracto 22 ms = muestra seca

$02 187.18 ± 0.01 100 0 DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US Extracto 23 Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE.$

23 mg EAG/100 g ms Fenoles totales extractos por SPE Resultados ± ± ± ± ± ± ± DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US Extracto 23 Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE. ms = muestra seca.

$01 372.45 ± 0.02 Extracto crudo Extracto limpio 200 100 0 Extracto Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE. ms = muestra seca. Para J.$

24 mg EAG/100 g ms Contenido de fenoles totales de extractos crudos y extractos limpios de las hojas de J. spicigera Resultados mg EAG/100 g ms Extracto crudo Extracto limpio DEC-MH ± ± 0.01 DEC-MS ± ± 0.02 INF-MS ± ± 0.02 H2O-US ± ± 0.01 MeOH-US ± ± 0.02 EtOH-US ± ± 0.01 ACT-US ± ± 0.02 Extracto crudo Extracto limpio Extracto Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE. ms = muestra seca. Para J. gendarussa el contenido de fenoles va de a mg EAG/100 g ms. 24

25 mg EGA/100 g ms Efecto del disolvente en extractos del género Justicia Resultados Maceración de tallo de J. gendarussa Extracción asistida por ultrasonido de J. spicigera H2O MeOH EtOH 70% ACT 70% Disolvente ms = muestra seca 25

mg EC/100 g ms Cuantificación de flavonoides totales en equivalentes de catequina Resultados 400 350 300 250 200 150 100 405 nm 490 nm 515 nm 50 0 DEC-MH DEC-MS

$01 515 129.4 ± 0.01 46.5 ± 0.01 86.75 ± 0.01 58.01 ± 0.01 93.35 ± 0.01 118.00 ± 0.01 109.25 ± 0.01 Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE.$

26 mg EC/100 g ms Cuantificación de flavonoides totales en equivalentes de catequina Resultados nm 490 nm 515 nm 50 0 DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US λ (nm) Extracto limpio DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE. ms = muestra seca. 26

Cuantificación de flavonoides totales en equivalentes de quercetina mg EQ/100m g ms Resultados 700 600 500 400 300 200 100 0 Absorbancia @ λ (nm) DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US

27 Cuantificación de flavonoides totales en equivalentes de quercetina mg EQ/100m g ms Resultados λ (nm) DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US Extracto limpio 405 nm 490 nm 515 nm DEC-MH DEC-MS INF-MS H2O-US MeOH-US EtOH-US ACT-US ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 Extracto limpio = Suma de fracciones obtenidas a partir de SPE. ms = muestra seca. Para J. gendarussa el contenido de flavonoides se encuentra de a mg EQ/100 g ms. 27

28 Correlación de Pearson para fenoles totales vs flavonoides totales en extractos limpios Resultados λ Correlación Fenoles /Flavonoides (nm) (mg EAG*100 g -1 )/(mg EQ*100 g -1 ) (mg EAG*100 g -1 )/(mg EC*100 g -1 ) EAG Equivalentes de ácido gálico. EQ Equivalentes de quercetina. EC Equivalentes de catequina. 28

$IC 50 (ppm) Actividad antirradicalar de las diferentes fracciones obtenidas por SPE frente al DPPH Resultados 4000 3500$ 404 INF1 9370 ± 503.596 INF2 2567 ± 86.215 H2O US1 3869 ± 113.757 H2O US2 1571 ± 70.76 MEOH1 1195 ± 21.882 MEOH2 12812 ± 88.

404 INF1 9370 ± 503.596 INF2 2567 ± 86.215 H2O US1 3869 ± 113.757 H2O US2 1571 ± 70.76 MEOH1 1195 ± 21.882 MEOH2 12812 ± 88.

29 IC 50 (ppm) Actividad antirradicalar de las diferentes fracciones obtenidas por SPE frente al DPPH Resultados EXTRACTO EC 50 (ppm) EFD1 415 ± EFD ± DEC ± DEC ± INF ± INF ± H2O US ± H2O US ± MEOH ± MEOH ± ETOH ± ETOH ± ACET ± ACET ± Fracciones de la SPE de extractos obtenidos 29

30 % DPPH Remanente Ejemplo de una curva de cinética de extractos de J. spicigera Resultados Extracto de etanol al 70% (ETOH1) ppm 1250 ppm 1818 ppm 3333 ppm Tiempo (min) T EC50 = 18 min 30

31 Tiempo de reacción (T EC50 ) y eficiencia antirradicalar (AE) de los extractos de J. spicigera Resultados Extracto EC 50 T EC50 (Kg m s/kg DPPH ) (min) (Kg DPPH / Kg m s *min) EFD EFD DEC DEC INF INF H 2 O US H 2 O US MEOH MEOH ETOH AE AE = 1 EC 50 x T EC50 ETOH ACET ACET

32 4. CONCLUSIÓN

33 CONCLUSIONES Las hojas de J. spicigera poseen un contenido alto de fenoles y flavonoides totales, ± 0.01 mg EAG/100 g ms y ± 0.01 mg EC/100 g ms respectivamente. El extracto que presentó un contenido alto de fenoles y flavonoides totales fue el de etanol al 70%, con ± 0.01 mg EAG/100 g ms y ± 0.01 mg EC/100 g ms respectivamente. De acuerdo a la actividad antioxidante el extracto de etanol al 70%, presentó un EC 50 de 1115 ± 3.43 ppm. Actividad antioxidante, los extractos actúan rápido T EC50. 33

34 TRABAJO ACTUAL

35 Purificación y aislamiento de compuestos fenólicos mayoritarios del extracto de etanol al 70%. Actividad antidiabética. 35

36 Gracias por su Atención

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