biosalud Manizales (Colombia) Vol. 12 No p. julio - diciembre 2013 ISSN

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1 biosalud Manizales (Colombia) Vol. 12 No p. julio - diciembre 2013 ISSN

2 Revista Biosalud ISSN Fundada en 2002 Nueva Periodicidad Semestral Tiraje 300 ejemplares Volumen 12, No. 2, 148 p. julio - diciembre, 2013 Manizales - Colombia. Rector Universidad de Caldas Ricardo Gómez Giraldo Vicerrectora Académica Luz Amalia Rios Vásquez Vicerrector de Investigaciones y Postgrados Carlos Emilio García Duque Vicerrector Administrativo Fabio Hernando Arias Orozco Vicerrectora de Proyección Fanny Osorio Giraldo REVISTA BIOSALUD Es una publicación de carácter científico del Grupo de Investigación BIOSALUD, adscrito al Departamento de Ciencias Básicas de la Salud de la Facultad de Ciencias para la Salud. Su misión es la publicación de artículos originales producto de proyectos de investigación, artículos de reflexión, de revisión y reportes de caso sobre diversos temas de salud humana tanto en ciencias básicas como clínicas. La revista va dirigida a la comunidad científica nacional e internacional que investiga sobre los temas antes relacionados, a los profesionales y estudiantes de pre y postgrado en diferentes áreas de la salud humana. Indexada en: Latin American and Caribbean Health Science-LILACS, Índice Nacional de Publicaciones Seriadas Científicas y Tecnológicas Colombianas (Publindex-Categoría B). Comité técnico: Juan David Giraldo Márquez Coordinador comité técnico Gerardo Quintero Corrector de estilo Silvia L. Spaggiari Traductora Juan David López González Diagramación Carlos Eduardo Tavera Pinzón Soporte Tecnológico Acceso en Línea: Ventas, Suscripciones y Canjes: Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados Universidad de Caldas - Sede Central Calle 65 No Apartado Aéreo: 275 Teléfono: (+6) ext labmicro@ucaldas.edu.co revistascientificas@ucaldas.edu.co Manizales - Colombia Editado por: Universidad de Caldas Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados Director Jorge Enrique Pérez Cárdenas, Bacteriólogo MSc. Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. COMITÉ EDITORIAL Luís Fernando Uribe Vásquez, Médico Veterinario y Zootecnista PhD. Departamento de Salud Animal. Universidad de Caldas. Rogelio Ocampo Cardona, Licenciado en Biología y Química, PhD. Departamento de Química. Universidad de Caldas. Juan Carlos Sepúlveda Arias, Médico, PhD. Facultad de Medicina. Universidad Tecnológica de Pereira. Fernando Delgado Blandón, Licenciado en Biología y Química, PhD. Universidad Católica de Manizales. Pablo Moreno Acosta, Microbiólogo, PhD, Instituto Nacional de cancerología. Gustavo Isaza Mejía, Miembro de la sala especializada de medicamentos y productos biológicos-comisión revisora. Instituto nacional de vigilancia de medicamento y alimentos (invima)-colombia Marylin Eliseyev Hidalgo Diaz, Bacteriologa, PhD, Pontificia Universidad Javeriana, sede Bogotá. Piedad Matilde Agudelo Flórez, Biologa, PhD, Investigadora Instituto Colombino de Medicina Tropical, Universidad CES. COMITÉ INTERNACIONAL Mario Herrera-Marschitz MD, PhD Department of Physiology and Pharmacology. Karolinska Institute. Stockholm, Sweden. Gustavo Valbuena, Médico, PhD, Director Masters in Medical Science program, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, Sealy Center for Vaccine Development University of Texas Medical Brancha. Alejandro Vélez H.MD. Patólogo, Hospital Pablo Tobón Uribe, Medellín. Dr. Sócrates Herrera, Médico, Director del Centro Internacional de Vacunas, Centro de Investigaciones Científicas Caucaseco. Josep Balart Serra MD, Ph.D. Jefe Laboratorio de Radiobiologia Aplicada Laboratorio de Investigacion Translacional (IDIBELL) Instituto Catalan de Oncologia La responsabilidad de lo expresado en cada artículo es exclusiva del autor y no expresa ni compromete la posición de la revista. El contenido de esta publicación puede reproducirse citando la fuente.

3 TABLA DE CONTENIDO EDITORIAL Las publicaciones científicas en Colombia, su origen y su futuro según el nuevo modelo de medición de Publindex Jorge Enrique Pérez Cárdenas 5 ARTÍCULOS ORIGINALES Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo Pruebas de toxicidad aguda CL (I) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales a la bahía de Cartagena, Colombia Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Pruebas de toxicidad aguda CL (I) 50 en camarones marinos (Litopenaeus schmitti y L. vannamei) utilizando efluentes industriales a la bahía de Cartagena, Colombia María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León Comparación de dos métodos para la determinación de los niveles de colesterol HDL en caninos José Henry Osorio, Yirly Johanna Suárez, Jorge Enrique Pérez Brucelosis en hembras caninas en Montería (Colombia): un problema para la salud pública Juan Carlos Ballut, Alfonso Calderón, Virginia Rodríguez ARTÍCULOS DE REVISIÓN Actualización en el metabolismo de las hormonas tiroideas y su relación con la reproducción en el cerdo José Henry Osorio, Jazmín Vinasco Rodríguez, Paola Andrea Bedoya Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero Implicaciones metabólicas y clínicas de algunas drogas de diseño José Henry Osorio CASO CLÍNICO La ayuda diagnóstica es importante: caso de Hepatozoon spp. Clemencia Correa Restrepo 121 AUTORES NORMAS EDITORIALES biosalud Manizales (Colombia) Vol. 12 No p. julio - diciembre 2013 ISSN

4 TABLE OF CONTENTS EDITORIAL Scientific publications in Colombia, their origin and their future according to the new Publindex measurement model Jorge Enrique Pérez Cárdenas 5 ORIGINAL ARTICLES AZF region microdeletion of chromosome Y and infertility Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo Acute toxicity tests CL (I) 50 in estuarine fish (Gambusia affinis) using industrial effluents to the bay of Cartagena, Colombia Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Acute toxicity tests CL (I) 50 in marine shrimp (Litopenaeus schmitti and L. vannamei) using industrial effluents in the bay of Cartagena, Colombia María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León Comparison of two methods for determining HDL cholesterol levels in canines José Henry Osorio, Yirly Johanna Suárez, Jorge Enrique Pérez Brucelosis in female dogs in Monteria (Colombia): a public health problem Juan Carlos Ballut, Alfonso Calderón, Virginia Rodríguez REVISION ARTICLES Update on the thyroid hormones metabolism and its relationship with boar reproduction José Henry Osorio, Jazmín Vinasco Rodríguez, Paola Andrea Bedoya Aflatoxins: incidence, impact on health, control and prevention María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero Metabolic and clinical implications of some designed drugs José Henry Osorio CASE REPORT The diagnostic aid is important: a case of Hepatozoon spp. Clemencia Correa Restrepo 121 AUTHORS AUTHOR GUIDELINES biosalud Manizales (Colombia) Vol. 12 No p. July - December 2013 ISSN

5 Como citar este artículo: Pérez JE. Las publicaciones científicas en Colombia, su origen y su futuro según el nuevo modelo de medición de Publindex [editorial]. Biosalud. 2013;12(2):5-6. EDITORIAL LAS PUBLICACIONES CIENTÍFICAS EN COLOMBIA, SU ORIGEN Y SU FUTURO SEGÚN EL NUEVO MODELO DE MEDICIÓN DE PUBLINDEX Colombia desde finales del siglo pasado ha ido preocupándose continuamente por los aspectos de la producción científica, y en especial por aquella producto de la investigación que conduzca al estudio de los diferentes problemas relacionados con el entorno nacional y regional. Con el análisis realizado por la comunidad académica en esa época al potencial investigativo del país, Colciencias fue implementando políticas para fomentar la investigación, siendo las uuniversidades las llamadas a darle un fuerte impulso a la investigación científica en Colombia. Así, el Ministerio de Educación introdujo cambios en las políticas salariales de los docentes de las universidades públicas colombianas, en las cuales la producción intelectual e investigativa de sus docentes se empezó a valorar con puntos salariales o de bonificación, a partir de la promulgación del Ddecreto 1279 del año Debido a que este decreto otorga puntos salariales de acuerdo con la clasificación de la revista científica en la que se hace la publicación, Colciencias creóo el Sistema Nacional de Indexación y Homologación de Revistas Especializadas de Ciencia, Tecnología e Innovación, conocido con el nombre de Publindex. Esta sección de Colciencias, se ha encargado de normatizar los parámetros de indexación de las revistas científicas publicadas por diferentes iinstituciones de educación superior en Colombia. El Ddecreto 1279 logró uno de los objetivos relacionados con las políticas de implementación y mejoramiento de la investigación y la producción académica de los docentes de las instituciones de educación superior de Colombia, que fue el incremento efectivo del número de publicaciones científicas, así como también el incremento del número de investigaciones realizadas en Colombia. De esta manera, pasamos de tener 120 revistas científicas en el año 2002 a tener 577 en el año 2011.; Llo que representa un incremento del 480% de las publicaciones científicas en Colombia en los últimos 10 años. Del total de revistas reconocidas por el sistema 466 están clasificadas, 47% en las categorías A1, A2 y B, y el 53% en C. Debido posiblemente a la proliferación de publicaciones científicas, al bajo factor de impacto y a su visibilidad a nivel nacional, así como también a la endogamia de las publicaciones y a la ausencia de contribuciones internacionales, se ha ido gestando en Publindex un cambio a mi parecer radical en el sistema de indexación de las revistas científicas en Colombia. Los nuevos parámetros de clasificación al parecer surtirán efecto a partir del año Este cambio tiene como finalidad mejorar la calidad y conseguir la visibilidad internacional de la producción científica colombiana. Las revistas científicas colombianas deben alcanzar la calidad que les permita su inclusión en las bases de datos más reconocidas en el mundo y así lograr su visibilización internacional, y en consecuencia la valoración de la calidad científica de los artículos publicados de acuerdo con el número de veces que son citados dichos artículos por otros investigadores para producir más ciencia. Estos cambios en el sistema de indexación obviamente traerán cosas buenas para el país., Nnuestros investigadores se verán obligados a publicar en revistas que tengan alto factor de impacto, lo 5

6 cual implica altísima calidad de las investigaciones realizadas, investigar sobre problemas de interés regional y nacional, pero con impacto mundial, y también, escribir nuestra producción en inglés que es el idioma de la ciencia, ya que la mayoría de las revistas científicas de alto factor de impacto están publicadas en dicho idioma. Pero entonces, qué va a pasar con nuestras publicaciones?, Pposiblemente la mayoría de ellas van a desaparecer por las siguientes razones: mantener la periodicidad no será fácil, ya que uno de los parámetros para el mejoramiento de la indexación es la exogamia. Actualmente, muchas de las revistas científicas colombianas se caracterizan por la endogamia institucional.; Eel nuevo sistema de clasificación de revistas científicas solo permitirá que máximo tres del mínimo de 15 artículos anuales publicados podrán ser de autores pertenecientes a la entidad editora. Así las cosas, el número de artículos que llegarán por año a los editores será bajo y posiblemente no permitirá mantener la periodicidad declarada por las revistas. Por otro lado, es posible que los investigadores colombianos busquen alternativas de publicación por fuera de sus instituciones, y de esta manera se incremente el número de solicitudes de publicación por parte de investigadores externos a la institución editora de la revista. Otro factor importante que incidirá en la clasificación de las revistas científicas colombianas, es la aceptación en las bases de datos internacionales, que son financiadas por empresas del conocimiento con ánimo de lucro. Esto implica que la inclusión de la publicación científica en las bases de datos demande una erogación económica importante, dinero que en las circunstancias actuales deberá salir de la institución editora o alternativamente del cobro de la publicación. La última alternativa será un factor adicional que desestimulará la publicación de artículos, ya que no todo el que publica tendrá la posibilidad o el deseo de pagar por la publicación de su artículo a menos que esto le represente una tasa de retorno que permita la recuperación de la inversión, lo que en el Ddecreto 1279 está asociado con la clasificación de la revista. Un último factor que incidirá negativamente es la necesidad de publicar en inglés las revistas científicas colombianas. Esto implicará la necesidad de tener dos alternativas en el equipo editorial de las revistas.; Lla primera sería recibir única y exclusivamente artículos en inglés, lo cual requeriría además tener un experto en gramática inglesa y experto en el tema asociado, para que revise exhaustivamente los artículos y conceptúe sobre su calidad gramatical. La segunda alternativa sería que dentro del grupo editorial se realice la traducción lo cual requiere de personas con un amplio dominio de la lengua inglesa, pero que además sepan del tema. Ambas alternativas implicarán el aumento del presupuesto necesario para la publicación de las revistas. Los cambios en los parámetros de clasificación de las revistas científicas en Colombia, traerán nuevos retos para la comunidad científica colombiana y para las revistas científicas. La capacidad para superar estos nuevos retos hará que Colombia alcance un mejor nivel iinternacional en cuanto a su producción científica, pero además servirá para decantar poco a poco el número de publicaciones con base en su calidad científica, armonizándolas con el contexto internacional de medición. JORGE ENRIQUE PÉREZ CÁRDENAS Profesor Titular. Departamento de Ciencias Básicas Facultad de Ciencias para la Salud Universidad de Caldas 6

7 ARTÍCULOS ORIGINALES

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9 Como citar este artículo: González G, Silvera C, Vásquez JF. Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad. Biosalud. 2013;12(2):9-23. MICRODELECIONES DE REGIONES AZF DEL CROMOSOMA Y E INFERTILIDAD Gisela Gonzalez Ruiz 1 Carlos Silvera Arredondo 2 Jesús Fernando Vasquez Rengifo 3 RESUMEN Objetivo: estudio realizado durante los años 2009 y 2010 en las ciudades de Barranquilla y Sincelejo, tuvo como fin determinar las microdeleciones de regiones AZF, del cromosoma Y, en hombres infértiles, Materiales y Métodos: estudio realizado con una muestra de 33 hombres, seleccionados de las consultas especializadas; previa confirmación de infertilidad mediante estudios de espermogramas. Se analizaron 17 STSs, de las diferentes regiones de azoospermia, además del gen SRY el DS271 y Kaly. Para el análisis se efectúo extracción de ADN de sangre periférica, mediante el protocolo de Bio-. mol, PCR multiplex máster mix de promega y corrido electroforético en gel de agarosa al 4%, se visualizaron las imágenes a través de foto documentador. Resultados: los hallazgos arrojaron un 3,03% de microdeleciones del cromosoma Y en los STSs: SY242, (DAZ) SY208 (DAZ), SY254 (DAZ), SY255 (DAZ) y SY157 (DYS240), comprometiendo toda la región AZFc para los STSs estudiados. Conclusiones: Se determinó microdeleción de la región AZFc, del cromosoma Y en una proporción de 3.03%, con evidente ausencia de los genes de controles internos, se presentan las bandas estudiadas para los juegos de iniciadores máster D y E confirmando la reproducibilidad del producto obtenido por PCR. Paciente con presencia de locus SRY, antecedentes de azoospermia secretora, varicocele izquierdo, órganos sexuales normales, biopsia testicular con 80% de ausencia de células germinales y 20% sin maduración. La proporción de casos se ubica en el intervalo encontrada en diversos estudios a nivel mundial. Palabras clave: Microdeleción, cromosoma Y, Azoospermia, oligozoospermia, gen DAZ (Fuente: DeCS, BIREME). AZF REGION MICRODELETION OF CHROMOSOME Y AND INFERTILITY ABSTRACT Objective: Study carried out between the years 2009 and 2010 in the cities of Barranquilla and Sincelejo that has as main objective to determine the microdeletions in the DAZ region of the Y chromosome in infertile men. Materials and Methods: study was developed with a sample of 33 men, selected in specialized consultation, previous confirmation of infertility through spermograms studies. Seventeen STSs were analyzed from different azoospermia regions in addition to the SRY, the DS271 and the Kaly gene. DNA extraction from peripheral blood through Bio-mol protocol, PCR multiplex master 1 Enfermera, Magíster en Ciencias Básicas Biomédicas, Coordinadora investigaciones del programa de Enfermería, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Santa Marta, Colombia,troncal de occidente, sector mamatoco. Correo electrónico: Gisela.gonzalezr@campusucc.edu.co, Gisela.1060@gmail.com.Teléfono: Médico MsC en genética, coordinador del grupo de investigación en genética. Universidad del norte de Barranquilla:correo electrónico: csilvera@uninorte.edu.co. 3 Médico, MsC, PhD en genética, coordinador grupo investigación en salud sexual y reproductiva, División salud, Universidad del Norte, Barranquilla. Correo electrónico: fvasquez@uninorte.edu.co. Teléfono ISSN Recibido: agosto 2 de Aceptado: septiembre 28 de 2013 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs. 9-23

10 Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo mix of Promega and electrophoresis in agarose gel 4% was performed for data analysis and the images were visualized through photodocumenter. Results: Findings showed 3.03% microdeletions in Y chromosome in STSs: SY242 (DAZ) SY208 (DAZ), SY254 (DAZ), SY255 (DAZ) and SY157 (DYS240), compromising the whole AZFc region in the STSs studied. Conclusions: was determined microdeletion of AZFc region of Y chromosome in a proportion of 3.03%, with evident absence in the genes of the internal control, the bands studied for the set of the master indicators D and E are presented, confirming reproducibility of the product obtained through PCR. Patients with presence of locus SRY, secretory azoospermia, left varicocele, normal sexual organs, testicular biopsy with absence 80% of germ cells and 20% without maturation. The proportion of cases located in the range found in various studies globally. Key words: Microdelection, Y chromosome, azoospermia, oligozoospermia and DAZ gene(fuente: DeCS, BIREME). INTRODUCCIÓN La infertilidad, definida por la organización mundial de la salud como: La incapacidad de completar un embarazo después de un tiempo razonable de relaciones sexuales, sin medidas anticonceptivas 1, se presenta en 60 a 80 millones de parejas 2 y el 50% de los casos aproximadamente está asociada a factores masculinos 3. Esta investigación amplia nuevos horizontes en el conocimiento de la infertilidad originada por microdeleciones del cromosoma Y; teniendo en cuenta que la afección se presenta en el 10% 15% de las parejas 4. Actualmente múltiples estudios han avanzado en análisis de las causas de infertilidad masculina 4, 5. Los factores genéticos aportan el 5% (Teppa, 2004), se manifiestan fenotípicamente con mala calidad seminal 6 y en algunos casos por azoospermia no obstructiva y oligozoospermia severa, comprobadas a través de pruebas de semen y biopsias testiculares. Las piedras angulares de la investigación andrológica continúa siendo la historia clínica, el examen físico y el espermograma, la evaluación endocrina se realiza en todos los hombres con parámetros seminales anormales o con alteraciones clínicas de baja androgenización, si se presenta un hipogonadismo hipergonadotrópico es conveniente realizar un cariotipo. 7 Específicamente el Cromosoma Y sufrió degradación de su contenido génico, quizá como consecuencia de mantener los genes específicos de diferenciación masculina RBM, contiene unos 60 millones de pares de bases y sus genes determinan la espermatogénesis 8 ; se estructura por las zona eucromatínica (Yp) y la zona heterocromatínica (Yq) que no recombina durante la miosis y donde se ubican las regiones de azoospermia AZF: Está divida en cuatro subregiones AZFa, AZFb, Proximal AZFc/AZFd y AZFc 9 la deleción de una subregión puede originar alteraciones como azoospermia no obstructiva u oligozoosperma severa 9 La primera evidencia de un gen presente en el cromosoma Y con significado clínico, se originó en la observación hecha en individuos con variantes en el cariotipo que incluyen al cromosoma Y (46,XY, 47,XXY, 47,XYY), que expresan fenotipo de varón, mientras que los individuos con variantes del cariotipo sin cromosoma Y (46,XX; 45,X; 47,XXX) poseen fenotipo femenino. La deleción de las región de azoospermia (AZF a, b, c y d o proximal AZFb/ AZFc) 10 origina las alteraciones 9 y su origen es actualmente un tema de discusión, puede surgir en etapas meióticas, en fases posteriores a la formación espermática o después de la fertilización. La deleción del AZFb fue confirmada usando PCR y pruebas de sourthern blotting 11, confirmando la su presencia en tres generaciones. Estudio de Kats M.G et, al. 2002, Kamischke A, 1999, mostraron la transmisión de la alteración de padres a hijos después de 10 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, 2013 págs ISSN

11 Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad efectuar ICSI 12. La frecuencia de deleción del cromosoma Y, reportadas a nivel mundial es la siguiente: Alemania 3,2% (12/370), 1,3% (19/1470), Suecia 2% (4/192), Países bajos y Bélgica 2,3% (37/1627), Irlanda 3,6% (2/56) y Eslovenia 4,4% (9/226) entre otros (31). 13 Los primeros en identificar la relación existente entre la alteración y la infertilidad masculina, fueron Tiepolo y Zuffardy en 1976, quienes investigaron a 1160 hombres infértiles detectando deleción en el 0.5% de ellos. La deleción de genes en cualquiera de las regiones AZF puede conducir a anormalidades en la espermatogénesis 14, con subsecuente alteración en la calidad y/o cantidad de espermatozoides, provocando azoospermia u oligozoospermia, 16. Sin embargo; se identificó una zona que al parecer se encuentra en límites de AZFb AZFc, denominada AZFd o proximal AZFb/AZFc. Actualmente se ha avanzado en el mapeo del cromosoma Y lo que ha permitido identificar el tamaño y localización de las regiones AZF 17, identificando los genes que conforman las regiones de azoospermia 18. Otro avance logró el mapeo completo del 99% del cromosoma y la secuencia de la región especifica masculina del cromosoma (MSY) describiendo tres regiones: Región X-Tranposed, Región X-Degenerate y región ampliconic 19 ; todos los genes de esta región se expresan en tejido testicular y solo el VCY y el RBMX poseen homólogos en el cromosoma X. El gen HSFY ubicado en AZFb genera tres tipos de transcripciones diferentes, la primera parece transcribirse en varios tejidos, sin embargo la segunda y la tercera son testículo específicos 20. Las deleciones de AZFa se asocian al síndrome de Solo Células de Sertoli (SCO) 21 los genes DBY y USP9Y al parecer regulan la actividad de las espermatogonias 22, las deleciones completas del AZFa se presentan en el 9% de los casos, aproximadamente 23. Mientras que en el bloqueo de la maduración detenida en fase de paquiteno está implicada la región AZFb y la región AZFd, que al parecer se asocian con oligozoospermia o esperma normal en número pero con anormalidades morfológicas 13, se han identificado tres familias de genes en AZFb (RBM, PRY y TTY) 24. La mayoría de microdeleciones presentes en el AZFc afectan al gen DAZ, convirtiéndose en el principal candidato causante de azoospermia en pacientes infértiles; un estudio del gen DAZ copia especifico se relaciona con oligozoospermia severa y azoospermia no obstructiva, en pacientes con patologías testiculares, demostrando que DAZ/1 y DAZ/2, se asocian con la alteración; de igual forma el fenotipo de testiculopatías severas idiopáticas se da por la falta de expresión del gen DAZ a nivel de estos órganos 25. El número de genes DAZ ha sido difícil de determinar pues sus secuencias de nucleótidos son idénticas, cada uno contiene por lo menos siete copias en tanden 26. Los diferentes grados de hipoespermatogénesis observados en hombres con deleciones AZF d y c (DAZ), puede ser atribuible al grado de compensación parcial de la deleción por la presencia de un gen funcional homólogo autosómico presente en el cromosoma El modelo más aproximado para la identificación de las deleciones en diversas regiones (AZF a, b y c), fue publicado en un estudio que encuentra 3 de 11 hombres con STSs, sy105, sy149, pero econ ausencia de los STS sy117, sy127 y sy La deleción de la región AZFa se asocia con Síndrome de solo células de sertoli, azoospermia no obstructiva e hipoespermatogénesis severa; las deleciones de la región AZFb con azoospermia no obstructiva, bloqueo espermatogénico meiótico e hipoespermatogénesis; de la región AZFc con azoospermia no obstructiva, oligospermia severa, hipoespermatogénesis, síndrome de solo células de sertoli y en menor proporción, bloqueo espermatogónico meiótico; las deleciones de AZF a+b, AZF b+c, AZF a+b+c se asocian con azoospermia no obstructiva y síndrome de solo células de sertoli (SCO) 29. Los genes de AZFb están implicados en la regulación meiótica, los de AZFa en el proceso de 11

12 Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo diferenciación celular premeiótica y fase mitótica de la espermatogénesis; mientras que hombres con microdeleciones AZFb-c ó AZFa+b+c, presentan daño espermatogónico severo, yendo desde SCO hasta bloqueo espermatogónico completo 30. En las deleciones AZFc B2/B4 existe la posibilidad de contener espermatozoides en el líquido seminal, lo que mejora el pronóstico reproductivo de estos pacientes 31. La azoospermia ha sido comprobada en estudios en hombres previamente diagnosticados con microdeleción AZF, a, b y b-c, sin embargo las deleciones AZFc, que pueden mostrar presencia de espermatozoides 32. Un estudio efectuado en 46 pacientes con infertilidad masculina idiopática, 30 azoospérmicos y 16 oligozoospérmicos analizan 18 STSs, localizados en Yq (AZFa, b, c y d), cariotipo analizado con la técnica de bandeo G, comprobando microdeleciones en 3 casos en las regiones AZF a, b y c respectivamente 33. Uno de los investigadores que más ha profundizado en estudios de microdeleciones es Carlo Foresta de la Universidad de Padova Italia, quien caracterizó clínica y molecular las deleciones del cromosoma Y en hombres infértiles durante ( ), identificando 99 casos con microdeleciones, contribuyeron al resultado 3,2% hombres no seleccionados, 8.3% con azoospermia no obstructiva y 5,5% con oligozoospermia severa (menos de 5 millones de espermatozoides por ml), 31 Otras patologías testiculares se han estudiado, sin que se hayan identificado asociación con microdeleción del cromosoma Y. Sin embargo, la criptorquidia parece estar relacionadas con deleciones AZF 34. Los ensayos de PCR han sido utilizados para descartar microdeleciones, se estandarizó la prueba para la amplificación de 16 marcadores en hombres fértiles; se han propuestos nuevos métodos para la identificación molecular de deleciones del cromosoma Y con técnicas de bajo costo y adecuada efectividad 35. Las técnicas de hibridación de PCR, para analizar los AZF a y b fueron utilizadas en 76 pacientes que presentaron deleción del Yq usando 18 STS y dos pruebas de DNA 36. Los pacientes con azoospermia pueden recurrir a técnicas de reproducción asistida a través de donantes, mientras, que en casos con oligozoospermia severa pueden recuperarse espermatozoides para técnicas de reproducción asistida, inseminación artificial e ICSI. 37 ofreciendo una nueva oportunidad de reproducción a través del uso de la crío conservación de esperma 38 MATERIALES Y MÉTODOS Estudio descriptivo de corte transversal que buscó determinar la prevalencia y tipos de microdeleciones del cromosoma Y en hombres infértiles en una muestra de 33 hombres con diagnóstico previo de infertilidad, muestra seleccionada no probabilísticamente y atendidos en los Centros de atención de fertilidad y consultorios urológicos de las ciudades de Barranquilla y Sincelejo, previo consentimiento informado respetando los criterios éticos establecidos en la resolución de 1993 y que cumplieran con criterios de selección como: Azoospermia no obstructiva y oligozoospermia (menos de 12 mill/ml), que no presentaran patologías comprobadas como causa primaria de infertilidad. Los métodos utilizados fueron realizados en dos oportunidades buscando con ello corroborar fidelidad en los hallazgos: Extracción de muestra de sangre periférica: 5 ml colectados en tubo con EDTA Extracción de DNA, mediante protocolo de aislamiento de ADN en sangre del laboratorio Mo-Bio, realizado en cabina de flujo laminar para preservar la integridad y limpieza del producto. A 330 µl de sangre, se le agregó 900 µl de solución de cloruro de amonio, se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó por 15 segundos a revoluciones por minuto, luego de descartar el sobrenadante, se resuspendió en vórtex durante 5 segundos, al pellet obtenido se le agregaron 300 µl de 12 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, 2013 págs ISSN

13 Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad detergente, para luego adicionar 1.5 µl de RNase, se agregó100 µl de acetato de amonio, una vez precipitadas las proteínas, se mezcló durante 15 seg, se centrifugó durante 3 minutos a rpm, luego de transferir el sobrenadante a otro tubo (conteniendo el ADN), se agregó 300µl de isopropanol, homogenizada la solución, se centrifugó para luego descartar el sobrenadante y obtener las moléculas de ADN, las que se sometieron a lavado con 300 µl de etanol, se centrifugó durante 30 segundos a rpm, se descartó el sobrenadante, por último se adicionó la solución tris para separar las moléculas de ADN, producto final que fue incubado a 65ºC, durante 40 minutos. Cuantificación de ADN: se utilizó espectrofotómetro modelo Biomate 3, marca thermoelectrón como cuantificador de ADN, se procedió a obtener la cantidad necesaria para llevar a cabo los procedimientos de PCR, cuantificación realizada en dos oportunidades respondiendo al procedimiento de nueva extracción de ADN. PCR MULTIPLEX: partiendo del protocolo Promega (casa comercial Promega Corporation), que recomienda una cantidad de 10ng/µl de ADN diluido en agua, hasta lograr una dilución de 5 µl por reacción, o sea, un total de 25 µl, de tal forma que pueda luego, dividirse para las cinco reacciones, la cantidad de dilución de ADN, se pasó a la preparación de las diluciones de reactivos o juegos de iniciadores para las PCR múltiplex (A, B, C, D, y E, con20 µl de máster y 0,2 µl de Taq polimerasa por muestra) o sea, siete tubos en total incluyendo control positivo y control negativo; se agregó la cantidad resultante a cada tubo que contenía la dilución de ADN, luego se procedió a procesar en el termociclador, Icycler, marca Bio-Rad, previa configuración del programa para microdeleciones del cromosoma Y; por último, se procedió a procesar las muestras en el equipo, para obtener los STSs (sequence target sites) determinadas por el kit así: AZFa: SY8 = DYS273,SY85= DYS148, SY18= KALY; AZFb: SY121= DYS212, SYPR3= SMCY, SY124= DY215, SY127= DYS218, SY128= DYS219, SY130= DYS221, SY133 = DYS223, SY134= DYS224; PROXIMAL AZFc/AZFd: SY14= DYF51s1, SY152=DYS236; AZFC: SY242= DAZ, SY208 = DAZ, SY254 (DAZ), SY255= DAZ, SY157= DYS240. El protocolo del termociclador, fue el siguiente: 94ºC por 2 minutos, 94ºC por un minuto, 57ºC por 30 segundos; 72º C por 5 minutos a 35 ciclos, luego 72ºC por 5 minutos y 4ºC finales, para un total de tiempo de 2,6 horas de amplificación de productos de ADN, que incluye proceso de desnaturalización y extensión final. Corrido electroforético en gel de agarosa: para el corrido electroforético en gel de agarosa se usó gel al 4%, probados los resultados iniciales, se procedió a reducir la concentración al 3,5%; se le adicionó bromuro de ethidio, sustancia que debido a sus propiedades fluorescentes, cuando se expone a la luz ultravioleta permite la visualización de los productos de PCR al intercalarse con las cadenas de ADN; luego se polimerizó en soporte sellado durante 30 minutos, se trasladó a la cámara de corrido electroforético, donde se hizo la siembra de 10ml de muestra de ADN, adicionando a cada una 5 l de tampón de carga como colorante, que hace que la muestra sea fácil de visualizar, se conectaron los electrodos a la fuente de poder y se efectúo el corrido a 80 voltios durante 1, 5 horas. Visualización de bandas génicas: mediante bio documentador, modelo Biodoc-it, marca Bio Rad, se consideró la muestra positiva cuando el producto amplificado, de acuerdo al peso molecular, estuvo presente y negativa cuando el producto esperado estuvo ausente. RESULTADOS Fuente: Diseñadas para el estudio, 2010 Figura 1: Ubicación de las Regiones Azf del Cromosoma Y 13

14 Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo Haciendo uso de los métodos descritos, se llegó a los resultados de los diferentes STSs estudiados para microdeleciones del cromosoma Y, para mayor claridad presentamos la estructura del cromosoma en estudio. Los genes analizados, mediante PCR multiplex, contenidos en cada STSs, por cada Multiplex máster mix A (DAZ, DYS240, DYS271, DYS221, KAL-Y, y control interno SMCX); Multiplex máster mix B (SMCY, DYS218, DAZ2 Y DAZ3, y control interno SMCX); Multiplex máster mix C (DYS219, DYS212, DYF51S1, DAZ4 Y control interno SMCX); Multiplex máster mix D (DYS223, DYS236,DYS215, y control interno SMCX) y Multiplex máster mix E (SRY, DYS224, DYS148, DYS273 y control interno ZFX/ZFY). De acuerdo a conteo espermático, el 54,54% de los casos estudiados presentaron azoospermia y el 45,45% oligozoospermia (menos de 12 millones de espermatozoides por ml). Fuente: Protocolo Promega, sistema de detección deleciones cromosoma Y, versión 2, 2008 Figura Nº 2: Productos de Amplificación PCR Multiplex A, B, C, D, Y E Microdeleción Del Cromosoma Y El producto de PCR Multiplex de los diferentes juegos de iniciadores, A, B, C, D y E, del kit, utilizados para el procesamiento de las muestras de ADN muestran (M) marcador de peso molecular desde 500 a 50 pares de bases; (1) control positivo y (2) control negativo. Los hallazgos del presente estudio revelaron que el 94.97% de los casos analizados fue normal para estudio de microdeleciones del cromosoma Y, en las diferentes regiones AZF a, b, c y proximal AZFc/AZFd, solo el 3,03% resultó con microdeleción de los genes de la familia DAZ y DYS240, significando una deleción para todos los genes estudiados en la región AZFc. A B C D Fuente: Fotografías productos del estudio Figura Nº 3: Producto Amplificación PCR Multiplex de los Casos de Infertilidad Y 33 E 14 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, 2013 págs ISSN

15 Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad En los casos 1 al 30, 32 y 33, se observó presencia de todas las bandas génicas de acuerdo a los STSs estudiados, tanto para máster A, B, C, D y E, ubicándose en la categoría de negativo para microdeleción del cromosoma Y. Fuente: Fotografías productos del estudio Figura Nº 4: Producto de Amplificación PCR Multiplex para el Caso de Infertilidad 31, 2010 Es evidente la ausencia de los genes de la familia DAZ, los STSs ausentes fueron SY254, SY157, SY242, SY208, SY255 y SY152, señalados en los círculos amarillos, mostrando deleción completa de AZFc, todos ellos a partir del máster A, B y C. Con presencia de locus SRY y positividad en los controles internos, confirmando de esa forma la reproducibilidad del producto obtenido por PCR. Se presentan todas las bandas estudiadas para los juegos de iniciadores máster D y E. El caso reportado es un paciente de 100 kgs de peso, 178 cms de estatura, con antecedentes de azoospermia secretora, varicocele izquierdo sometido a procedimiento quirúrgico en el 2004, al examen físico se encuentra órganos sexuales normales, tamaño de pene normal, testículos de buen tamaño, consistencia, ubicación escrotal y epidídimo normal, presencia de vasos deferentes, ausencia de hidrocele, a la biopsia testicular túbulos seminíferos con ausencia 80% de células germinales y 20% sin maduración. 15

16 Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo HETEROCROMATINA PRODUCTO DE PCR Fuente: Fotografías e imágenes diseñadas para el estudio Figura Nº 5: Regiones de Azoospermia Azf del Cromosoma Y; Azfc Delecionado y su comparación con el Producto de PCR Multiplex Máster Mix La figura 5 ilustra los espacios correspondientes a cada región AZF, la deleción completa de los genes de la región AZFc, concordante con los locus, por juego de iniciadores A: DAZ (380 pb) y DYS240 (290 pb), juego de iniciadores B: DAZ (233pb), DAZ (149pb), juego de iniciadores C: DAZ (124 pb) y D DYS236 (125 pb) y su comparación con el producto de PCR multiplex. La posición de las microdeleciones en el mapa del cromosoma Y corresponde secuencialmente a los sitios 16, 17, 18, 19 y 20, lo que confirma la deleción de todos los genes de la región AFZc estudiados. A C B D Fuente: Producto de Foto documentador Figura Nº 6: Producto de PCR multiplex comparativo, entre cuatro casos con presencia de bandas completas y un caso positivo de microdeleción del cromosoma Y 16 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, 2013 págs ISSN

17 Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad Para mayor ilustración se presenta el multiplex máster Mix A B y C, se observa de derecha a izquierda Columna 1: (Marcador de peso molecular) Columna 2: (Control positivo) Columna 3: (control negativo), Columna 4: (caso Nº 29), Columna 5: (Caso Nº 30), columna 6: (Caso Nº 31), columna 7: (caso Nº 32) y columna 8 (caso Nº 33). Se evidencia en cada uno de los máster que en el caso Nº 31 están ausentes: en A (las dos primeras bandas génicas, correspondientes a DAZ 1 y DYS240, de los STS DYS254 y DYS157 respectivamente), en máster B (la tercera y cuarta bandas génicas, correspondiente a DAZ2 y DAZ3 de los STSs SY242 y SY208 respectivamente) y el máster C (la cuarta banda génica correspondiente DYS232 del STS DY152) concluyendo claramente microdeleción, de cinco (5) bandas génicas en el caso 31. Es importante anotar que el caso reportado consultó por infertilidad, presentando azoospermia no obstructiva y la ausencia de cinco STSs sugiere que a mayor pérdida de genes DAZ mayor compromiso de la espermatogénesis, arriesgando el futuro reproductivo del paciente. Además, el paciente presenta varicocele de testículo izquierdo, órganos sexuales normales en tamaño, consistencia, ubicación, y vasos deferentes. A la biopsia testicular túbulos seminíferos con ausencia de células germinales en un 80% y células germinales sin maduración en un 20%. DISCUSIÓN A través de estudios de mapeos del gen SRY del cromosoma Y se descubrió la presencia de varios genes distribuidos en las denominadas regiones de azoospermia. Las deleciones del AZFc, que contiene el gen DAZ es más frecuente observarla en fenotipos relacionados con hipoespermatogénesis que en Síndrome de Solo Células de Sertoli (SCO). Esto sugiere que su deleción no es suficiente para ocasionar la pérdida completa de la espermatogénesis. La pérdida de la región AZFb está relacionada con cambios en el fenotipo testicular, aparentemente, con menor compromiso de la espermatogénesis y la ausencia del gen DFFRY del AZFa se asocia con un compromiso mayor del fenotipo testicular 22 La frecuencia de microdeleción encontrada en el presente estudio fue de 3.03% correspondiente a un caso del total de población analizada. Fernández Salgado en el 2006, presentó la estadística de otros resultados a nivel mundial, reportando una frecuencia de deleciones en: Alemania 3,2% (12/370), 1,3% (19/1470), Suecia 2% (4/192), Países bajos y Bélgica 2,3% (37/1627), Irlanda 3,6% (2/56) y Eslovenia 4,4% (9/226) entre otros (31) 13 Tiepolo y Zuffardy en 1976, al investigar a 1160 hombres infértiles, a los que se realizó cariotipo, logró detectar la deleción de los diferentes AZF, en el 0.5%, de los casos. Las deleciones completas del AZFa fueron presentadas por Kamp C, Hullen K, Fernández S en el 2001, con una prevalencia del 9% aproximadamente 23 Mientras que en 180 pacientes infértiles, afectados con síndrome de solo células de sertoli (SCO) la prevalencia de deleciones fue del 34,5% y 24,7% respectivamente. Las deleciones en AZFc comprometieron al gen DAZ en 17 pacientes de 40 (42,5%). 61,9% de 21 pacientes con hipoespermatogénesis y 21% de 19 con síndrome de solo células de sertoli(sco),las deleciones que involucró al gen RBM fue de 5% y la deleción del Gen DFFRY se presentó en el 12,5% de los 40 pacientes 24. Carlo Foresta en el 2007 identificó 99 casos de infertilidad, de un total de 3073 hombres diagnosticados previamente con infertilidad, 3,2% sin criterios específicos de inclusión, el 8,3% con azoospermia no obstructiva y el 5,5% con oligozoospermia severa 31. Aun moviéndose en los valores estadísticos reportados, las diferencias entre números de casos, puede estar relacionada con factores de diversas índole, tales como tamaño muestral, fenómenos de variabilidad genética, factores ambientales, ocupacionales y biológicos del entorno. Los 17

18 Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo estudios de investigación que aplicaron criterios precisos de inclusión de pacientes (azoospermicos, oligozoospermicos), muestran mayor prevalencia de alteraciones relacionadas con microdeleción del cromosoma Y. La deleción de la región AZFc, del caso positivo para microdeleción en el presente estudio, corresponde a los STSs, SY254, SY157, SY242, SY208, SY255 y SY152, para una deleción completa del AZFc resultado compatible con otros estudios, donde se encontró compromiso de genes de la familia DAZ, como es el caso de Tessari A, 2004 quien encuentra deleciones de los genes RBM y DFFRY, y genes de la familia DAZ; 23. Al analizar 39 pacientes con síndrome de solo células de sertoli (SCO), de igual forma el fenotipo de testiculopatías severas idiopáticas, fue relacionado con ausencia de expresión del gen DAZ 25, mientras que Saut Noemie en el 2000, concluyó que además del gen DAZ, en las deleciones del AFZc participan los genes BPY2 y el CDY1. Otro estudio llevado a cabo en poblaciones de origen étnico chino, se identificaron 6 casos de deleciones del cromosoma Y, específicamente en AZFc, incluyendo al gen DAZ. Presencia de microdeleción del gen DAZ en pacientes con oligozoospermia o azoospermia no obstructiva 17. La ausencia de STS sy117, sy127 y sy143, en7 pacientes evidenció resultados que indicaron deleciones en las regiones AZFb y C, con ausencia de sy117, sy127, sy143, el último hombre tenía los STS de los siete anteriores menos el sy La deleción del gen DAZ del AZFc, fue encontrada con mayor frecuencia en pacientes con hipoespermatogénesis que en pacientes con SCO, lo que sugiere que la deleción en este gen no es suficiente para causar una completa pérdida de la espermatogénesis 22. Es mayor la frecuencia de microdeleciones en pacientes azoospérmicos que en oligozoospermicos severos, comprometiendo la región AZFc en el loci de la familia del DAZ 31 Un estudio sobre evolución del cromosoma Y, estableció que en los haplogrupos se presentan diferentes haplotipos para el gen DAZ 39, cuyos genes son afectados posiblemente por poseer un número variable de copias 26. Se cree que el gen DAZ tuvo su origen en el DAZL, conocido inicialmente como DAZLA logrando su transformación evolutiva desde los primates antepasados hace más de mil años como producto de un fenómeno de cuello de botella provocado en los glaciares. 21 El gen DAZ pertenece a una familia de genes presentes en copias casi idénticas, sin que se tenga un claro conocimiento del número de copias que posee 28.Un estudio propuesto por René Reijo, 2000 analizó la presencia de la proteína del gen DAZ y GAZL en dos especies de mamíferos encontrando 9 repeticiones en tandem para el gen DAZ, sin que se haya proporcionado evidencia de que el número de copias sea exacto para hombres diferentes 40, aunque se ha descrito que la relación entre fenotipo testicular y la presencia de microdeleciones de AZFc en infertilidad, pueda deberse a un mayor número de genes en esta región 9 la identificación de los haplotipos de este gen resulta de gran interés para el avance de las investigaciones en microdeleción del cromosoma Y, como factor causal de infertilidad. 39 Otros estudios como los desarrollados por Kamischke Gromoll en el 1999, Ferlin A en el 1999, Ferras C en el 2004, identificaron deleciones de genes de la familia DAZ, los resultados de dichos estudios han hecho un gran aportes al estudio de la infertilidad masculina. El paciente aportado en este estudio con microdeleción de la región AFZc, es Azoospérmico; alteración observada en hombres con presencia de deleciones en el brazo largo del cromosoma Y 14, obedeciendo a las diferentes factores de azoospermia, o regiones AZF a, b y c y la región proximal AZFc/AZFd y, no solo en casos del AZFc. Las microdeleciones en pacientes con azoospermia se presenta en una proporción de 5% al 10% de los casos, proporción mayor que en oligozoospermia (2% 5%). 22 Moro E. identificó una microdeleción en un paciente con oligozoospermia severa y 18 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, 2013 págs ISSN

19 Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad hipoespermatogénesis, resultados confrontados con los obtenidos en un hermano fértil, en quien se observó el grupo de genes, lo que permitió diagnosticar la presencia de la microdeleción de gen DAZ de novo 41, microdeleción que puede presentarse en hombres con espermatogénesis normal 42. Otros estudios han demostrado la microdeleción de genes del AZFb, heredada de padres a hijos 11. La microdeleción puede presentarse en pacientes con patologías concomitantes, como criptorquidia y varicocele, sin que se haya determinado asociación. Se sugiere por tanto, que los casos de azoospermia que presenten patologías adyacentes, puedan considerarse candidatos para estudios de microdeleciones 43, y que la presencia de varicocele, probablemente esté asociado a la microdeleción. En pacientes con microdeleciones AZFc se ha recuperado espermatozoides por diferentes métodos, 75% por TESE y 45% por biopsia, mientras que las microdelecionados en AZFa, AZFb y AZFb + C, no permitieron recuperarespermatozoides. 32. El caso aquí estudiado mostró en la biopsia testicular túbulos seminíferos con ausencia de células germinales en un 80% y células germinales sin maduración en un 20%. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Las conclusiones enunciadas, nos permite identificar factores que pueden ser tenidos en cuenta para el manejo diagnóstico de la infertilidad masculina, en la población Caribe Colombiana: Se confirmó una prevalencia de 3.03% en una muestra poblacional de 33 hombres con diagnóstico previo de infertilidad, el 54,5% azoospérmico y el 45,5 oligozoospermico. Las microdeleciones se presentan con una frecuencia variada entre poblaciones, a pesar de encontrarse en los intervalos estadísticos mostrados en otros estudios; la variabilidad puede estar relacionada con diversos factores, como diferenciación en grupos poblacionales, características genéticas, factores ambientales, laborales y biológicos; o por factores propios del desarrollo del estudio, como criterios de inclusión, tamaño de la muestra, entre otros. Los genes con microdelecion pertenecen a la Familia DAZ, ubicados en la región AZFc, todos los STSs de esta región incluidos en el estudio, estuvieron ausentes, confirmando que los genes de la familia DAZ, son los más comprometidos en la población estudiada. La prueba escogida para determinar la microdeleción del cromosoma Y (Kit de PCR multiplex), mostró efectividad y reproducibilidad en los hallazgos, confirmado mediante la presencia de los controles internos en cada uno de los juegos de iniciadores. Fenotípicamente, la azoospermia no obstructiva está relacionada con la deleción de genes de la familia DAZ. Sin embargo, su presencia también ha sido determinada en pacientes sin microdeleciones del cromosoma Y, corroborando que está presente por causas diversas. Es necesario continuar identificando nuevos casos, en hombres con diagnóstico previo de infertilidad a través de espermograma, (oligozoospermicos y azoospermicos), de esa manera, se evita dilatar los tiempos en el diagnóstico y pronósticos de la alteración, llegando a toma de decisiones concretas para cada caso específico. Continuar con investigaciones en esta misma línea nos permite aclarar y establecer diagnósticos precisos por microdeleción del cromosoma Y. Hacer el seguimiento y búsqueda, en las líneas paternas y horizontales de casos reportados, para determinar origen de Novo o heredado y de acuerdo a los resultados, establecer relación con los factores ambientales, laborales y/o biológicos, como primera aproximación en el origen de las alteraciones. Orientar el consejo genético de la pareja que le permita analizar las diversas técnicas de reproducción artificial hacía su futuro reproductivo. La fertilización in vitro y la transferencia de embriones, así como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, son técnicas de reproducción asistida recomendadas en casos de infertilidad 19

20 Gisela Gonzalez Ruiz, Carlos Silvera Arredondo, Jesús Fernando Vasquez Rengifo masculina por alteraciones severas en la cuenta espermática, 42 opciones que pueden ser analizadas para el caso en mención. Identificados por el estado del arte y por los hallazgos del presente estudio, el grado de compromiso de genes de la familia DAZ, en la infertilidad masculina, lleva a proponer el diseño de métodos sencillos y bajo costo, tipo tamizaje, que pueda brindarnos información de los casos posibles, para luego ser analizados a través de técnicas más costosas, de tal forma que aumente la cobertura probables de casos y de esa forma llegar a todo tipo de población. Lo que contribuiría a la determinación de la causa básica de infertilidad testicular, proyectando un mejor panorama en su diagnóstico. 20 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, 2013 págs ISSN

21 Microdeleciones de regiones AZF del cromosoma Y e infertilidad REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. BrugoS, Chillick C, Kopleman S. Definición y causas de la Infertilidad. [en línea] Centro de estudios de ginecología y Reproducción. (2003). [consultado 2010 junio 5]. Disponible en: org/userfiles/file/revista/revista_vol54no4_octubre_diciembre2003/v54n4a03.pdf 2. Organización Mundial de la Salud OMS. Estrategias de Salud sexual y Reproductiva. [en línea] [citado 2004]. Disponible en URL: equidad/13modulo_12.pdf 3. Poirot C, Cherruau B. Infertilidad masculina, Aspectos Clínicos e investigaciones Biológicas. Acta bioquímica latinoamericana [en línea] [consultado 2010 abril 5]. Disponible en: scielo.org.ar/pdf/abcl/v39n2/v39n2a10.pdf 4. Lucena E, Esteban C, Kent M. Determinación de deleciones en el cromosoma Y en hombres infértiles Candidatos a técnicas de reproducción asistida. Universidad Colegio mayor de Cundinamarca. Revista Nova Bogotá [en línea] [consultado 2011 abril 4]. Disponible en: co/invest_nova/nova/artorig1_2.pdf 5. Peschka B, Leygraff J, Van K, Montac M, Hartmann B, Schubert R, et al. Tipe y frecuency of chromosoma aberration in 781 couple sundergoing intracytoplasmic sperm sujecion.revisitreproductionhuman Martínez M. Factor masculino y calidad embrionaria, Ponencia Centro Gutemberg. Revista iberoamericana e fertilidad. [en línea] [consultado 2009 septiembre]. Disponible en:www. editorialmedica.com/archivos/.../congre%20sef02.ponencias2.pdf 7. Teppa-garran A. Palacios A. Evaluación actual de la infertilidad masculina. Invest. clín [en línea] 2004 [citado 2012 Jul 17]. Disponible en: &pid=s &lng=es. 8. Margaret l, Delbridge, Jennifer A, Marsahl G. Mammalian Y chromosome evolutions and thy malespecific- functions Y-chromosome-borne genes. Journal de reproducción y fertilidad, Dpto. de Bioquímica y genética Universidad de Bundora Vogt ph, Edelmann A, Kirsch S, Henegariu O, Hischmann P, Kiesewetter F et al. Human y chromosome azoospermia factors (azf) mapped to different region Yq11, section de genetic e infertility molecular. University de Heidelberg Alemania Marina S. Actitud ante el paciente azoospermico. Revista Iberoamericana de fertilidad. [en línea] 2002 [citado 2012 julio 17]. Disponible en: Congre%20SEF02-Ponencias2.pdf 11. Rolf c, Gromooll J, Simoni M, Nieschlag E. Natural Transmissionof a partial AZFb deletions of the chromosome Over Three generations. Humana, reproduction ( ) 12. Kamischke A, Gromoll J, Simoni M y otros. Transmission of Chromosomal deletions involving the deleted in azoospermia (DAZ) and chromodomain (CDY1) genes from father to son through intracytoplamatic sperm injection. Human reproduction (2): Fernández E, Álvarez F, Borja L, et al. Frecuencia de microdeleciones del cromosoma Y en hombres venezolanos con infertilidad idiopática. Invest. Clinic [en línea]. 2006; [citado el 2010 noviembre 11]. Disponible en: Vogt P. Human chromosome deletion in Yq11, AZF candidates and male infertility history and update, actualization, Molecular human reproductions, Germany. 1998;50(4): Simoni M. Molecular diagnosis of Y chromosome microdeletion in Europe: State-of-theart and quality control. Institute of reproductive medicine of the University Munster. 2000; Tapia S, Rojas J. Semiología del análisis del semen. Boletín del Colegio mayor de Urología [citado 2011 noviembre 11]. Disponible en: php?method=showdetail&id_articulo=13392&id_seccion=1587&id_ejemplar=1936&id_revista=104 21

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24 Como citar este artículo: Villamarín-Jiménez S, Chacón-Castro MF, Álvarez-León R. Pruebas de toxicidad aguda CL (I) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales a la Bahía de Cartagena, Colombia. Biosalud. 2013;12(2): PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA CL (I) 50 EN PECES ESTUARINOS (Gambusia affinis) UTILIZANDO EFLUENTES INDUSTRIALES A LA BAHÍA DE CARTAGENA, COLOMBIA Sandra Villamarín-Jiménez 1 María Fernanda Chacón-Castro 2 Ricardo Álvarez-León 3 RESUMEN Se efectuaron pruebas de toxicidad con dos efluentes de ALCO Ltda. (el efluente Cospique que descarga desechos industriales y el efluente Casimiro donde se vierten aguas de enfriamiento), para analizar su efecto en los peces estuarinos G. affinis en un tiempo de 24, 48, 72 y 96 horas de exposición, con sistemas estáticos y sin recambio. En los análisis estadísticos se realizan regresiones por mínimos cuadrados ordinarios para determinar el tiempo letal medio y las curvas de toxicidad, se hallan los valores de la CL (I) 50 con sus límites de confianza bajo el método PROBIT. Con el efluente Cospique los porcentajes (%) y tiempo de exposición que se encontraron CL (I) 50 fueron de 15,91; 15,18; 15,18 y 15,12; para 24, 48, 72 y 96 horas de exposición respectivamente. Por tanto, el efluente Cospique es de mayor letalidad, demostrando el efecto inmediato de los mismos. Para el caso de los efluentes de ALCO Ltda. se encontró que a mayor concentración hay mayor mortalidad y menor tiempo letal medio. Los efluentes industriales estudiados son considerados inestables por la formación de complejos químicos resultado de sus compuestos. Palabras clave: bioensayos, toxicidad, efluentes, peces, Colombia. 1 Bióloga Marina. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Bogotá D.C., Colombia. 2 Bióloga Marina. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Bogotá D.C. Colombia 3 Biólogo Marino. M.Sc. Fundación Verdes Horizontes. Manizales, Caldas, Colombia. Correo electrónico: ricardoalvarezleon@gmail.com ACUTE TOXICITY TESTS CL (I) 50 IN ESTUARINE FISH (Gambusia affinis) USING INDUSTRIAL EFFLUENTS TO THE BAY OF CARTAGENA, COLOMBIA ABSTRACT Toxicity tests were carried out with two effluents of ALCO Ltda. (effluent Cospique wich discharges industrial waste and effluent Casimiro into which the cooling water is discharged) in order to analyze their effect on the G. affinis fish during an exposure period of 24, 48, 72, and 96 hours with static systems and without replacement. Regressions by ordinary minimum quadratic were carried out in the statistical analyses to determine the median lethal time and the toxicity curves. The values for LC (I) 50 and their confidence limits were found using the PROBIT method. With the Cospique effluent the percentages (%) and the exposure time found LC (I) 50 were of 15,91; 15,18; 15,18 and 15,12 for 24, 48, 72 and 96 hours respectively. As a consequence, the Cospique effluent is of a higher lethality, demonstrating their immediate effects. In the case of ALCO Ltda. it was found that to higher concentrations was highest the mortality and lesser the median lethal time. The industrial effluents studied are considered unstable because of the formation of chemical complexes resulting from their compounds. Key words: bioassays, toxicity, effluents, fishes, Colombia. ISSN Recibido: junio 18 de Aceptado: enero 16 de 2014 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

25 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales... INTRODUCCIÓN La valoración de la contaminación en el medio natural ha tomado gran importancia durante las últimas décadas, fundamentalmente por el auge industrial que ha desarrollado el hombre a nivel mundial, dando como resultado tanto el vertimiento accidental de desechos durante su manejo, transporte o procesos de tratamiento, como también abiertamente en forma de efluentes residuales (1). La contaminación de los mares causa vastos problemas que solamente una acción internacional podría resolver. La prevención de la contaminación de los mares tiende primordialmente a proteger la salud pública y los organismos vivos, especialmente los crustáceos, peces y moluscos (2). Las pruebas de toxicidad acuática son utilizadas para detectar y evaluar los efectos potenciales toxicológicos sobre los organismos acuáticos. Estas pruebas proporcionan información de referencia que se puede utilizar para evaluar los riesgos de los agentes químicos del organismo y las condiciones de exposición (3). Los bioensayos, según la FAO (2) comprenden: [la] prueba en la cual un tejido vivo, un organismo o un grupo de organismos es usado como agente para la determinación de la potencia de alguna sustancia fisiológicamente activa de acción desconocida. Por tanto, los estudios toxicológicos mediante bioensayos y pruebas de toxicidad proporcionan información valiosa en el proceso de evaluación de los riesgos ambientales (4). Hasta mediados de 1984 en Colombia no se habían dictado normas específicas, que reglamentaran la máxima concentración permisible de los contaminantes para vertimientos de aguas residuales en las diferentes industrias. El Gobierno colombiano en vista de que en el país existen fuentes receptoras altamente contaminadas por descargas industriales y domésticas, y teniendo en cuenta el crecimiento de nuevas industrias y de la población, expidió el Decreto 1594 de junio 26 de 1984 sobre las concentraciones máximas permisibles de los contaminantes para los vertimientos de aguas residuales industriales (5). Este trabajo tuvo como objetivo conocer el efecto de los efluentes que ALCO Ltda. vierte a la bahía mediante pruebas de toxicidad aguda, con el fin de determinar la concentración letal inicial que causa el 50% de mortalidad CL (I) 50 a 24, 48, 72 y 96 horas. Estos ensayos actualmente en Colombia son el criterio más utilizado para determinar y comprobar los efectos de la contaminación acuática. Se utilizaron peces (G. affinis) comunes en las costas colombianas; esta especie fue seleccionada por la posibilidad de mantener un stock poblacional, por ser de fácil manejo a nivel de laboratorio, y por ser una especie de importancia ecológica. En el país los trabajos sobre bioensayos y pruebas de toxicidad aguda son escasos por ser un tema nuevo en nuestro medio. Entre los primeros trabajos que incluyeron bioensayos y pruebas de toxicidad aguda sobre especies ícticas colombianas, con sistemas estáticos se encuentran: Lara et al. (6), Montoya (7), Vergara (8) y Barreto (9). Posteriormente, Escobar (10) realizó bioensayos para determinar la contaminación en aguas costeras y oceánicas de Colombia. Montoya (7) realizó pruebas de toxicidad aguda LC 50 a partir de ensayos exploratorios con organoclorados sobre Caquetaia kraussi y Tilapia rendalli. Escobar (11) realizó bioensayos y pruebas de toxicidad para evaluar las concentraciones de hidrocarburos en organismos acuáticos y los efectos potenciales de derrames. Barreto (9) realizó pruebas de toxicidad con Aldrin en 25

26 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Poecilia sphenops, determinando el LC, LC 84 y LC 16 para 96 horas. Santos y Torres (12) evaluaron la toxicidad sobre Scenedesmus sp. de aguas continentales y aguas marinas sobre Dunaliella salina, en un período de 96 horas de exposición a diferentes concentraciones de Corexit 7664, 8667, Martínez (13) desarrolló pruebas de toxicidad con el dispersante Numatrol 220 y su mezcla con el crudo Caño Limón en tres especies marinas; mientras Mosquera (14) realizó las mismas pruebas y además observó la demanda bioquímica de oxígeno. Álvarez y Borda (15) realizaron pruebas de toxicidad crónica con el dispersante Numatrol 220, el Fuel Oil No. 2 y su mezcla sobre la microalga Tetraselmis sp. Específicamente sobre efluentes se encuentran los trabajos de Escobar (16), quien realizó estudios de contaminación con efluente de refinería sobre sistemas lénticos del Valle del Magdalena Medio. En la Bahía de Cartagena, Cabrales et al. (17) elaboraron pruebas de toxicidad con métodos estáticos y recambio manual de concentraciones para comprobar los efectos de los efluentes de hidrocarburos aromáticos procedentes de la refinería de Ecopetrol-Car sobre Dormitator maculatus y Penaeus schmitti en 24, 48 y 96 horas de exposición. Cabrales et al. (18) realizaron bioensayos de tolerancia térmica del efluente de CORELCA en la Bahía de Cartagena utilizando Centropomus ensiferus y Penaeus notialis. Martínez (19) trabajó con los efluentes de ALCO Ltda. sobre las microalgas Tetraselmis chuii y Skeletonema costatum determinando las EC (50) para cada especie. Asimismo, Peláez (20) evaluó la toxicidad aguda a través de bioensayos con microcrustáceos, y Angulo et al. (21) realizaron bioensayos con efluentes de minas de carbón utilizando planarias. La Bahía de Cartagena se sitúa en la costa Norte del Caribe colombiano entre los 10 o 15 y 10 o 28 N y los 75 o 28 y 75 o 42 W. Tiene una longitud máxima de 15 km y una anchura de 8 km. El volumen de agua es de 122 millones de m 3 y la profundidad promedio es de 16 m. La bahía además presenta áreas de intercambio con el mar abierto de 4000 m 2 en Bocagrande y de 5000 m 2 en Bocachica. En su extremo sur recibe las aguas del Canal del Dique, brazo artificial del río Magdalena, que aporta un volumen promedio de 85 m/seg, y la convierten en un sistema estuarino positivo (22). Sobre la región suroriental se encuentra la Zona Industrial de Mamonal situada a 15 km de la ciudad y con un área de 60 km 2, considerada el mayor núcleo de industria química y petroquímica en el país (23). Esta industria vierte en sus aguas residuales, sustancias químicas de diversa naturaleza y composición. Algunas industrias poseen instalaciones para el tratamiento de sus desechos acuosos, otras tienen muelles propios para recibir las materias primas y embarcar los productos elaborados, lo que afecta notablemente la calidad de las aguas de la Bahía de Cartagena (24). Los efluentes de ALCO Ltda. están localizados en esta zona industrial. De los dos efluentes, uno descarga desechos químicos alcalinos (efluente Cospique), y el otro aguas de enfriamiento (efluente Casimiro). El área de Cospique tiene 134 ha y limita con CORELCA, ATUNCOL y la Bahía de Cartagena. Asimismo, el Caño Casimiro atraviesa las instalaciones de ALCALIS y llega a la bahía en forma paralela al muelle de la empresa. La zona donde está ubicada esta empresa contiene islotes cubiertos por manglar, los cuales aíslan en algunos sectores la línea de costa del resto de la bahía y se distribuyen entre CORELCA-ALCALIS y ELECTRIBOL- ALCALIS-PETROQUÍMICA (Figura 1). Los bioensayos y las pruebas químicas se llevaron a cabo en los laboratorios del CIP- INDERENA, Regional Bolívar. 26 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

27 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales... Figura 1. Zona Industrial de Mamonal (Cartagena) donde se muestran las áreas de muestreo: Casimiro y Cospique. MATERIALES Y MÉTODOS Después de realizar una salida de reconocimiento con el fin de identificar la posición geográfica y las características físicas de los efluentes Cospique y Casimiro, se observó que Cospique posee tres vertimientos en la bahía que están situados en la margen occidental de la laguna norte de sedimentación 54 (ha) donde se confinan los residuos industriales de ALCO Ltda. Las muestras de efluentes se tomaron en el punto de descarga de la laguna norte de sedimentación con el fin de desarrollar las pruebas de toxicidad aguda, CL (I) 50 a 24, 48, 72 y 96 horas. Para conocer el efecto de este efluente en la bahía, se realizaron transectos longitudinales durante agosto, septiembre y noviembre de 1991, desde la línea de costa hasta el grupo de islas que bordean la zona costera. Estas muestras se tomaron a media agua (1 m) cada 100 m. Se tomaron parámetros físico-químicos in situ (temperatura, salinidad, ph, sólidos y alcalinidad) (25). Al Caño Casimiro, en cambio, llegan cuatro afluentes de ALCO Ltda. (aguas de enfriamiento de los procesos industriales). Las muestras del efluente para desarrollar las pruebas de toxicidad aguda CL (I) 50 a 24, 48, 72 y 96 horas se tomaron bajo el puente que se sitúa al sur de la puerta 2 de la empresa. Se realizaron también transectos longitudinales en agosto, septiembre y noviembre de 1991 ubicando estaciones cada 100 m, para observar la dinámica de las concentraciones del efluente a lo largo del caño hasta llegar a la Bahía de Cartagena. Se determinaron parámetros físicoquímicos (temperatura, salinidad, ph, sólidos y alcalinidad) (25) (Figura 1). DISEÑO EXPERIMENTAL Tratamiento de las muestras de los efluentes La recolección de las muestras de los efluentes para las pruebas se llevó a cabo en tanques de plástico amarillos y rojos de 100 l; temperatura, 27

28 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León salinidad y ph se determinaron al llegar al laboratorio. Estas muestras se trabajaron inmediatamente (efluente Casimiro), o se almacenaron en tanques de 100 l para decantarlas un máximo de 24 horas (efluente Cospique). Las muestras para los análisis químicos (ph, salinidad, conductividad, dureza magnésica y dureza cálcica), se tomaron en envases plásticos. Estos análisis fueron desarrollados por el INDERENA en el laboratorio de química. Por su parte ALCO Ltda. llevaba un registro interno de la caracterización de sus efluentes realizando análisis similares a los realizados en el INDERENA; determinando para el Casimiro: sólidos solubles, insolubles totales, sólidos totales, sólidos sedimentables, cloruros, carbonatos solubles, bicarbonatos solubles, carbonatos insolubles, sulfatos, amoníacos, turbiedad, ph; y para Cospique: sólidos solubles, sólidos en suspensión, sólidos totales, alcalinidad (P, Mg, OH, CO 3 ), dureza cálcica, dureza magnésica, amoníaco, turbiedad y ph. Tipos de ensayo Se corrieron ensayos estáticos y sin recambio del efluente durante el transcurso de la prueba con una duración de 96 horas, de acuerdo con Ward y Parrish (26) y Gutiérrez (27). Se mantuvieron con aireación controlada al mínimo (140 burbujas/minuto), mangueras de silicona y capilares de vidrio. La densidad fue de 10 individuos por acuario (1 ind/2 l.). Se utilizaron dos baterías cada una constituida por tres hileras de seis acuarios de vidrio de 20 l de capacidad. Preparación del material de laboratorio El protocolo de limpieza que se describe a continuación aseguró un buen grado de descontaminación (28): escobilleo con detergente; enjuague con pequeñas cantidades de HCL y HNO 3 al 10%; en el lavado inicial se dejó reposar por 24 horas en la solución ácida para eliminar metales; se enjuagó cinco veces con agua potable, eliminando así residuos, detergente y ácido; secado libre de polvo atmosférico. Tratamiento de la especie Se tuvieron en cuenta los criterios propuestos por la FAO (2), Escobar (28) y Reish y Oshida (29). Los peces (G. affinis) se transportaron en bolsas plásticas de polietíleno de 50 l llenándolas a un volumen de 15 l con agua de los caños del medio natural que circundan la zona de Galerazamba (Atl.), donde se recolectaron. Se adicionó oxígeno con una densidad de 10 individuos/l dependiendo del tamaño de estos, evitando siempre su exposición a la luz solar hasta su llegada al laboratorio. Se les adicionó hielo alrededor de las bolsas, para su mayor conservación. Estas bolsas se colocaron en tanques Eternit con capacidad de 1000 l, se abrieron para variar la salinidad paulatinamente de 2 a 3 ppm/h hasta 15 ppm, y luego 1 ppm/h. La temperatura se varió hasta la del ambiente del laboratorio (M. Prieto, com. pers.). Para evitar el contagio se procedió a aislar los enfermos del resto del lote. Para el tratamiento de las enfermedades se probaron tres antibióticos; Cloranfenicol: en dilución 3 ppm, con baños de 12 horas. Verde de Malaquita: 0,7 ppm con baños de 24 horas y Azul de Metileno: con dilución de 0,7 ppm, baños de 24 horas (M. J. Torres- Virviescas, com. pers.). Para iniciar los ensayos con estos organismos se dejaron pasar 5 días después del tratamiento. Para evitar la proliferación de microorganismos en el siguiente lote, se esterilizaron los acuarios y todo el material de laboratorio con 200 mg/l de hipoclorito (26). Aclimatación primaria Los peces trasladados al Centro de Investigaciones Pesqueras CIP-INDERENA, se colocaron en estanques exteriores de cemento con un área de 28 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

29 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales m 2, profundidad de 1,20 m y densidades de 25 ind/m 2 según el tamaño de los animales. Se hicieron recambios según la necesidad del medio durante 15 días, suministrando alimentación diurna de 8 a 9:30 a.m. y nocturna de 4:30 a 5:00 p.m. A veces solo se alimentaron en la mañana. La cantidad dependió de la necesidad del crecimiento. Aclimatación secundaria Los peces se pasaron después a acuarios de 100 l realizando diariamente recambios de 70% de agua, alimentándolos de acuerdo al 1, 2 o 3% de la biomasa total húmeda. Diariamente se midió la temperatura y salinidad, manteniéndose a condiciones de laboratorio; en un rango de o C y 25 ppm. La duración de esta fase fue de 10 días. El alimento se les suspendió 24 horas antes de empezar las pruebas, siguiendo recomendaciones de la FAO (2). Aclimatación terciaria Se inició con el proceso de traspaso de los peces de aclimatación secundaria a los acuarios de 20 l con agua de dilución en volúmenes previamente establecidos; con aireación controlada y sin alimentación; con temperatura de 26 o C y salinidad de 25 ppm por 24 horas. Pruebas letales Los efluentes se trabajaron como un 100% y por escala aritmética se establecieron cinco concentraciones para cada caso. Estas se diluían con agua de mar debidamente filtrada y proveniente del Laguito. Pruebas de búsqueda Los ensayos comenzaron cuando se tuvo contacto de los organismos con el efluente (Cospique o Casimiro según el caso), determinando un tiempo de exposición de 96 horas. Las pruebas se desarrollaron por duplicado y se escogieron cinco concentraciones en la mayoría de los casos, aunque en las pruebas desarrolladas para G. affinis hubo la necesidad de disponer hasta de 8 concentraciones (determinadas por modelo aritmético). Para hallar los volúmenes respectivos, se utilizó la siguiente fórmula: [ ]* v2 = [ ]2* v1 Donde [ ]1 = Efluente 100% [ ]2 = Concentración escogida V1 = 20 l (Capacidad del acuario) V2 = Volumen necesario de efluente. Figura 2. Determinación de la concentración letal media CL (I) y 48 horas de exposición del efluente Casimiro vs. G. affinis (A y B), y CL (I) y 96 horas (C y D) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). 29

30 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Estas concentraciones variaron para cada caso y se realizaron con el fin de encontrar rangos más estrechos utilizados en las pruebas definitivas. Se procedió a llenar los acuarios con agua de mar (agua de dilución) al volumen preestablecido, utilizando para ellos balones aforados de 1 y 2 l. Posteriormente se procedió a colocar los organismos (10 por acuario) con aireación mínima controlada 24 horas antes de iniciar la prueba, para minimizar el estrés de los mismos. El efluente se adicionó midiendo el volumen con balones aforados de igual manera que se realizó con el agua de mar. Los volúmenes de ml se tomaron con probetas de 250 ml, 500 ml y 1000 ml, hasta completar el volumen de 20 l. Iniciada la prueba se realizaron observaciones de sintomatología y mortalidades cada hora consecutivamente durante las primeras 12 horas y posteriormente espaciadas cada 24 horas hasta completar las 96 horas establecidas. Los organismos muertos se retiraron con pinzas metálicas protegidas con cinta aislante y se colocaron en cajas de Petri rotuladas según la concentración y con formol al 10%. Se tomaron parámetros físico-químicos desde las cero horas cada 24 horas. Hasta las 96 horas se midió temperatura (termómetro Silber Brand), salinidad (refractómetro Atago S-10 Salt 10%) y ph (potenciómetro Schott Gerate, tipo ph-meter C67/2). Pruebas definitivas Las pruebas definitivas se desarrollaron por triplicado, con los rangos encontrados en las pruebas de búsqueda. El procedimiento seguido fue el mismo descrito anteriormente para las pruebas de búsqueda. Análisis estadísticos Los análisis estadísticos se basaron en los métodos establecidos en el Curso Regional CPPS/ PNUMA, específicamente en los lineamientos de Ramírez (1). Con el método Dosis-Respuesta (PROBIT) se obtuvieron las concentraciones letales medias CL (I) 50 con sus límites de confianza al 95%; teniendo en cuenta el coeficiente de determinación más alto se escogió el modelo de mayor ajuste para estas; se realizaron gráficas de CL (I) 50 (mortalidad vs. concentración) para 24, 48, 72 y 96 horas, en todos los casos se plotearon los puntos observados y se ajustaron las curvas con las ecuaciones respectivas en cada tiempo de exposición. Las regresiones lineales por mínimos cuadrados ordinarios, se determinaron tanto para las ecuaciones de toxicidad como para el tiempo letal medio, cada uno de estos análisis con sus límites de confianza. Para la realización de las gráficas de ecuación de toxicidad (concentración letal vs. tiempo), se tuvo en cuenta que el coeficiente de correlación fuera de 0,95 para cuatro puntos y de 0,97 para tres puntos observados (1). Se llevaron a cabo gráficas del tiempo letal medio (mortalidad vs. tiempo), considerando aquellos valores obtenidos cercanos al 50% de mortalidad. Sintomatología Las observaciones sobre el comportamiento de la especie al ponerla en contacto con las diferentes concentraciones de los efluentes, se registraron dando a cada una la descripción macroscópica de la reacción, buscando usar los términos más representativos a la reacción observada. En el caso de G. affinis se utilizaron 7 grupos de características (comportamiento general, nado, tegumento, respiración, estructuras, respuestas digestivas, respuestas nerviosas, movimientos respecto al exterior) y 22 sub-características. RESULTADOS Parámetros físico-químicos Los parámetros físico-químicos iniciales de los efluentes en las especies utilizadas oscilaron 30 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

31 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales... en un rango de 9,5-12,0 para ph; temperatura de 29 o -31 o y salinidad de ppm para el efluente Casimiro; de 11,2-12 en ph, de 27 o -31 o en temperatura y de ppm en salinidad para el efluente Cospique (Tabla 1). Tabla 1. Parámetros físico-químicos iniciales de los efluentes de ALCO Ltda. para las pruebas definitivas Efluente Especie Parámetros Fechas ph T ºC S M-D-A Casimiro G. affinis 12 30, Casimiro G. affinis Los parámetros determinados durante las pruebas definitivas con las diferentes especies se presentan en la Tabla 2 para Casimiro y en la Tabla 3 para Cospique. Los rangos de estos resultados se sintetizan en la Tabla 4. Mortalidad L o s v a l o re s d e m o r t a l i d a d p a r a l a s concentraciones propuestas en las pruebas definitivas se registran en la Tabla 5 para el efluente Casimiro y en la Tabla 6 para el efluente Cospique determinándose valores para 12, 24, 48, 72 y 96 horas de exposición. Concentraciones letales Las CL (I) 50 y sus límites de confianza se sintetizan en los efluentes Casimiro y Cospique en las Tablas 7 y 8 respectivamente. Los valores correspondientes se ilustran en las Figuras 3 y 4 para cada efluente. Tabla 2. Síntesis del rango de los parámetros fisicoquímicos de las pruebas definitivas con los efluentes ALCO Ltda. Efluente Especie Parámetros Fechas ph T ºC S M-D-A Casimiro G. affinis 7,2-8,9 26,0-29, Casimiro G. affinis 7,9-10,4 25,5-28, Tabla 3. Síntesis de las CL (I) 50 y sus límites de confianza para las pruebas definitivas con el efluente Casimiro a 24, 48, 72 y 96 horas Tiempo Modelo CL (I) 50 Límite sup. Límite inf. 24 PROBIT 30,536 31,371 29, LOGIT 27,022 27,604 26,44 72 LOGIT 26,655 27,189 26, LOGIT 25,766 26,311 25,221 31

32 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Tabla 4. Síntesis de las CL (I) 50 y sus límites de confianza para las pruebas definitivas con el efluente Cospique a 24, 48, 72 y 96 horas Tiempo Modelo CL (I) 50 Límite sup. Límite inf. 24 LOGIT LOG 15,878 16,400 15, PROBIT 15,210 15,553 14, PROBIT 15,210 15,553 14, LOGIT 15,117 15,482 14,752 Figura 3. Determinación de la concentración letal media CL (I) y 48 horas de exposición del efluente Cospique vs. G. affinis (A y B), y CL (I) y 96 horas (C y D) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). Figura 4. Curva de toxicidad para la prueba definitiva del efluente Casimiro vs. G. affinis (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). 32 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

33 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales... Tiempo letal medio La determinación del tiempo letal medio por mínimos cuadrados ordinarios de G. affinis con los efluentes aparece en la Tabla 8. Ecuaciones de toxicidad Los valores de las ecuaciones de toxicidad se presentan en la Tabla 8 (Figura 4). Sintomatología Los datos de sintomatología observados en cada una de las pruebas y para cada una de las especies aparecen en la Tabla 7. Efluente Casimiro DISCUSIÓN Como se describió en la metodología, el Caño Casimiro es el resultado de las aguas de enfriamiento que utiliza la empresa para sus procesos y la vertiente natural que nace en Turbaná y recorre la zona industrial por su margen oriental. El efluente Casimiro es de composición inestable, pudiéndose incluso percibir fuertes olores a amoníaco en la zona donde se tomaron las muestras, dicho olor disminuye o desaparece en la época de invierno; contiene sólidos en suspensión que le dan apariencia lodosa. Respecto a los parámetros físico-químicos iniciales a las pruebas realizadas se observaron promedios de ph de 12; temperatura de 30,5 o C y salinidad de 10 ppm en la mayoría de las pruebas (Tabla 1). En las pruebas tanto de búsqueda como en las definitivas, estos parámetros se mantuvieron en los siguientes rangos: ph entre 7,2-8,9; temperatura entre 26 o -29 o C y salinidad de ppm (Tabla 4). Por la inestabilidad del efluente se dificultó en gran medida la ubicación de los rangos de las concentraciones a escoger. Las búsquedas arrojaron resultados antagónicos y por ello la necesidad de realizar 2 o 3 pruebas para asegurar las concentraciones de las definitivas por no encontrarse correlación en los resultados obtenidos en las búsquedas, donde se utilizaron ocho concentraciones para cada prueba. Tabla 5. Análisis de regresión por mínimos cuadrados ordinarios para los valores de la prueba definitiva de los efluentes Casimiro, para determinar el tiempo letal medio TL (I) 50 Parámetro Conc. 20% Conc. 24% Conc. 28% Conc. 32% Modelo PO E E E Coeficiente de 1,476 3,395 3,474 - Regresión A Coeficiente de -7,858E-03-7,260E-04-2,299E-0 - Regresión B Coeficiente de 0,930 0,890 0,966 - Determinación Variación 93,031 89,046 96,647 - Explicada F Calculado 40,052 24,387 86,473 - Tiempo Letal 1,53E ,25 33,29 - Medio Límite Superior 9,79E ,66 54,212 - Límite Inferior 1,56E ,61 10,329-33

34 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Tabla 6. Análisis de regresión por mínimos cuadrados ordinarios para los valores de la prueba definitiva de los efluentes Cospique, para determinar el tiempo letal medio TL (I) 50 Parámetro Conc. 11,7% Conc. 13,4% Conc. 15,1% Conc. 16,8% Modelo LO PO PO PO Coeficiente de 29,995 1,471 1,475 1,476 Regresión A Coeficiente de -1,300-8,268E -0,124-0,377 Regresión B Coeficiente de 0,911 0,968 0,994 0,978 Determinación Variación 91,093 96,760 99,370 97,847 Explicada F Calculado 30,682 89, , ,367 Tiempo Letal 3,39E ,5 256,42 7,76 Medio Límite Superior 1,24E ,18 439,67 17,63 Límite Inferior ,6 953,95 157,99 3,11 Las concentraciones letales donde se presenta una mortalidad del 50% para G. affinis corroboran la similitud de los rangos entre las pruebas, determinándose así la letalidad del efluente con un 25% en promedio. Es importante anotar los efectos sintomatológicos observados en el transcurso de las pruebas; primero se observó una reacción inmediata de los organismos al contacto con el efluente, presentándose movimientos acelerados, estrés, nado errático y otra serie de síntomas que se describen en la Tabla 7; posteriormente los organismos muestran una adaptabilidad progresiva al efluente como se muestra en las curvas de toxicidad (Figura 4), que ilustran este comportamiento. Es importante resaltar nuevamente que aunque todos los coeficientes de correlación estuvieron por encima de 0,8 no se considera conveniente realizar gráficas para 3 o 4 puntos con coeficientes por debajo de 0,97 y 0,95 respectivamente, por no ser significativos a un 95% de confiabilidad. Los sólidos en suspensión producen obstrucción en las branquias de los organismos y dilatación de la pupila. Con el tiempo letal medio se determinó que a altas concentraciones se alcanza el 50% de mortalidad en un corto tiempo, mientras que para las concentraciones más bajas este tiempo es muy prolongado; de tal manera que la mortalidad muestra dependencia tanto por la concentración del tóxico, como por el tiempo de exposición al mismo. En G. affinis fue de 33,29 horas para 28%. Es importante aclarar que el modelo exponencial es un modelo deductivo que se ajusta tanto en el medio natural como en el laboratorio, aunque para el efecto de este trabajo se escogieron aquellos modelos que por coeficiente de determinación resultaron de mejor ajuste, siendo esto una elección de tipo inductivo (1). Efluente Cospique Al igual que el efluente Casimiro, este efluente también se caracterizó por su inestabilidad y presencia de sólidos en suspensión, pero su coloración es blancuzca debido a las altas concentraciones de magnesio y calcio. Es de textura viscosa y suave, a medida que se sedimenta el color se aclara; en el laboratorio se trató de simular lo que en realidad sucede en la laguna de sedimentación y así evitar nuevas interferencias a nivel del verdadero efluente 34 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

35 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales... a través de los tres vertederos a la Bahía de Cartagena. El promedio de los parámetros físico-químicos del afluente inicial fue: ph de 12; temperatura de 28 o C y salinidad de 80 ppm (Tabla 1). Durante las pruebas los parámetros de ph, temperatura y salinidad registraron rangos de 7,9-10,4; 25,5-28 o C y respectivamente (Tabla 4). El ph en el momento de iniciada la prueba fue muy alto (10,4) y a medida que transcurrió la misma se observó su disminución en 3 o 4 unidades, debido a la presencia de materias fecales excretadas por los organismos y a la disolución de sales; mientras que la temperatura y la salinidad se mantienen en los mismos rangos, variando de 1 a 2 ppm. Para G. affinis se hallaron concentraciones desde 11,7-18,5% y una concentración letal de 15,9-151,1% (Tabla 8), demostrando de esta manera que a pesar de ser más resistentes que los camarones, la toxicidad del efluente es alta. La respuesta de los diferentes organismos al efluente fue también inmediata como en el caso de Casimiro, presentándose estrés, nado errático, espasmos y específicamente en este afluente se denotó muy marcadamente la rapidez en el cambio de mudas, desde las concentraciones más altas a las más bajas por los altos porcentajes de salinidad. Se apreció muy frecuentemente que el efluente produce escozor a nivel de la epidermis, esta observación se confirmó posteriormente puesto que los organismos muertos presentaron resequedad en esta. En algunas concentraciones los individuos presentaron hemorragias a nivel de las branquias y del abdomen. Tabla 7. Sintomatología observada en G. affinis con aguas del efluente Casimiro y Cospique (x = presencia; - = ausencia) SINTOMATOLOGÍA Control 20% 24% 28% 32% 36% Horas Comp. Gral. Control x (12) x (24-96) x (72-96) x (12-24) - - Excitación - x (12) x (12) x (48-96) x (12) x (12) Quietud Irritación Ten. Superficie - x (12) x (12) x (12-24,72-96) x (12) x (12) - Nado Errático - - x (12-24) x (12-48,72) x (12-24) x (12) Rotativo x (12-24) x (12) Invertido x (24-48) - - Lateral C. lado y fondo x (12-96) x (12-24) x (12) - Tegumento Cambio Pigment x (24-48) x (12-24) x (12) Secrec. Mucus x (72) x (12-24) x (12) Hemorragias Respiración Rápida - x (12) x (12) x (12-48) x (12-24) x (12) Lenta x (72-96) x (12-24) x (12) Tragos de aire x (96) x (12-24) x (12) - Estructuras Hemo. branquias Mucus branquias x (72) x (12-24) x (12) - Res. Digestivas Vomito x (12) x (12) - Res. Nerviosas Hipersensibilidad x (12-24) x (12) x (12) - Mov. Exterior Tacto x (12-96) x (12-96) x (12-96) x (12-48) x (12) - Sonido x (12-96) x (12-96) x (12-96) x (12-48) x (12) - 35

36 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León Tabla 8. Análisis de regresión para determinar la ecuación de toxicidad en para los efluentes Casimiro y Cospique Efluente Especie Modelo Coeficiente de Ecuación de toxicidad correlación Casimiro G. affinis PO 0, log Y = log 45, (-0, ) log X Cospique G. affinis LI 0, log Y = log 17, (-3,658104E-02) log X En la prueba definitiva de G. affinis se comprobó que para la primera concentración propuesta el rango de mortalidad fue muy bajo (concentración de 11,7%), aumentando a mayor concentración. Con respecto al tiempo letal medio, se puede mencionar que a mayor concentración el valor de este parámetro se alcanza en un tiempo corto, mientras que a menor concentración este tiempo es difícil de lograr. Al igual que para el efluente Casimiro, en Cospique se encontraron rangos muy estrechos en la mayoría de las concentraciones en G. affinis, para el 16,8% el Tl (I) 50 fue de 7,6 horas. Aunque el efluente Casimiro y el efluente Cospique son de diferente composición se comportan de manera similar, ya que se observan efectos letales inmediatos donde a mayor tiempo de exposición se reduce la tasa de mortalidad, presumiblemente porque las fracciones más tóxicas se evaporan, oxidan o degradan en el medio. En las normas de vertimiento del Decreto 1594 de 1984, los rangos permisibles de contaminación con respecto al ph se establecen entre 5 y 9 unidades; dichos niveles se sobrepasan tanto en las pruebas definitivas (Tablas 2 y 3), como en las estaciones realizadas para las radiales de los efluentes estudiados. CONCLUSIONES El efecto tóxico de los efluentes (Casimiro y Cospique) es de acción inmediata, para los peces, aunque se nota buena resistencia y robustez de G. affinis. A medida que transcurre el tiempo se reduce la tasa de mortalidad de los organismos expuestos, lo que indica que presumiblemente hay pérdida de las fracciones más tóxicas. Los efluentes industriales estudiados en el presente trabajo se consideran inestables resultado de la complejidad de compuestos y caudales diferentes que allí se vierten, por lo que los resultados encontrados son representativos de unas condiciones particulares del mismo. La concentración letal sobre G. affinis se presenta en un rango de 25,77-30,54% con el efluente Casimiro. Con el efluente Cospique fue de 15,11-15,91%, indicando de esta manera que Cospique tiene una letalidad aproximadamente de 2 a 3 veces mayor que Casimiro. El tiempo letal medio para el efluente Casimiro sobre G. affinis para 16,8% es 7,76 horas; indicando que para el caso de los efluentes industriales de ALCO Ltda. a mayor concentración letal, mayor mortalidad y menor tiempo letal medio. La curva decreciente del efluente Casimiro vs. G. affinis indica que a mayor unidad de tiempo la concentración letal presenta una reducción constante; demostrando de esta manera la acción inmediata de los efluentes. Los rangos de ph de los efluentes industriales de ALCO Ltda. tomados en las pruebas definitivas con G. affinis sobrepasan el rango (5-9 unidades) estipulado en el Decreto 1594 de Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

37 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales... La reacción de los organismos expuestos a los efluentes de ALCO Ltda. fue inmediata y constante hasta las 48 horas de exposición, a partir de las cuales se presentó una aparente adaptación de los mismos al medio; determinándose que no se produce aumento en el efecto tóxico de los efluentes. Los organismos utilizados (G. affinis) se comportan como bioindicadores ante los contaminantes (aguas calientes y compuestos alcalinos) de los dos efluentes industriales evaluados, de acuerdo a los criterios de Mohammad et al. (30) y Wickins (31). Infortunadamente no existen trabajos similares en cuanto a la naturaleza de los efluentes, ni al área de estudio, ni a las sustancias presentes ni a los organismos utilizados (estuarinos y marinos), por ello esta contribución es pionera en Colombia y en el exterior. AGRADECIMIENTOS A las directivas del IFI y de ALCO Ltda. Planta de Cartagena, por su colaboración en los muestreos y en la información básica suministrada. A la dirección regional del INDERENA, a los colegas J. Álvarez, A. Martínez, M. Prieto y O. Gutiérrez por su apoyo en la parte experimental, y a A. Ramírez por sus sugerencias y comentarios en el análisis de resultados. 37

38 Sandra Villamarín-Jiménez, María Fernanda Chacón-Castro, Ricardo Álvarez-León BIBLIOGRAFÍA 1. Ramírez A. Fundamentos cuantitativos para realizar ensayos biológicos y pruebas de toxicidad. Curso Regional de Entrenamiento PNUMA / PAC / FAO / COI / INDERENA sobre Ensayos Biológicos de Toxicidad como Bases Técnicas para Formular Criterios de Calidad en el Gran Caribe. Cartagena (Bol.), Colombia, junio 11-25; FAO. Manual de métodos de investigación del medio ambiente acuático. Parte 4a. Base para la elección de ensayos biológicos para evaluar la contaminación marina. FAO. Doc. Téc. Pesca 1981; 164: Rand GM, Petrocelli SM. Fundamentals of aquatic toxicology: Methods and applications. Hemisphere Publ. Corp. Washington (USA); Alcázar F. Toxicidad y efectividad del dispersante SEAF-014 MOLYPAC Ltda. Dpto. de Oceanología. Univ. Chile. Sede Valparaíso, Montemar (Chile); República de Colombia. Decreto1594 de junio 26 de 1984, Por el cual se reglamenta parcialmente el título I de la Ley 9 de 1979, así como el capítulo II del título VI - parte III - libro II y el título III de la parte III - libro I - del Decreto 2811 de 1974 en cuanto a usos del agua y residuos líquidos. Bogotá D.E., Colombia; Lara C, Valderrama M, Valderrama J. Ensayos de toxicidad aguda sobre especies ícticas colombianas mediante sistemas estáticos. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Montoya DF. Pruebas de toxicidad aguda LC50 con algunos organoclorados, en dos especies continentales: mojarra amarilla (Petenia kraussii Steindachner, 1878) y la tilapia (Tilapia rendalli Boulenger, 1898) a partir de ensayos exploratorios. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Vergara VH. Determinación de la concentración letal media LC50 del herbicida Stam sobre dos especies ícticas de la cuenca magdalénica: Tilapia (Tilapia nilotica) y Bocachico (Prochilodus reticulatus magdalenae). Tesis Profesional. Fac. de Biología, Pontificia Universidad Javeriana; Barreto J. Pruebas de toxicidad aguda con un pesticida clorinado policíclico (ALDRIN), en Poecillia sphenops Valenciennes, Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Escobar JJ. Determinación de los niveles de seguridad mediante bioensayos en la contaminación acuática de Colombia, aguas oceánicas y costeras. Proyecto de Investigaciones INDERENA / FUNDEMAR / COLCIENCIAS. Cartagena (Bol.); Escobar JJ. Bioensayos y pruebas de toxicidad para evaluar el efecto de la contaminación acuática de los organismos hidrobiológicos y los efectos tóxicos de los derrames de hidrocarburos. INDERENA- Subgerencia Medio Ambiente. Bogotá D.E., Inf. Técnico; Santos S, Torres F. Efectos tóxicos de tres dispersantes COREXIT ) sobre Scenedesmus sp. Meyer, 1829 y Dunaliella salina. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Martínez DP. Efectividad y pruebas de toxicidad del dispersante NUMATROL 220 y su mezcla con el crudo Caño Limón en tres especies marinas. Tesis Profesional. Fac. de Biología, Univ. del Valle; Mosquera AI. Demanda bioquímica de oxígeno (DBO) y toxicidad del crudo Caño Limón y su mezcla con el dispersante NEUMATROL 220 en tres especies marinas. Tesis Profesional. Fac. de Ciencias, Universidad del Valle; Álvarez J, Borda LB. Pruebas de toxicidad crónica con un dispersante, el fuel-oil No. 2 y su mezcla respectiva sobre la especie de microalga Clorophyta Tetraselmis sp. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Escobar JJ. Contribución al conocimiento de la contaminación con efluentes de refinería en dos sistemas lénticos del Valle del Magdalena Medio. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

39 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en peces estuarinos (Gambusia affinis) utilizando efluentes industriales Cabrales OR, Del Valle P, García S. Bioensayos y pruebas de tolerancia térmica sobre el efluente de la Corporación Eléctrica de la Costa Atlántica CORELCA-TERMOCARTAGENA. INDERENA / CORELCA. Cartagena (Bol.). Inf. Técnico; Cabrales OR, García S, Del Valle P, Ocaña M. Estudios ecológicos de las áreas de influencia de ECOPETROL sobre la Bahía de Cartagena Fase IV. Bioensayo en compuestos cíclicos y efluentes de la Bahía de Cartagena. INDERENA-ECOPETROL. Cartagena (Bol.). Inf. Técnico; Martínez A. Pruebas de toxicidad subletales con los efluentes de Alcalis de Colombia Ltda. en las microalgas marinas Skeletonema costatum y Tetraselmis chuii a 96 y 120 horas respectivamente. CIP-INDERENA. Inf. Téc.; Peláez M. Evaluación de la toxicidad aguda de aguas residuales industriales a través de bioensayos con micro-crustáceos. Tesis Profesional. Fac. de Ciencias, Univ. del Valle; Angulo JA, Angulo W, Zúñiga de Cardoso, MdelC. Evaluación de toxicidad aguda en sedimentos acuosos: Evaluación de toxicidad aguda de efluentes de minas de carbón mediante el uso de bioensayos. Mem. II Seminario Nacional de Limnología. Medellín (Ant.), Colombia; CGA. Estudio del control de la contaminación en la bahía de Cartagena y sus áreas de influencia. Cartagena (Bol.). Inf. Final; Hernández EJ. Contaminación acuática en Colombia (aguas continentales y marinas). UBJTL-Inf. Museo del Mar 1976; 17: Álvarez-León R. Bibliografía sobre la bahía de Cartagena y sus alrededores, hasta septiembre de UBJTL-Inf. Museo del Mar 1979; Chacón MF, Villamarín S. Pruebas de toxicidad aguda L (50) a 24, 48, 72 y 96 horas a partir de efluentes industriales en camarones Penaeus vannamei, P. schmitti y peces (G. affinis). Tesis Profesional. Fac. de Biol. Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Ward GS, Parrish PR. Manual de métodos de investigación del medio ambiente acuático. Parte 6. Ensayos de toxicidad. FAO. Foc. Tec. Pesca 1983; 185: Gutiérrez EA. Bioensayos y pruebas de evaluación toxicológicas. Curso Regional de Entrenamiento PNUMA / PAC / FAO / COI / INDERENA sobre Ensayos Biológicos y Pruebas de Toxicidad como Bases Técnicas para Formular Criterios de Calidad en el Gran Caribe. Cartagena (Bol.), Colombia, junio 11-25; Escobar JJ. Ensayos estándar de toxicidad. Curso Regional CPPS/PNUMA/COI sobre bioensayos y Pruebas de Toxicidad para evaluar el efecto de la contaminación en organismos marinos en la Región del Gran Caribe. Cartagena (Bol.), Colombia; Reish DJ, Oshida PS. Manual of methods in aquatic environment research. Part 10. Short-term static bioassays. FAO. Fish. Tesch. Pap 1977; 247: Mohammad BZ, Garza-Cuevas R, Garza-Almanza V, Landeros-Flores J. Los indicadores biológicos en la evaluación de la contaminación por agroquímicos en ecosistemas acuáticos y asociados Disponible en: Wickins JF. The tolerance of warm-water prawns to recirculated water. Aquaculture 1976; 9:

40 Como citar este artículo: Chacón-Castro MF, Villamarín-Jiménez S, Álvarez-León R. Pruebas de toxicidad aguda CL (I) 50 en camarones marinos (Litopenaeus schmitti y L. vannamei) utilizando efluentes industriales a la Bahía de Cartagena, Colombia. Colombia. Biosalud. 2013;12(2): PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA CL (I) 50 EN CAMARONES MARINOS (Litopenaeus schmitti Y L. vannamei) UTILIZANDO EFLUENTES INDUSTRIALES A LA BAHÍA DE CARTAGENA, COLOMBIA RESUMEN Se efectuaron pruebas de toxicidad con dos efluentes de ALCO Ltda. (Cospique que descarga desechos industriales y Casimiro donde se vierten aguas de enfriamiento), para analizar su efecto en los camarones Litoenaeus schmitti y L. vannamei en un tiempo de 24, 48, 72 y 96 horas de exposición, con sistemas estáticos y sin recambio. En los análisis estadísticos se realizan regresiones por mínimos cuadrados ordinarios para determinar el tiempo letal medio y las curvas de toxicidad, se hallan los valores de la CL (I) 50 con sus límites de confianza bajo el método PROBIT. Con el efluente Cospique los porcentajes (%) y el tiempo de exposición que se encontraron CL (I) 50 fueron de 6,43 en 24 horas, 6,29 en 48 horas, 6,11 en 72 horas y 5,66 en 96 horas sobre L. vannamei; para 24 horas de 7,02; 48 horas de 6,9; 72 horas de 6,92 y 96 horas de 6,71 en L. schmitti. Por tanto, el efluente Cospique es de mayor letalidad, demostrando el efecto inmediato. Para el caso de los efluentes de ALCO Ltda. se encontró que a mayor concentración hay mayor mortalidad y menor tiempo letal medio. Los efluentes industriales estudiados son considerados inestables por la formación de complejos químicos resultado de sus compuestos alcalinos. Palabras clave: bioensayos, toxicidad, efluentes, camarones, Colombia. María Fernanda Chacón-Castro 1 Sandra Villamarín-Jiménez 2 Ricardo Álvarez-León 3 ACUTE TOXICITY TESTS CL (I) 50 IN MARINE SHRIMP (Litopenaeus schmitti AND L. vannamei) USING INDUSTRIAL EFFLUENTS IN THE BAY OF CARTAGENA, COLOMBIA ABSTRACT Toxicity tests were carried out with two effluents of ALCO Ltda. (effluent Cospique which discharges industrial wastes, and effluent Casimiro into which the cooling water is discharged) in order to analyze their effect on Litopenaeus schmitti and L. vannamei shrimp during an exposure period of 24, 48, 72, and 96 hours within static systems and without replacement. Regressions by ordinary minimum quadratic were carried out in the statistical analyses to determine the median lethal time and the toxicity curves. The values for LC (I) 50 and their confidence limits were found using the PROBIT method. With the Casimiro effluent the percentages (%) and the exposure time found LC (I) 50 were 6.43 in 24 hours, 6.29 in 48 hours, 6.11 in 72 hours, and 5.66 in 96 hours for L. vannamei. For L. schmitti the results were 7.02 in 24 hours, 6.9 in 48 hours, 6.92 in 72 hours, and 6.71 in 96 hours of exposure respectively. The above results indicate that effluents Cospique is of a higher lethality, demonstrating its immediate effects. In the case of ALCO Ltda. Effluents it was found that to higher concentrations was highest the mortality and lesser the lethal median time. The industrial effluents studied are considered unstable because of the formation of chemical complexes resulting from their compounds. 1 Bióloga Marina. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Bogotá D.C., Colombia. 2 Bióloga Marina. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Bogotá D.C. Colombia 3 Biólogo Marino. M.Sc. Fundación Verdes Horizontes. Manizales, Caldas, Colombia. Correo electrónico: ricardoalvarezleon@gmail.com Key words: bioassays, toxicity, effluents, shrimps, Colombia. ISSN Recibido: junio 18 de Aceptado: enero 21 de 2014 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

41 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... INTRODUCCIÓN La valoración del impacto ambiental causado por la contaminación del medio natural ha tomado gran importancia durante las últimas décadas, fundamentalmente por el auge industrial que ha desarrollado el hombre a nivel mundial, dando como resultado tanto el vertimiento accidental de desechos durante su manejo, transporte o procesos de tratamiento, como también abiertamente en forma de efluentes residuales (1). La contaminación de los mares causa diversos problemas que solamente una acción nacional e internacional podrá resolver. La prevención de la contaminación de los mares tiende primordialmente a proteger las aguas, la salud pública y los organismos vivos, especialmente los moluscos, crustáceos y peces que se capturan en las pesquerías (2). Las pruebas de toxicidad acuática, son utilizadas para detectar y evaluar los efectos potenciales toxicológicos sobre los organismos acuáticos. Estas pruebas proporcionan información de referencia que se puede utilizar para evaluar los riesgos de los agentes químicos del organismo y las condiciones de exposición (3). Los bioensayos, según la FAO (3) comprenden: [la] prueba en la cual un tejido vivo, un organismo o un grupo de organismos es usado como agente para la determinación de la potencia de alguna sustancia fisiológicamente activa de acción desconocida. Por tanto, los estudios toxicológicos mediante bioensayos y pruebas de toxicidad proporcionan información valiosa en el proceso de evaluación de los riesgos ambientales (4). Hasta mediados de 1984 en Colombia no se habían dictado normas específicas que reglamentaran la máxima concentración permisible de los contaminantes para vertimientos de aguas residuales en las diferentes industrias. El Gobierno colombiano en vista de que en el país existen fuentes receptoras altamente contaminadas por descargas industriales y domésticas, y teniendo en cuenta el crecimiento de nuevas industrias y de la población, expidió el Decreto 1594 de junio 26 de 1984 sobre las concentraciones máximas permisibles de los contaminantes para los vertimientos de aguas residuales industriales. Este trabajo tuvo como objetivo conocer el efecto de los efluentes que ALCO Ltda., vierte a la bahía mediante pruebas de toxicidad aguda, con el fin de determinar la concentración letal inicial que causa el 50% de mortalidad CL (I) 50 a 24, 48, 72 y 96 horas. Estos ensayos actualmente en Colombia son el criterio más utilizado para determinar y comprobar los efectos de la contaminación acuática. Se utilizaron camarones (L. schmitti y L. vannamei) comunes en las costas colombianas; estas especies fueron seleccionadas por la posibilidad de mantener un stock poblacional, por ser fácil el manejo a nivel de laboratorio, y por ser especies de importancia económica. En el país los trabajos sobre bioensayos y pruebas de toxicidad aguda son escasos. Entre los primeros trabajos que incluyeron bioensayos y pruebas de toxicidad aguda sobre especies carcinológicas colombianas, con sistemas estáticos se encuentran los de Arango (5). Posteriormente se realizaron bioensayos para determinar la contaminación en aguas costeras y oceánicas de Colombia (6), se trabajó con tres pesticidas organoclorados (Tordon 101, Stam 100, Celbane 40-20) con y sin aireación y se hallaron las concentraciones letales medias iniciales sobre el camarón nativo de río, Macrobrachium acanthurus (7). Otros autores como Arango y Fonseca (8) realizaron pruebas de toxicidad aguda con metil parathion determinando la CL 50 sobre camarones marinos, Farfantopenaeus duorarum. 41

42 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León Escobar (9) realizó bioensayos y pruebas de toxicidad para evaluar las concentraciones de hidrocarburos en organismos acuáticos y los efectos potenciales de derrames. Cabrales et al. (10) utilizaron bioensayos de toxicidad para obtener los valores del CL 50 a 24, 48 y 96 horas de exposición de crudos venezolanos, y los dispersantes Corexit 7619 y sus respectivas mezclas sobre F. notialis. Amaya y Gutiérrez (11) estudiaron el efecto de mezclas de hidrocarburos derivados del petróleo en F. notialis y varios peces. Martínez (12) desarrolló pruebas de toxicidad con el dispersante Numatrol 220 y su mezcla con el crudo Caño Limón en tres especies marinas; mientras Mosquera (13) realizó las mismas pruebas y además observó la demanda bioquímica de oxígeno. Rolón y Prieto (14) realizaron estudios con el mismo dispersante y su mezcla con el crudo de Orito sobre Litopenaeus. Álvarez y Borda (15) realizaron pruebas de toxicidad crónica con el dispersante Numatrol 220, el Fuel Oil No. 2 y su mezcla sobre la nueva alga Tetraselmis sp. Específicamente sobre efluentes se encuentran los trabajos de Escobar (16), quien realizó estudios de contaminación con efluentes de refinerías sobre sistemas béntónicos del Valle del Magdalena Medio. En la Bahía de Cartagena, Cabrales et al. (10) y Cabrales et al. (17) elaboraron pruebas de toxicidad con métodos estáticos y recambio manual de concentraciones para comprobar los efectos de los efluentes de hidrocarburos aromáticos procedentes de la refinería de ECOPETROL-CAR sobre Litopenaeus schmitti y Dormitator muculatus en 24, 48 y 96 horas de exposición. Cabrales et al. (18) realizaron bioensayos de tolerancia térmica del efluente de CORELCA en la Bahía de Cartagena utilizando F. notialis y Centropomus ensiferus. Martínez (19) trabajó con los efluentes de ALCO Ltda. en las microalgas Tetraselmis chuii y Skeletonema costatum determinando las CL (I) 50 para cada especie. La Bahía de Cartagena está situada en la costa norte del Caribe colombiano entre los 10 o 15 y 10 o 28 N y los 75 o 28 y 75 o 42 W. Tiene una longitud máxima de 15 km y una anchura de 8 km (Figura 1). El volumen de agua es de 122 millones de m 3 y la profundidad promedio es de 16 m. La bahía además presenta áreas de intercambio con el mar abierto de 4000 m 2 en Bocagrande y de 5000 m 2 en Bocachica. En su extremo sur recibe las aguas del Canal del Dique, brazo artificial del río Magdalena, que aporta un volumen promedio de 85 m/seg, y la convierten en un sistema estuarino positivo (20). Sobre la región suroriental se encuentra la Zona Industrial de Mamonal situada a 15 km de la ciudad y con un área de 60 km2, considerada el mayor núcleo de industria química y petroquímica en el país (21). Esta zona vierte en sus aguas residuales, sustancias químicas de diversa naturaleza y composición. Aunque algunas industrias poseen instalaciones para el tratamiento de sus desechos acuosos, otras tienen muelles propios para recibir las materias primas y embarcar los productos elaborados, lo que afecta notablemente la calidad de las aguas de la Bahía de Cartagena. Los efluentes de ALCO Ltda. están localizados en esta zona industrial. De los dos efluentes, uno descarga desechos químicos alcalinos previa sedimentación en extensas lagunas (efluente Cospique), y el otro aguas de enfriamiento (efluente Casimiro). El área de Cospique tiene 134 ha y limita con CORELCA, ATUNCOL y la Bahía de Cartagena. Asimismo, el Caño Casimiro atraviesa las instalaciones de ALCO y llega a la bahía en forma paralela al muelle de la empresa. La zona donde está ubicada esta empresa contiene islotes cubiertos por manglar, los cuales se encuentran aislados, en algunos sectores de la línea de costa del resto de la bahía y se distribuyen entre CORELCA-ALCO y ELECTRIBOL-ALCO- PETROQUÍMICA (Figura 1). 42 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

43 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... Figura 1. Zona Industria de Mamonal (Cartagena, Caribe colombiano) donde se muestran los efluentes de Casimiro y de Cospique. Los bioensayos y las pruebas químicas se llevaron a cabo en los laboratorios del CIP- INDERENA, Regional Bolívar. MATERIALES Y MÉTODOS Después de realizar una salida de reconocimiento con el fin de identificar la posición geográfica y las características físicas de los efluentes Cospique y Casimiro, se observó que Cospique posee tres vertimientos en la bahía que están situados en la margen occidental de la laguna norte de sedimentación 54 (ha) donde se confinan los residuos industriales de ALCO Ltda. Las muestras de efluentes se tomaron en el punto de descarga de la laguna norte de sedimentación con el fin de desarrollar las pruebas de toxicidad aguda, CL (I) 50 a 24, 48, 72 y 96 horas. Para conocer el efecto de este efluente en la bahía, se realizaron transectos longitudinales durante agosto, septiembre y noviembre de 1991, desde la línea de costa hasta el grupo de islas que bordean la zona costera. Estas muestras se tomaron a media agua (1 m) cada 100 m. Se tomaron parámetros físico-químicos in situ (temperatura, salinidad, ph, sólidos y alcalinidad) (22). Al Caño Casimiro, en cambio llegan cuatro (4) afluentes de ALCO Ltda. (aguas de enfriamiento de los procesos industriales). Las muestras del efluente para desarrollar las pruebas de toxicidad aguda CL (I) 50 a 24, 48, 72 y 96 horas se tomaron bajo el puente que se sitúa al sur de la puerta 2 de la empresa. Se realizaron también transectos longitudinales en agosto, septiembre y noviembre de 1991 ubicando estaciones cada 100 m, para observar la dinámica de las concentraciones del efluente a lo largo del caño hasta llegar a la Bahía de Cartagena y se determinaron parámetros físicoquímicos (temperatura, salinidad, ph, sólidos y alcalinidad) (22) (Figura 2). 43

44 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León DISEÑO EXPERIMENTAL Tratamiento de las muestras de los efluentes La recolección de las muestras de los efluentes para las pruebas se llevó a cabo en tanques de plástico amarillos y rojos de 100 l. Temperatura, salinidad y ph se determinaron al llegar al laboratorio. Estas muestras se trabajaron inmediatamente (efluente Casimiro), o se almacenaron en tanques de 100 l para decantarlas por un máximo de 24 horas (efluente Cospique). Las muestras para los análisis químicos (ph, salinidad, conductividad, dureza magnésica y dureza cálcica), se tomaron en envases plásticos. Estos análisis fueron desarrollados por el INDERENA en el laboratorio de química. Por su parte ALCO Ltda. llevaba un registro interno de la caracterización de sus efluentes realizando análisis similares a los realizados en el INDERENA; determinando para el Casimiro: sólidos solubles, insolubles totales, sólidos totales, sólidos sedimentables, cloruros, carbonatos solubles, bicarbonatos solubles, carbonatos insolubles, sulfatos, amoníacos, turbiedad, ph; y para Cospique: sólidos solubles, sólidos en suspensión, sólidos totales, alcalinidad (P, Mg, OH, CO 3 ), dureza cálcica, dureza magnésica, amoníaco, turbiedad y ph. Figura 2. Determinación de la concentración letal media CL (I) 50-48, 72 y 96 horas de exposición del efluente Casimiro vs. L. vannamei (A, B y C) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). Tipos de ensayo Se corrieron ensayos estáticos y sin recambio del efluente durante el transcurso de la prueba con una duración de 96 horas, de acuerdo con Ramírez (1) y Ward y Parrish (25). Se mantuvieron con aireación controlada al mínimo (140 burbujas/minuto), mangueras de silicona y capilares de vidrio. La densidad fue de 10 individuos por acuario (1 ind/2l). Se utilizaron dos baterías cada una constituida por tres hileras de seis acuarios de vidrio de 20 l de capacidad. 44 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

45 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... Preparación del material de laboratorio El protocolo de limpieza que se describe a continuación aseguró un buen grado de descontaminación (23): ü ü Escobilleo con detergente. Enjuague con pequeñas cantidades de HCL y HNO 3 al 10%. ü En el lavado inicial se dejó reposar por 24 horas en la solución ácida para eliminar metales. ü ü Se enjuagó cinco veces con agua potable, eliminando así residuos de detergente y de ácido. Secado libre de polvo atmosférico. Tratamiento de especies Se tuvieron en cuenta los criterios propuestos por la FAO (3), Gutiérrez (23) y Reish y Oshida (24). Las larvas de L. vannamei fueron suministradas por Camarones de Caribe con tallas de 0,6 mm y 1 g de peso, la temperatura 27ºC, salinidad de 31 ups y ph de 7,8. Los de L. schmitti fueron suministrados por la CVS (Corporación Autónoma Regional del Valle del Sinú), con tallas de PL 19, bajo condiciones de temperatura de 16ºC, salinidad de 24 ups y ph de 7,2; los parámetros fueron tomados in situ. Se transportaron en bolsas plásticas de polietíleno de 50 l llenándolas a un volumen de 15 l con agua del estanque y con oxígeno, con una densidad de 10 individuos/l dependiendo del tamaño de estos, evitando siempre su exposición a la luz solar hasta su llegada al laboratorio. Se les adicionó hielo alrededor de las bolsas, para su mayor conservación. Estas bolsas se colocaron en tanques Eternit con capacidad de 1000 l, se abrieron para variar la salinidad paulatinamente 2 a 3 ppm/h hasta 15 ppm, y luego un 1 ppm/h. La temperatura se varió hasta la del ambiente del laboratorio (M. Prieto, com. pers.). Se llevó un registro de la sintomatología presentada por las dos especies bajo los efectos de los efluentes; también se tabularon concentración (%), tiempo (h) y parámetros observados. Para evitar el contagio se procedió a aislar los enfermos del resto del lote. Para el tratamiento de las enfermedades se probaron tres antibióticos. Cloranfenicol: en dilución 3 ppm, con baños de 12 horas. Verde de Malaquita: 0,7 ppm con baños de 24 horas y Azul de Metileno: con dilución de 0,7 ppm, baños de 24 horas (M. J. Torres- Virviescas, com. pers.). El tratamiento fue utilizado hasta la desaparición total de las manchas. Para iniciar los ensayos con estos organismos se dejaron pasar 5 días después del tratamiento. Para evitar la proliferación de microorganismos en el siguiente lote, se esterilizaron los acuarios y todo el material de laboratorio con 200 mg/l de hipoclorito (25). Aclimatación primaria Los camarones trasladados al Centro de Investigaciones Pesqueras CIP-INDERENA, se colocaron en estanques exteriores de cemento con un área de 18 m 2, profundidad de 1,20 m y densidades de 25 ind/m 2 según el tamaño de los animales. Se hicieron recambios según la necesidad del medio durante 15 días, suministrando alimentación diurna de 8 a 9:30 a.m. y nocturna de 4:30 a 5:00 p.m. A veces solo se alimentaron en la mañana, con CAMARONINA 35%. La cantidad dependió de las necesidades del crecimiento. Aclimatación secundaria Los camarones y peces se pasaron después a acuarios de 100 l realizando diariamente recambios de 70% de agua, alimentándolos con CAMARONINA 35% de acuerdo al 1, 2 o 3% de la biomasa total húmeda. Diariamente se midió la temperatura y salinidad, manteniéndose 45

46 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León a condiciones de laboratorio; en un rango de o C y 25 ups. La duración de esta fase fue de 10 días. El alimento se les suspendió 24 horas antes de empezar las pruebas, siguiendo recomendaciones de la FAO (3). Aclimatación terciaria Se inicia con el proceso de traspaso de los animales de aclimatación secundaria a los acuarios de 20 l con agua de dilución en volúmenes previamente establecidos; con aireación controlada y sin alimentación; con temperatura de 26 o C y salinidad de 25 ups, por 24 horas. Pruebas letales Los efluentes se trabajaron como un 100% y por escala aritmética se establecieron cinco concentraciones para cada caso. Estas se diluían con agua de mar debidamente filtrada proveniente del Laguito. Pruebas de búsqueda Los ensayos comenzaron cuando se tuvo contacto de los organismos con el efluente (Cospique o Casimiro según el caso), determinando un tiempo de exposición de 96 horas. Las pruebas se desarrollaron por duplicado y se escogieron cinco concentraciones en la mayoría de los casos, aunque en las pruebas desarrolladas tanto para L. schmitti como para L. vannamei hubo la necesidad de disponer hasta 8 concentraciones (determinadas por modelo aritmético). Para hallar los volúmenes respectivos se utilizó la siguiente fórmula: [ ]* v2 = [ ]2* v1 Donde [ ]1 = Efluente 100% [ ]2 = Concentración escogida V1 = 20 l (Capacidad del acuario) V2 = Volumen necesario de efluente. Estas concentraciones variaron para cada caso y se realizaron con el fin de encontrar rangos más estrechos utilizados en las pruebas definitivas. Se procedió a llenar los acuarios con agua de mar (agua de dilución) al volumen preestablecido, utilizando para ellos balones aforados de 1 y 2 l. Posteriormente se colocaron los organismos (10 por acuario) con aireación mínima controlada 24 horas antes de iniciar la prueba, para minimizar el estrés de los mismos. El efluente se adicionó midiendo el volumen con balones aforados de igual manera que se realizó con el agua de mar. Los volúmenes en mililitros se tomaron con probetas de 250, 500 y 1000 ml, hasta completar el volumen de 20 l. Iniciada la prueba se realizaron observaciones de sintomatología y mortalidades cada hora consecutivamente durante las primeras 12 horas, y posteriormente espaciadas cada 24 horas hasta completar las 96 horas establecidas. Los organismos muertos se retiraron con pinzas metálicas protegidas con cinta aislante y se colocaron en cajas de Petri rotuladas según la concentración y con formol al 10%. Se tomaron parámetros físico-químicos desde las cero horas cada 24 horas. Hasta las 96 horas se midió temperatura (termómetro Silber Brand), salinidad (refractómetro Atago S-10 Salt 10%) y ph (potenciómetro Schott Gerate, tipo ph-meter C67/2). Pruebas definitivas Las pruebas definitivas se desarrollaron por triplicado, con los rangos encontrados en las pruebas de búsqueda. El procedimiento seguido fue el mismo descrito anteriormente para las pruebas de búsqueda. Análisis estadísticos Los análisis estadísticos se basaron en los métodos establecidos en el Curso Regional CPPS / PNUMA, específicamente en los lineamientos de Ramírez (1). Con el método Dosis-Respuesta (PROBIT) se obtuvieron las concentraciones letales medias CL (I) 50 con sus límites de confianza 46 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

47 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... al 95%; teniendo en cuenta el coeficiente de determinación más alto se escogió el modelo de mayor ajuste para estas; se realizaron gráficas de CL (I) 50 (mortalidad vs. concentración) para 24, 48, 72 y 96 horas en todos los casos, excepto para L. vannamei con el efluente Casimiro, donde se graficaron valores desde 48 horas. Se plotearon los puntos observados y se ajustaron las curvas con las ecuaciones respectivas en cada tiempo de exposición. Las regresiones lineales por mínimos cuadrados ordinarios, se determinaron tanto para las ecuaciones de toxicidad como para el tiempo letal medio, cada uno de estos análisis con sus límites de confianza. Para la realización de las gráficas de ecuación de toxicidad (concentración letal vs. tiempo), se tuvo en cuenta que el coeficiente de correlación fuera de 0,95 para cuatro puntos y de 0,97 para tres puntos observados (1). Se llevaron a cabo gráficas del tiempo letal medio (mortalidad vs. tiempo), considerando aquellos valores obtenidos cercanos al 50% de mortalidad. Sintomatología Las observaciones sobre el comportamiento de las especies al ponerlas en contacto con las diferentes concentraciones de los efluentes, se registraron dando a cada una la descripción macroscópica de la reacción, buscando usar los términos más representativos a la reacción observada. En el caso de L. schmitti y L. vannamei se utilizaron 9 grupos de características (nado, tegumento, movimientos de los pereiópodos, movimientos de los pedúnculos oculares, mudas, canibalismo, espasmos, estrés, localización en el acuario) y 9 sub-características. Enfermedades RESULTADOS En los camarones L. vannamei se presentó una serie de manchas negras sobre el telson y el caparazón, que corresponden a síntomas de la enfermedad de black-spot. Como se mencionó en la metodología, se utilizaron tres antibióticos de los cuales el Verde de Malaquita presentó mejores resultados. Parámetros físico-químicos Los parámetros físico-químicos iniciales de los efluentes en las especies utilizadas oscilaron en un rango de 9,5-12,0 para ph; temperatura de 29 o -31 o y salinidad de ups para el efluente Casimiro; de 11,2-12 en ph, de 27 o -31 o en temperatura y de ups en salinidad para el efluente Cospique (Tabla 1). Tabla 1. Parámetros fisicoquímicos iniciales de los efluentes de ALCO Ltda. para las pruebas definitivas Efluente Especie Parámetros Fechas ph T (ºC) S (ups) M-D-A Casimiro L. vannamei 9, Casimiro L. schmitti 10, Cospique L. vannamei 11, Cospique L. schmitti 11,

48 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León Se tomaron variables físico-químicas y los parámetros determinados durante las pruebas definitivas con las diferentes especies. Los rangos de estos resultados se sintetizan en la Tabla 2. Concentraciones letales Para el efluente Casimiro las CL (I) 50 y sus límites de confianza se sintetizan en la Tabla 3. En L. vannamei se grafican los valores correspondientes a 48, 72 y 96 horas, sin incluir las de 24 horas por no alcanzarse el 50% de mortalidad (Figura 3). Para L. schmitti (Figura 4); estas últimas registrando valores desde 24 horas hasta 96 horas. Las CL (I) 50 y sus límites de confianza para el efluente Cospique se describen en la Tabla 4. Los valores correspondiente a L. vannamei y L. schmitti se presentan en las Figuras 5 y 6 respectivamente. Figura 3. Determinación de la concentración letal media CL (I) y 48 horas de exposición del efluente Casimiro vs. L. schmitti (A y B), y CL (I) y 96 horas (C y D) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). 48 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

49 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... Figura 4. Determinación de la concentración letal media CL (I) y 48 horas de exposición del efluente Cospique vs. L. vannamei (A y B) y CL (I) y 96 horas (C y D) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). Figura 5. Determinación de la concentración letal media CL (I) y 48 horas de exposición del efluente Cospique vs. L. schmitti (A y B), y CL (I) y 96 horas (C y D) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). 49

50 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León Figura 6. Tiempo letal medio TL (I) 50 para la prueba definitiva del efluente Casimiro vs. L. vannamei (A) y del efluente Casimiro vs. P. schmitti (B) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). Tiempo letal medio Se determinó el tiempo letal medio por mínimos cuadrados ordinarios de L. vannamei y L. schmitti con cada efluente, cuyos resultados se presentan en las Figuras 7 y 8. Ecuaciones de toxicidad Los valores de las ecuaciones de toxicidad se presentan en la Tabla 8. Figura 7. Tiempo letal medio TL (I) 50 para la prueba definitiva del efluente Cospique vs. L. vannamei a una concentración de 6,5% (A), del efluente Cospique vs. L. schmitti a una concentración de 6,7% (B) y del efluente Cospique vs. L. schmitti a una concentración de 7,4% (C) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). 50 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

51 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... Figura 8. Tiempo letal medio TL (I) 50 para la prueba definitiva del efluente Cospique vs. L. vannamei a una concentración de 6,5% (A), del efluente Cospique vs. L. schmitti a una concentración de 6,7% (B) y del efluente Cospique vs. L. schmitti a una concentración de 7,4% (C) (* mortalidad observada; --- mortalidad ajustada). Sintomatología Los datos de sintomatología observados en cada una de las pruebas y para cada una de las especies aparecen en las Tablas 5 y 6. Efluente Casimiro DISCUSIÓN Como se describió en la metodología, el Caño Casimiro es el resultado de las aguas de enfriamiento que utiliza la empresa para sus procesos y la vertiente natural que nace en Turbaná y recorre la zona industrial por su margen oriental. El efluente Casimiro es de composición química inestable, pudiéndose incluso percibir fuertes olores a amoníaco en la zona donde se tomaron las muestras, dicho olor disminuye o desaparece en la época de invierno; contiene sólidos en suspensión que le dan apariencia lodosa. Respecto a los parámetros físico-químicos iniciales a las pruebas realizadas se observaron rangos de ph entre 9-10,4; temperatura entre o C y salinidad entre ups en la mayoría de las pruebas, aunque para la definitiva de L. schmitti la salinidad registrada fue de 24 ppm (Tabla 1). 51

52 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León En las pruebas tanto de búsqueda como en las definitivas, estos parámetros se mantuvieron en los siguientes rangos: ph entre 7,2-9,1; temperatura entre 26 o -33 o C y salinidad de ups (Tabla 2). Tabla 2. Síntesis del rango de los parámetros físico-químicos de las pruebas definitivas con los efluentes ALCO Ltda. Efluente Especie Parámetros Fechas ph T (ºC) S (ups) M-D-A Casimiro L. vannamei 7,3-9,1 26,0-28, Casimiro L. schmitti 7,2-8,6 26,5-33, Cospique L. vannamei 7,3-9,8 26,0-28, Cospique L. schmitti 7,2-9,9 26,0-26, Por la inestabilidad del efluente se dificultó en gran medida la ubicación de los rangos de las concentraciones a escoger; las búsquedas arrojaron resultados antagónicos y por ello la necesidad de realizar 2 o 3 pruebas para asegurar las concentraciones de las definitivas por no encontrarse correlación en los resultados obtenidos en las búsquedas; fue el caso para L. schmitti donde se utilizaron ocho concentraciones para cada prueba. Las concentraciones letales donde se presenta una mortalidad del 50% para L. schmitti y L. vannamei (Tabla 3) corroboran la similitud de los rangos entre las pruebas, determinándose así la letalidad del efluente con un 25% en promedio. Es importante anotar los efectos sintomatológicos observados en el transcurso de las pruebas; primero se observó una reacción inmediata de los organismos al contacto con el efluente, presentándose movimientos acelerados, estrés, nado errático y en algunos casos cambios en la pigmentación y otra serie de síntomas que se describen en las Tablas 5 y 6, posteriormente los organismos muestran una adaptabilidad progresiva al efluente. Es importante resaltar nuevamente que aunque todos los coeficientes de correlación estuvieron por encima de 0,8 no se considera conveniente realizar gráficas para 3 o 4 puntos con coeficientes por debajo de 0,97 y 0,95 respectivamente, por no ser significativos a un 95% de confiabilidad. Tabla 3. Síntesis de las CL (I) 50 y sus límites de confianza para las pruebas definitivas con el efluente Casimiro a 24, 48, 72 y 96 horas Prueba definitiva efluente Casimiro vs. Litopenaeus vannamei Tiempo Modelo CL (I) 50 Límite sup. Límite inf LOGIT LOG 19,958 20,490 19, LOGIT 19,613 20,141 19, LOGIT 19,666 20,231 19,101 Prueba definitiva efluente Casimiro vs. Litopenaeus schmitti Tiempo Modelo CL (I) 50 Límite sup. Límite inf. 24 LOGIT 28,087 28,852 27, PROBIT 25,955 25,457 25, LOGIT 25,310 25,891 24, LOGIT 25,135 25,685 24, Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

53 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... Los sólidos en suspensión producen obstrucción en las branquias de los organismos y molestias a nivel del pedúnculo óptico. Con el tiempo letal medio se determinó que a altas concentraciones, se alcanza el 50% de mortalidad en un corto tiempo, mientras que para las concentraciones más bajas este tiempo es muy prolongado; de tal manera que la mortalidad muestra dependencia tanto por la concentración del tóxico, como por el tiempo de exposición al mismo. En L. vannamei a una concentración de 20,33% el tiempo letal medio es de 32,09 horas (Figura 8); los valores del tiempo letal para las demás concentraciones propuestas no se adicionaron debido a que los datos de mortalidad encontrados fueron muy estrechos y no es factible extrapolarlos para la determinación del TI (50). De esta manera se procedió en el análisis de las demás especies con respecto a estas regresiones. En L. schmitti el TI (50) encontrado fue de 35,70 horas para la concentración de 28% (Figura 8), para la concentración del 30% al TI (50) se halló por debajo de las 12 horas. Tabla 4. Síntesis de las CL (I) 50 y sus límites de confianza para las pruebas definitivas con el efluente Cospique a 24, 48, 72, 96 horas Prueba definitiva efluente Cospique vs. Litopenaeus vannamei Tiempo Modelo CL (I) 50 Límite sup. Límite inf. 24 LOGIT 6,410 6,707 6, LOGIT LOG 6,287 6,530 6, LOGIT 6,105 6,485 5, PROBIT 5,655 6,097 5,213 Prueba definitiva efluente Cospique vs. Litopenaeus schmitt Tiempo Modelo CL (I) 50 Límite sup. Límite inf. 24 LOGIT 7,020 7,151 6, LOGIT 6,904 7,042 6, LOGIT 6,918 7,061 6, LOGIT 6,711 6,884 6,537 Es importante aclarar que el modelo exponencial es un modelo deductivo que se ajusta tanto en el medio natural como en el laboratorio, aunque para el efecto de este trabajo se escogieron aquellos modelos que por coeficiente de determinación resultaron de mejor ajuste, siendo esto una elección de tipo inductivo (1). Efluente Cospique Al igual que el efluente Casimiro, este efluente también se caracterizó por su inestabilidad química y presencia de sólidos en suspensión, pero su coloración es blancuzca debido a las altas concentraciones de magnesio y calcio. Es de textura viscosa y suave, a medida que se sedimenta el color se aclara; en el laboratorio se trató de simular lo que en realidad sucede en la laguna de sedimentación y así evitar nuevas interferencias a nivel del verdadero efluente a través de los tres vertederos a la Bahía de Cartagena. Los rangos de los parámetros físicoquímicos del afluente inicial fueron: ph entre 11,2-11,8; temperatura entre 27 o -31 o C y salinidad entre 87 y 92 ups (Tabla 1). 53

54 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León Tabla 5. Sintomatología observada en L. vannamei con aguas del efluente Casimiro y Cospique (x = presencia; - = ausencia) SINTOMATOLOGÍA Control 3,75% 4,85% 5,40% 5,96% 6,51% Horas Nado Normal - - x (12-24) x (12-48,72) x (12-24) x (12) Acelerado x (12-24) x (12) Errático x (24-48) - - Circular Contra Acuario x (12-96) x (12-24) x (12) - Tegumento Cambio Pigmentación x (24-48) x (12-24) x (12) - Mov. Pereiópodos Acelerado - x (12) x (12) x (12-48) x (12-24) x (12) - Mov. Pedúnculos Oculares - Mudas - Canibalismo x (12) x (12) - Espasmos - Estrés - Localización Superficie x (12-96) x (12-96) x (12-96) x (12-48) x (12) - Media agua x (12-96) x (12-96) x (12-96) x (12-48) x (12) - Fondo Durante las pruebas los parámetros de ph, temperatura y salinidad registraron rangos de 7,2-9,8; o C y ups respectivamente (Tabla 2). El ph en el momento de iniciada la prueba fue muy alto (9,8) y a medida que transcurrió la misma se observó su disminución en 3 o 4 unidades, debido a la presencia de materias fecales excretadas por los organismos y a la disolución de sales; mientras que la temperatura y la salinidad se mantienen en los mismos rangos, variando de 1 a 2ºC o 1 a 2 ups. Los camarones son muy sensibles a este efluente, esto se observó en los rangos de las concentraciones para las pruebas definitivas (3,75 a 6,51%) con L. vannamei y 4,7-7,4% con L. schmitti. Las concentraciones letales se determinaron entre 6,4-5,6% para L. vannamei y de 7,02-6,7% para L. schmitti confirmándose la letalidad del efluente desde bajas concentraciones. La respuesta de los diferentes organismos al efluente fue también inmediata como en el caso de Casimiro, presentándose estrés, nado errático, espasmos y específicamente en este efluente se notó muy marcadamente la rapidez en el cambio de mudas, desde las concentraciones más altas a las más bajas por los altos porcentajes de salinidad. Se apreció muy frecuentemente que, en los camarones, el efluente produce escozor a nivel de la epidermis, esta observación se confirmó posteriormente puesto que los organismos muertos presentaron resequedad en esta (Tablas 5 y 6). 54 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

55 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... Tabla 6. Sintomatología observada en L. schmitti con aguas del efluente Casimiro y Cospique (x = presencia; - =ausencia) SINTOMATOLOGÍA Control 3,75% 4,85% 5,40% 5,96% 6,51% Horas Nado Normal - - x (12-24) x (12-48,72) x (12-24) x (12) Acelerado x (12-24) x (12) Errático x (24-48) - - Circular Contra Acuario x (12-96) x (12-24) x (12) - Tegumento Cambio Pigment x (24-48) x (12-24) x (12) - Mov. Pereiópodos Acelerado - x (12) x (12) x (12-48) x (12-24) x (12) - Mov. Pedúnculos Oculares - Mudas - Canibalismo x (12) x (12) - Espasmos - Estrés - Localización Superficie x (12-96) x (12-96) x (12-96) x (12-48) x (12) - Media agua x (12-96) x (12-96) x (12-96) x (12-48) x (12) - Fondo Tabla 7. Análisis de regresión para determinar la ecuación de toxicidad Efluente Especie Modelo Coeficiente Ecuación de toxicidad de correlación Casimiro L. vannamei LO 0, Log Y = 21,643 + (-10,030499) Log X Casimiro L. schmitti E 0, Log Y = log 28, (-14798E-03) X Cospique L. vannamei LI 0, Log Y = 6,735 + (-10,330E-02) X Cospique L. schmitti LI 0, Log Y = 7,125 + (-3,916677E-03) X El efecto inmediato del efluente se determinó para las primeras 24 horas, puesto que como en el Casimiro los organismos sobrevivientes en las pruebas alcanzaron adaptabilidad en este medio, hecho que se confirma en la gráfica de la curva de toxicidad de L. vannamei con coeficiente de correlación de 0,97 (Figura 7). Con respecto al tiempo letal medio se puede mencionar que a mayor concentración el valor de este parámetro se alcanza en un tiempo corto, mientras que a menor concentración este tiempo es difícil de lograr. Al igual que para el efluente Casimiro, en Cospique se encontraron rangos muy estrechos en la mayoría de las concentraciones en todas las especies con excepción de 6,5% en L. vannamei que fue de 18,48 horas y en L. schmitti para 7,4% de 11,20 horas. Aunque los efluentes Casimiro y Cospique son de diferente composición química se comportan de manera similar, ya que se observan efectos letales inmediatos donde a mayor tiempo de exposición se reduce la tasa de mortalidad, presumiblemente porque las fracciones más 55

56 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León tóxicas se evaporan, oxidan o degradan en el medio. En las normas de vertimiento del Decreto 1594 de 1984, los rangos permisibles de contaminación con respecto al ph se establecen entre 5 y 9 unidades; dichos niveles se sobrepasan tanto en las pruebas definitivas como en las estaciones realizadas para las radiales de los efluentes estudiados. Infortunadamente no existen trabajos similares en cuanto a la naturaleza de los efluentes, a excepción del realizado por Martínez (19) con los mismos efluentes de ALCO Ltda. y utilizando las microalgas marinas Skeletonema costatum y Tetraselmis chuii en el cual se obtuvieron resultados muy similares. En el área de estudio, también Cabrales et al. (18) realizaron bioensayos y pruebas de tolerancia térmica con el efluente de TERMOCARTAGENA, utilizando camarones (Farfantepenaeus notialis) y róbalos (Centropomus ensiferus). Los organismos estuarinos y marinos, utilizados en la presente contribución, no habían sido usados como bioindicadores, por ello esta contribución es pionera en Colombia. CONCLUSIONES El efecto tóxico de los efluentes (Casimiro y Cospique) es de acción inmediata, en camarones, los cuales muestran gran susceptibilidad. A medida que transcurre el tiempo se reduce la tasa de mortalidad de los organismos expuestos, lo que indica que presumiblemente hay pérdida de las fracciones más tóxicas. Los efluentes industriales estudiados en el presente trabajo se consideran inestables, resultado de la complejidad de compuestos y los caudales diferentes que allí se vierten, por lo que los resultados encontrados son representativos de unas condiciones particulares del mismo. La concentración letal sobre L. vannamei se presenta en un rango de 19,67-19,96% y en L. schmitti de 25,14-28,09% con el efluente Casimiro. Con el efluente Cospique sobre L. vannamei la CL (I) 50 fue de 5,65-6,43% y en L. schmitti fue de 6,71-7,02%, indicando de esta manera que Cospique tiene una letalidad aproximadamente de 2 a 3 veces mayor que Casimiro. El tiempo letal medio para el efluente Casimiro sobre L. vannamei en las concentraciones de 20,33% y 28% es 32,09 y 35,70 horas respectivamente; en L. schmitti a 30% es de 7,6 horas. En el efluente Cospique el tiempo letal medio sobre L. vannamei en 6,5% es 18,48 horas; en L. schmitti para 7,4% es 11,20 horas; indicando que para el caso de los efluentes industriales de ALCO Ltda. a mayor concentración letal, mayor mortalidad y menor tiempo letal medio. La línea recta que se observa en la curva de toxicidad del efluente Cospique vs. L. vannamei indica que a mayor unidad de tiempo la concentración letal presenta una reducción constante; demostrando de esta manera la acción inmediata de los efluentes. Los rangos de ph de los efluentes industriales de ALCO Ltda. medidos en las pruebas definitivas con L. vannamei y L. schmitti sobrepasan el rango (5-9 unidades) estipulado en el Decreto 1594 de La reacción de los organismos expuestos a los efluentes de ALCO Ltda. fue inmediata y constante hasta las 48 horas de exposición, a partir de las cuales se presentó una aparente adaptación de los mismo al medio; determinándose que no se produce aumento en el efecto tóxico de los efluentes. Los organismos utilizados (L. schmitti y L. vannamei) se comportan como bioindicadores ante los contaminantes (aguas calientes y compuestos alcalinos) de los dos efluentes industriales evaluados, de acuerdo a los criterios de Mohammad et al. (26) y Wickins (27). Infortunadamente no existen trabajos similares en cuanto a la naturaleza de los efluentes, al 56 Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

57 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei)... área de estudio, a las sustancias presentes, ni a los organismos utilizados (estuarinos y marinos), por ello esta contribución es pionera en Colombia y en el exterior. AGRADECIMIENTO en los muestreos y en la información básica suministrada. A la dirección regional del INDERENA, a los colegas J. Álvarez, A. Martínez, M. Prieto, y O. Gutiérrez por su apoyo en la parte experimental, y a A. Ramírez por sus sugerencias y comentarios en el análisis de resultados. A las directivas del IFI y de ALCO Ltda. Planta de Cartagena por su colaboración 57

58 María Fernanda Chacón-Castro, Sandra Villamarín-Jiménez, Ricardo Álvarez-León BIBLIOGRAFÍA 1. Ramírez A. Fundamentos cuantitativos para realizar ensayos biológicos y pruebas de toxicidad. Curso Regional de Entrenamiento PNUMA / PAC / COI / INDERENA sobre Ensayos Biológicos de Toxicidad en el Gran Caribe. Cartagena (Bol.), Colombia, junio 1-25; Alcázar F. Toxicidad y efectividad del dispersante SEAF-014 MOLYPAC Ltda. Dpto. de Oceanología, Univ. Chile. Sede Valparaíso, Montemar (Chile); FAO. Manual de métodos de investigación del medio ambiente acuático. Parte 4a. Base para la elección de ensayos biológicos para evaluar la contaminación marina. FAO. Doc. Téc. Pesca 1981; 164: Rand GM, Petrocelli M. Fundamentals of aquatic toxicology: Methods and applications. Hemisphere Publ Corp Washington (USA); Arango H. Concentración letal media del azul de metileno sobre larvas de Penaeus duorarum. INDERENA-CIP, Laboratorio de Ensayos Biológicos. Cartagena (Bol.). Inf. Técnico 1978; Escobar JJ. Determinación de los niveles de seguridad mediante bioensayos en la contaminación acuática de Colombia, aguas oceánicas y costeras. Proyecto de Investigaciones INDERENA / FUNDEMAR / COLCIENCIAS. Cartagena (Bol.); Arévalo LM, Rolón ME, García ME. Concentración letal media inicial LC(I)50 de TORDON 101, STAM 100 y CELBANE sobre Macrobrachium acanthurus (Wiegman, 1836). Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Arango H, Fonseca C. Determinación del LC50 sobre juveniles de Penaeus duorarum, cultivados en laboratorio a partir de METIL PARATHION. INDERENA-Rev. Divulgación Pesquera 1981; 17(1): Escobar JJ. Bioensayos y pruebas de toxicidad para evaluar el efecto de la contaminación acuática de los organismos hidrobiológicos y los efectos tóxicos de los derrames de hidrocarburos. INDERENA- Subgerencia Medio Ambiente. Bogotá D.E., Inf. Técnico Cabrales OR, García S, Del Valle L, Rojas S. Bioensayos y pruebas de toxicidad con crudos utilizados por ECOPETROL, dispersante (COREXIT 9527, COREVIT 7664) y sus mezclas respectivas. INDERENA / ECOPETROL Cartagena (Bol.). Inf. Técnico 1984; Amaya MJ, Gutiérrez E. Evaluación de los hidrocarburos derivados del petróleo en la Bahía de Cartagena en 1983 y algunos de sus efectos tóxicos. Tesis Profesional. Fac. Biol. Marina, Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Martínez DL. Efectividad y pruebas de toxicidad del dispersante NUMATROL 220 y su mezcla con el crudo Caño Limón en tres especies marinas. Tesis Profesional. Fac. de Biología, Universidad del Valle; Mosquera AI. Demanda bioquímica de oxigeno (DBO) y toxicidad del crudo Caño Limón y su mezcla con el dispersante NEUMATROL 220 en tres especies marinas. Tesis Profesional. Facultad de Ciencias, Univ. del Valle; Rolón S, Prieto CL. Pruebas de toxicidad y análisis cuantitativo del dispersante NUMATROL 220 y su mezcla con el crudo Orito sobre un macrocrustáceo del género Litopenaeus. Tesis Profesional. Fac. de Biología, Univ. Nal. de Colombia; Álvarez J, Borda LB. Pruebas de toxicidad crónica con un dispersante, el FUEL-OIL No. 2 y su mezcla respectiva sobre la especie de microalga Clorophyta Tetraselmis sp. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Escobar JJ. Contribución al conocimiento de la contaminación con efluentes de refinería en dos sistemas lénticos del Valle del Magdalena Medio. Tesis Profesional. Fac. de Biología Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Cabrales OR, García S, Del Valle L, Ocaña M. Estudio ecológico de las áreas de influencia de ECOPETROL sobre la Bahía de Cartagena - Fase IV, Parte 1: Bioensayos con compuestos cíclicos y efluentes de ECOPETROL en la Bahía. INDERENA / ECOPETROL. Cartagena (Bol.). Inf. Final 1982; Biosalud, Volumen 12 No.2, julio - diciembre, págs ISSN

59 Pruebas de toxicidad aguda cl (i) 50 en camarones marinos (litopenaeus schmitti y l. Vannamei) Cabrales OR, Del Valle L, García S. Bioensayos y pruebas de tolerancia térmica sobre el efluente de la Corporación Eléctrica de la Costa Atlántica CORELCA / TERMOCARTAGENA / INDERENA. Cartagena (Bol.). Inf. Técnico Martínez A. Pruebas de toxicidad subletales con los efluentes de Alcalis de Colombia Ltda. en las microalgas marinas Skeletonema costatum y Tetraselmis chuii a 96 y 120 horas respectivamente. INDERENA-CIP Cartagena (Bol.). Inf. Técnico CGA. Estudio del control de la contaminación en la Bahía de Cartagena y sus áreas de influencia. Cartagena (Bol.). Inf. Final Hernández EJ. Contaminación acuática en Colombia (aguas continentales y marinas). UBJTL-Inf. Museo del Mar 1976; 17: Chacón MF, Villamarín-Jiménez S. Pruebas de toxicidad aguda L (50) a 24, 48, 72 y 96 horas a partir de efluentes industriales en camarones Penaeus vannamei, P. schmitti y peces (Gambusia affinis). Tesis Profesional. Fac. de Biol. Marina, Univ. de Bogotá Jorge Tadeo Lozano; Gutiérrez EA. Bioensayos y pruebas de evaluación toxicológicas. Curso Regional de Entrenamiento INDERENA / PAC / PNUMA / COI sobre Ensayos Biológicos y Pruebas de Toxicidad en el Gran Caribe. Tomo 2. Cartagena (Bol.), Colombia; Reish DJ, Oshida LS. Manual of methods in aquatic environment research. Part 10. Short-term static bioassays. FAO. Fish Tech. Pap. 1977; 247: Ward GS, Parrish LR. Manual de métodos de investigación del medio ambiente acuático. Parte 6. Ensayos de toxicidad. FAO. Doc. Tec. Pesca 1983; 185:1-25. Mohammad BZ, Garza-Cuevas R, Garza-Almanza V, Landeros-Flores J. Los indicadores biológicos en la evaluación de la contaminación por agroquímicos en ecosistemas acuáticos y asociados Disponible en: Wickins J.F. The tolerance of warm-water prawns to recirculated water. Aquaculture 1976; 9:

60 Como citar este artículo: Osorio JH, Suárez YJ, Pérez JE. Comparación de dos métodos para la determinación de los niveles de colesterol HDL en caninos. Biosalud. 2013;12(2): COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL HDL EN CANINOS José Henry Osorio 1 Yirly Johanna Suárez 2 Jorge Enrique Pérez 3 RESUMEN Objetivo: Comparar el método directo y el método de precipitación para la medición del colesterol HDL en caninos. Materiales y Métodos: Se obtuvieron muestras de sangre de 156 caninos, en estado de ayuno, de las cuales se seleccionaron 30 al azar de diferentes edades, sin discriminación de sexo ni edad. Después de obtener el suero se determinaron los niveles de colesterol HDL mediante el método directo, posteriormente fueron obtenidos los niveles de colesterol HDL utilizando el método de precipitación. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de una vía. Resultados: El método directo reportó valores (mg/dl) de media, desviación estándar, rango mínimo y máximo de: 144,435; 33,532; 77,676; 197,594 respectivamente; mediante el método de precipitación se obtuvieron valores (mg/dl) de media, desviación estándar, rango mínimo y máximo de: 133,337; 36,727; 81,457; 242,724 respectivamente. El valor P del test F es mayor o igual a 0,05 (0,627), por lo cual, no se evidencia diferencia estadísticamente significativa con un nivel de confidencia del 95% entre los valores obtenidos por los dos métodos. Conclusión: Al no existir diferencia significativa, puede ser utilizado cualquiera de los dos métodos analizados para la determinación del colesterol HDL en esta especie. Palabras clave: lípidos, metabolismo, perros. COMPARISON OF TWO METHODS FOR DETERMINING HDL CHOLESTEROL LEVELS IN CANINES ABSTRACT Objective: To compare the direct method and the precipitation method for the measurement of HDL cholesterol in canines. Materials and Methods: Blood samples of 156 fasting dogs were obtained from which 30 from different ages were randomly chosen without discrimination by sex or age. After serum extraction, levels of HDL cholesterol were determined by the direct method and and by the precipitation method. The results were statistically analyzed using one way ANOVA. Results: The values obtained by the direct method in mg/dl for media, minimal and maximal range, and standard deviation were 144,435; 33,532; 77,676; 197,594 respectively. Using the precipitation method, the values for media, minimal and maximal range, and standard deviation were: 133,337; 36,727; 81,457; and 242,724 respectively. The P value for the F test was greater or equal to 0.05 (0.627) without significant statistical difference between the two analyzed methods with a confidence level of 95% between the values obtained in both methods. Conclusion: Since there is not a significant difference, either of the analyzed methods for determining HDL cholesterol in this species can be used. Key words: lipids, metabolism, dogs. 1 Laboratorio de Investigación en Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia. Autor para correspondencia: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co 2 Programa Jóvenes Investigadores de Colciencias, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia. 3 Laboratorio de Microbiología, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. ISSN Recibido: diciembre 20 de Aceptado: enero 30 de 2014 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

61 Comparación de dos métodos para la determinación de los niveles de colesterol HDL en caninos INTRODUCCIÓN Las lipoproteínas (LP) se caracterizan por ser macromoléculas que permiten trasportar los lípidos en el plasma puesto que estos son insolubles en agua y no pueden ser trasportados en soluciones acuosas. Las más conocidas son los quilomicrones (Q), lipoproteínas de muy baja densidad (very low density lipoproteins, VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (intermediate density lipoprotein, IDL), lipoproteínas de baja densidad (low density lipoproteins, LDL) y lipoproteínas de alta densidad (high density lipoproteins, HDL) (1-5). Dado que ninguna especie es exactamente igual a otra en su metabolismo lipídico, se ha propuesto agruparlas en dos grandes patrones, con base a características similares. El patrón LDL-C (LDL-C > HDL-C) incluye a las especies donde la mayor parte del colesterol total (CT) es transportado por LDL-C (seres humanos adultos, cerdos, monos, conejos, cobayos, hámsters y otros de vida silvestre). El patrón HDL-C (HDL-C > LDL-C) involucra a los animales donde la mayor parte del CT es transportado por HDL-C (bovinos, equinos, caninos, felinos, ratones y ratas). El ser humano recién nacido respondería al patrón HDL-C, resistente a la aterogénesis. En años recientes, se ha logrado que ratones transgénicos cambien su patrón HDL-C por LDL-C, por lo que desarrollan aterosclerosis. Para llegar a diagnósticos de dislipidemias no es suficiente conocer la tasa de CT, sino esclarecer el tipo de lipoproteína que lo está transportando. En la actualidad es rutina medir la cantidad de colesterol ligado a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) y de baja densidad (LDL-C) (6). Las LP se caracterizan por estar formadas por triglicéridos, ésteres de colesterol, fosfolípidos, colesterol libre y proteínas (5, 7-10). Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son producidas en el hígado y en el intestino a partir del catabolismo de las lipoproteínas ricas en triglicéridos; al principio se denominan HDL discoidales y luego de ser secretadas al plasma reciben el nombre de HDL esféricas. Ambas contienen lecitina, lecitin-colesterol acil-transferasa (LCAT) y apoproteínas; estas últimas son proteínas que facilitan el transporte de los lípidos, ayudan al mantenimiento de la integridad estructural y a la activación de ciertas enzimas que desempeñan un papel clave en el metabolismo de los lípidos (3, 11, 12). Además, las HDL ayudan a eliminar el exceso de colesterol, trasladando de los tejidos extrahepáticos al hígado mediante el proceso de transporte inverso del colesterol que se considera esencial para el mantenimiento del equilibrio de los esteroles (2). El proceso del transporte inverso del colesterol se da cuando las células extra hepáticas acumulan el colesterol a través de la absorción de lipoproteínas de baja densidad (LDL), luego este colesterol libre es adquirido por HDL pobres en lípidos, que por acción de la LCAT se transforma en ésteres de colesterol, los cuales pueden ser transferidos de las HDL a las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) a través de la proteína transferidora de ésteres de colesterol CETP. Estos residuos van al hígado, donde pueden ser excretados a la bilis en forma de ácidos biliares o de colesterol libre, teniendo la posibilidad de ser reabsorbidos por el intestino o excretados con las heces (2, 3, 11, 13). Por tal motivo, las HDL juegan un papel importante en los humanos al eliminar el colesterol de la pared arterial y como factor de predicción al disminuir el riesgo de aterosclerosis cuando una placa de grasa se deposita en la pared de las arterias. En el caso de los perros, en los que predomina esta LP, se cree que estos son más resistentes a la ateroesclerosis (1, 14, 15). Las HDL se pueden fraccionar en un grupo heterogéneo de partículas (HDL-1, HDL-2 y HDL-3); en caninos la HDL-1 tiene igual tamaño que la LDL y es diferente a otras LP de otros animales, la HDL-2 es la más abundante en esta especie, además es la más pequeña, densa y de migración más rápida 61

62 José Henry Osorio, Yirly Johanna Suárez, Jorge Enrique Pérez de otras especies como por ejemplo el gato y el ser humano, las HDL-3 son menores pero más densas (16). Las HDL nacientes son aquellas recién sintetizadas por el hígado o por el intestino delgado, también son discoidales, sirven como donantes y aceptadoras de apolipoproteínas C, apo E, y varios lípidos de otras lipoproteínas en la circulación (3, 11). Las apoproteinas más comunes del HDL son la apoai, apoa-ii y apoc; cuando presentan niveles elevados en los humanos, son asociadas a enfermedades cardiovasculares y a la diabetes (10, 17). Debido que en el mercado se encuentran dos métodos disponibles que determinan el colesterol HDL, el método directo y el método de precipitación, el presente trabajo tuvo como objetivo comparar los dos métodos, para la determinación del colesterol HDL en caninos. MATERIALES Y MÉTODOS Fueron tomadas en estado de ayuno, muestras de sangre de 156 caninos criollos o sus cruces, de las cuales se seleccionaron 30 al azar, de diferentes edades sin discriminación del sexo. Luego de obtener el suero, fueron determinados los niveles de colesterol HDL mediante un método directo (18), cuyo fundamento es el siguiente: el colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones son hidrolizados por la colesterol oxidasa mediante una reacción enzimática acelerada no formadora de color. Posteriormente, se solubiliza el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) de la muestra en presencia de un detergente, para ser cuantificado espectrofotométricamente. Luego, fueron determinados los niveles de colesterol HDL utilizando el método de precipitación (19), cuyo fundamento es el siguiente: las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), y de baja densidad (LDL) presentes en la muestra, precipitan en presencia de fosfotungstato e iones magnesio. El sobrenadante contiene las lipoproteínas de alta densidad (HDL), cuyo colesterol se cuantifica espectrofotométricamente. Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de una vía, utilizando el programa Statgraphics Plus 5.1. RESULTADOS El método directo reportó valores (mg/dl) de promedio, varianza, desviación estándar, rango mínimo y máximo de 144,435; 1124,413; 33,532; 77,676; 197,594 respectivamente, con el método de precipitación se obtuvieron valores (mg/dl) de promedio, varianza, desviación estándar, rango mínimo y máximo de 133,337; 1348,863; 36,726; 81,457; 242,724 respectivamente. Al comparar los dos métodos mediante el ANOVA de una vía, el p-valor del test F fue de 0,627 (p > 0,05), por lo tanto, no se evidencian diferencias estadísticamente significativa en el análisis realizado, con un nivel de confianza del 95% entre los valores obtenidos (ver Tabla 1). Tabla 1. Comparación del método directo y el método de precipitación para la determinación del colesterol HDL en Canis lupus familiaris COLESTEROL HDL Método directo Método de precipitación Media 144, ,337 Desv 33,532 36,727 Mínimo 77, ,457 Máximo 197, ,724 Desv: desviación estándar. DISCUSIÓN P-valor 0,627 Hoy en día es importante la determinación del colesterol HDL en las diferentes especies, sean patrón LDL (humanos) o patrón HDL (caninos) ya que esta LP es beneficiosa no solo porque regula el metabolismo lipídico, sino debido a que disminuye el riesgo cardiovascular, atribuido principalmente al transporte reverso 62 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

63 Comparación de dos métodos para la determinación de los niveles de colesterol HDL en caninos del colesterol (2, 20). En el caso de los perros, existe un caso particular ya que estos carecen de la enzima transferidora de ésteres de colesterol (Cholesteryl ester transfer protein, CETP) que está presente en los seres humanos y por ende la molécula de HDL2 adquiere continuamente los ésteres de colesterol dando como resultado la formación de HDL1; estas junto con los ésteres de colesterol, son transportadas al hígado para su almacenamiento o reutilización, en vez de usar las LP LDL o las VLDL que se usan en humanos (5). Por esta razón es importante establecer no solo el colesterol HDL sino hacer una medición de todo el perfil lipídico (CT, C-VLDL, C-LDL y triglicéridos en suero) pues alteraciones en dichas lipoproteínas y en especial en el metabolismo de los lípidos pueden predisponer a enfermedades como hiperlipidemia, obesidad, diabetes mellitus, hipotiroidismo, pancreatitis, hiperadrenocorticismo; no solo en humanos sino también en caninos (1, 21). En esta última alteración y en la administración de corticoides exógenos puede presentarse la hiperlipemia, debido a la aparición de insulinorresistencia periférica inducida por los corticoides, lo que redunda en un aumento de los lipoproteínas ricas en triglicéridos (quilomicrones y VLDL) (11). Si se tiene en cuenta todo lo anterior, es de gran importancia precisar si existe alguna diferencia entre los métodos usados en humanos para determinar el colesterol HDL y si estos mismos métodos funcionan en los caninos que presentan diferentes metabolismo lipídico. En humanos se determina no solo el colesterol HDL sino también el colesterol LDL mediante el método de precipitación, ya que es el más confiable a pesar de ser un método con ensayos laboriosos y tediosos que requerían un paso de separación manual con reactivos precipitantes, seguido del análisis del contenido en colesterol mediante analizadores automatizados, además de requerir de un personal entrenado (22-24). Por esta razón se crea la necesidad de buscar más métodos para hacer preciso el análisis y así surgen los métodos homogéneos que emplean reactivos específicos para medir directamente el colesterol HDL en el suero o en el plasma de la muestra (23, 25). Debido a esto, se han realizado estudios en humanos comparando el método utilizado por National Cholesterol Education Program (NCEP) de USA que es el método de precipitación y los métodos actuales llamados métodos homogéneos, entre los cuales se encuentra el directo, hallando que no existe diferencia entre ellos y que pueden ser utilizados ambos para determinar colesterol HDL y colesterol LDL en humanos (22, 23). Sin embargo, se debe tener en cuenta que en ocasiones se puede presentar diferencias debidas a la manipulación, a los instrumentos usados y a los diferentes kits comerciales que existen en el mercado (23). En esta investigación, al comparar el método directo y el método de precipitación usados comúnmente en humanos, no se encontró diferencia significativa entre ellos al determinar el colesterol HDL en caninos, siendo igual a lo reportado en humanos, Además, es más favorable el uso del método de precipitación usado comúnmente en humanos, ya que es 15 veces más costoso el método directo con respecto al precipitado. CONCLUSIÓN Debido a que existen pocas referencias relacionadas con la determinación del perfil lipídico completo en especies con patrón HDL, al comparar en este estudio el método directo y el método de precipitación, se encontró que al no existir diferencia significativa ente ellos, puede ser utilizado cualquiera de los dos métodos analizados para la determinación del colesterol HDL en caninos. Además, se recomienda realizar más estudios con otras especies que tengan el mismo patrón de los caninos para poder obtener más referencias, ya que existe actualmente poca literatura de la realización y la comparación de los métodos para determinar colesterol HDL en animales. 63

64 José Henry Osorio, Yirly Johanna Suárez, Jorge Enrique Pérez BIBLIOGRAFÍA 1. Coppo NB, Coppo JA, Lazarte MA. Intervalos de confianza para colesterol ligado a lipoproteínas de alta y baja densidad en suero de bovinos, equinos, porcinos y caninos. Rev Vet 2003; 4(1): Maldonado EN, Romero JR, Ochoa B, Aveldaño MI. Lipid and Fatty Acid Composition of Canine Lipoproteins. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 2001; 128(4): Montgomery R. Bioquímica: casos y texto. 6 a Ed. Madrid, España: Harcourt Brace; Pasquini A, Luchetti E, Cardini G. Plasma lipoprotein concentration in the dog: the effects of gender, age, breed and diet. J Anim Physiol Anim Nutr 2008; 2(6): Xenouli PG, Steiner JM. Lipid metabolism and hyperlipidemia in dogs. Vet J 2010; 183(1): Díaz C, Plaza E, Chimoy P. Niveles séricos de triglicéridos y colesterol en caballos peruanos de paso bajo dos sistemas de crianza. Rev investig vet Perú 2008; 19(2): Attie AD. Lipoprotein/Cholesterol Metabolism. En: Meyers RA. Encyclopedia of Physical Science and Technology. 3 a Ed. Ed. Madison, Wisconsin, U.S.A: Academic Press; p King MW. Lipoproteins. The Medical Biochemistry Page Org [Internet]. Disponible en: themedicalbiochemistrypage.org/lipoproteins.html. Consultado Julio de Osorio JH. Total cholesterol and HDL-cholesterol in aging dogs. Biosalud 2006; 5: Puppione DL, Bassilian S, Souda P, Macdonald MH, Hagland F, et al. Mass spectral analysis of the apolipoproteins on dog (Canis lupus familiaris) high density lipoproteins. Detection of apolipoprotein A-II. Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics 2008; 3(4): Breininger E, Pintos L. Transporte de lípidos y patologías asociadas al metabolismo lipídico. Laboratorio de Lípidos y Proteínas. Área Química Biológica de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires (UBA) 2007 [Internet]. Disponible en: Metabolismo_de_lipido_en_caninos.htm. Consultado Mayo de Xenoulis PG, Suchodolski JA, Levinski MD, Steiner JM. Investigation of Hypertriglyceridemia in Healthy Miniature Schnauzers. J Vet Intern Med 2007; 21(6): Bailhache E, Briand F, Nguyen P. Metabolism of cholesterol ester of apolipoprotein B10- containing lipoproteins in dog: evidence for disregarding colesterol ester transfer. Eur J Clin Invest 2004; 34: Maldonado EN, Casanave EB, Aveldaño MI. Major plasma lipids and fatty acids in four HDL mammals. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 2002; 132(2): Rigotti A, Krieger M. Getting a handle on good cholesterol with the high-density lipoprotein receptor. N Engl J Med 1999; 341(26): Laboratorio veterinario de referencia (VET LAB SL). Lipidograma [Internet]. Disponible en: Consultado Marzo de Martínez-Gonzáles J. La apoproteína humana A-II determina los niveles de triglicéridos plasmáticos a través de la regulación de la actividad lipoproteína lipasa y del proteoma de las HDL. Clin Investig Arterioscler 2010; 22(4): Warnick GR, Nauck M, Rifai N. Evolution of methods for measurement of HDL-cholesterol: from ultracentrifugation to homogeneous assays. Clin Chem 2001; 47: Grove TH. Effect of reagent ph on determination of high-density lipoprotein cholesterol by precipitation with sodium phosphotungstate-magnesium. Clin Chem 1979; 25: Julve J, Escolá-Gil JC, Rotllan N, Fiévet C, Vallez E, De la Torre C. Human apolipoprotein A-II determines plasma triglycerides by regulating lipoprotein lipase activity and high-density lipoprotein proteome. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010; 30: Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

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66 Como citar este artículo: Ballut JC, Calderón A, Rodríguez V. Brucelosis en hembras caninas en Montería (Colombia): un problema para la salud pública. Biosalud. 2013;12(2): BRUCELOSIS EN HEMBRAS CANINAS EN MONTERÍA (COLOMBIA): UN PROBLEMA PARA LA SALUD PÚBLICA Juan Carlos Ballut 1 Alfonso Calderón 2 Virginia Rodríguez 3 RESUMEN La brucelosis canina producida por la cepa rugosa Brucella canis, constituye un riesgo para la salud pública. Debido a que produce infertilidad en ambos sexos; en hembras: abortos tardíos, reabsorciones embrionarias, muertes embrionarias, descargas vaginales de color y olor desagradables y nacimiento de cachorros débiles; en machos: epididimitis, orquitis, atrofia testicular, anormalidades espermáticas; así como puede causar enfermedad en humanos. Mediante un estudio epidemiológico descriptivo de corte transversal y mediante el cálculo para poblaciones, se seleccionaron 62 hembras caninas adultas de diferentes áreas urbanas de Montería (Córdoba) para determinar anticuerpos contra B. canis. Se usó una prueba inmunoensayo cromatográfico de fase sólida comercial. Se elaboró una base de datos en formato Excel en la que se registraron datos anamnésicos y los resultados de laboratorio. Se empleó estadística descriptiva. La seroprevalencia de B. canis fue del 6,45%. El 88,71% de las hembras tuvo historia reproductiva normal y el 11,29% se clasificó como anormal por el reporte de abortos y reabsorciones embrionarias. El 4,84% de las hembras con historial normal fueron seroprevalentes, mientras el historial del 1,61% de las seroprevalentes para B. canis tuvo historial reproductivo anormal. La seroprevalencia determinada en hembras caninas hace pensar que se debe tener presente esta enfermedad para su correcto diagnóstico, y la presencia de serorreactores es una evidencia y un riesgo epidemiológico para la salud pública. Palabras clave: Brucella canis, anticuerpos, estudios seroepidemiológicos. BRUCELOSIS IN FEMALE DOGS IN MONTERIA (COLOMBIA): A PUBLIC HEALTH PROBLEM ABSTRACT Canine brucellosis caused by the rough strain of Brucella canis, constitutes a risk to public health because it produces infertility in both sexes; in female it causes late-term abortions, embryo resorption, embryonic death, vaginal discharges with unpleasant colors and odors, weak newborn puppies; in males it causes epididymitis, orchitis, testicular atrophy and sperm abnormalities; it can also cause illness in humans. Through a descriptive cross section epidemiological study and by calculation for populations, 62 adult canine females of different urban areas of Montería (Córdoba) were selected to determine antibodies against B. canis, using a commercial chromatographic immunoassay test in solid phase. An Excel database format was developed in order to 1 MVZ. M.Sc. Profesor Titular, Grupo Medicina y Cirugía Veterinaria, Facultad Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba. 2 MVZ. M.Sc. Profesor Titular, Grupo Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico Asociado, Facultad Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba, sede Berástegui, km 26 vía Ciénaga de Oro. Montería, Córdoba, Colombia. Autor para correspondencia: alcaran1@yahoo.com 3 Bacterióloga. Profesora Asociada, Grupo Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico, Facultad Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba ISSN Recibido: noviembre 12 de Aceptado: enero 31 de 2014 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

67 Brucelosis en hembras caninas en montería (Colombia): un problema para la salud pública register anamnestic data and laboratory results. In addition, descriptive statistics was employed in this study. The results of this study show that B. canis seroprevalence was 6.45%; 88.71% of the female s reproductive histories was normal; and 11.29% were classified as abnormal by the report of abortions and embryonic resorption; 4.84% of the females with normal reproductive history were seroprevalent while 1.61% of the seroprevalent for B. canis had an abnormal reproductive history. The seroprevalence determined in females dogs suggests that this disease must be considered for its correct diagnosis and the presence of seroreactants is an evidence and an epidemiological risk for public health. Key words: antibodies, Brucella canis, seroepidemiological studies. INTRODUCCIÓN La brucelosis canina producida por Brucella canis es un bacilo corto Gram negativo intracelular facultativo y clasificada como cepa rugosa o mucoide de acuerdo con el aspecto de las colonias en medio sólido (1, 2), ocasiona fallas reproductivas como abortos tardíos en hembras preñadas que ocurren de 45 a 55 días de gestación; seguidamente hay descargas vaginales o muertes embrionarias tempranas y reabsorción unas semanas después del apareamiento; nacimiento de cachorros débiles que mueren después del nacimiento; en los machos hay epididimitis, orquitis y anormalidades espermáticas (3). Los caninos también pueden ser afectados por especies lisas de Brucella, por ejemplo, se determinó seropositividad en tres caninos en Corea y donde la fuente de infección fueron los bovinos de donde se aisló B. abortus (4). También B. melitensis (5) y B. suis (6) han sido reportados en caninos; aunque no se ha comprobado infección por B. ovis y B. neotomae (1). Los canidos son los hospederos naturales de B. canis (1) y el agente etiológico por vía horizontal, vertical o iatrogénica, afecta al humano (7-9). Se reconocen los beneficios de la tenencia de mascotas en pacientes inmunosuprimidos, sin embargo es un riesgo potencial de zoonosis B. canis (10, 11). Se ha aislado B. canis en pacientes con fiebre de quince días de evolución (12). En Suecia, se diagnosticó un niño infectado por B. canis (13). En Argentina, la brucelosis en humanos por B. canis está subdiagnósticada por la carencia de pruebas serológicas confiables y por desconocimiento de su prevalencia, se propone que pacientes negativos a las pruebas de antígenos lisos sean diagnosticados por la prueba de aglutinación rápida en portaobjetos (RSAT), un ELISA indirecto (IELISA) como pruebas diagnósticas confirmatorias de B. canis en humanos (7, 14, 15). En donantes sanos de bancos de sangre humano se han reportado seroprevalencias por B. canis, por ejemplo en Perú del 0,2% en el 2007 (16), del 1,6% en Turquía y negativos para B. abortus en 2011 (17). El aislamiento por hemocultivo o cultivo sólido es el gold standard para declarar un animal como infectado; además permite la biotipificación (18-20), pero la bacteremia puede ser intermitente y un cultivo negativo no es criterio para excluir una infección por B. canis (7, 21, 22). Las pruebas serológicas emplean bacterias inactivadas o fracciones purificadas como antígenos para la detección de anticuerpos generados por el hospedero durante la infección; este diagnóstico incluye el test de aglutinación (SAT), la prueba de aglutinación rápida en placa (ARP), aglutinación rápida en tubo (RSAT) e inmunodifusión en gel de agar (AGID), Elisa indirecta (IELISA) (3, 20, 21). Mediante métodos serológicos y un PCR-T se ha diagnosticado B. canis, esta combinación de técnicas de diagnóstico permitió evidenciar la circulación de B. canis en Italia (23). Actualmente se propone un diagnóstico a partir de frotis 67

68 Juan Carlos Ballut, Alfonso Calderón, Virginia Rodríguez vaginal y muestras de orina con técnicas moleculares con el fin de detectar B. canis antes de la detección de anticuerpos (24). En Colombia hay pocos estudios sobre la epidemiología de la brucelosis canina y no existen leyes sanitarias que la regulen (25). El objetivo general de este estudio fue determinar anticuerpos contra B. canis en hembras caninas urbanas de Montería (Córdoba), mediante un ensayo inmunocromatográfico. MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de estudio Se implementó un estudio epidemiológico descriptivo de corte transversal en diferentes áreas urbanas de Montería. Zona de estudio Las muestras se tomaron en Montería, capital del departamento de Córdoba, localizada a los 08º45 27 de latitud Norte y 75º53 24 de longitud Oeste, con una altura de 18 msnm, con una humedad relativa del 85% y una temperatura promedio de 28ºC. Selección de la muestra Según el censo de vacunación en la zona urbana de Montería, se vacunaron caninos contra la rabia, de los cuales fueron hembras (26); mediante el cálculo para poblaciones (27), se estableció que el tamaño de la muestra para determinar la seroprevalencia de anticuerpos por B. canis, fue de 62 hembras caninas, que se tomaron en los diferentes barrios, teniendo en cuenta el porcentaje de participación, el promedio de hembras por barrio y número de barrios. Toma de las muestras A cada hembra se le realizó un examen clínico, donde se preguntó su historial reproductivo con el fin de catalogarlo como normal o anormal; se consideró anormal cuando hubo reporte de abortos, nacimiento de cachorros débiles, copulación normal sin preñez posterior, camadas pequeñas, ciclos demasiado frecuentes. Posteriormente, previa desinfección de la vena cefálica o safena, se tomó una muestra de sangre de 5 ml en un tubo vacutainer sin anticoagulante al vacío (tapa roja); cada muestra se rotuló con la respectiva identificación del animal y se conservó en refrigeración 4 o C en una nevera de icopor, hasta el laboratorio de la Clínica Julio E. Cuervo de la Universidad de Córdoba, sede Berástegui, donde se obtuvo el suero por centrifugación a 3500 rpm durante 5 minutos, el cual se conservó en congelación (-70 o C) en tubos eppendorf hasta su procesamiento. Pruebas serológicas Se empleó una prueba comercial Antigen Rapid C Brucella Ab Test Kit o ensayo inmunocromatográfico en fase sólida para la determinación de B. canis, siguiendo las especificaciones de la casa fabricante del kit; los sueros se descongelaron y a temperatura ambiente se tomó una muestra de suero de 20 μl al pozo del dispositivo, se agregó 160 μl del buffer diluyente en el mismo pozo y se leyó la prueba a los 20 minutos. Cuando apareció una banda de color púrpura en el control del ensayo, se evidenció una correcta ejecución de la prueba junto a otra banda que indica un resultado positivo para anticuerpos contra B. canis de la muestra problema; si esta banda no aparece el resultado es negativo. Esta prueba comercial presentó una sensibilidad y especificidad mayor o igual al 90% cuando se comparó con una prueba rápida de aglutinación en lámina 2-mercapto-etanol (28). Análisis estadístico Se elaboró una base de datos en formato Excel, donde se consignó información de las variables de los caninos evaluados y los resultados obtenidos en el laboratorio. Se usó Chi-cuadrado, 68 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

69 Brucelosis en hembras caninas en montería (Colombia): un problema para la salud pública con el objeto de determinar si las variables edad, raza e historia clínica eran independientes con la seropositividad a B. canis; se usó estadística descriptiva mediante el software SAS (29). Aspectos éticos El Comité de Ética del Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico (IIBT) de la Universidad de Córdoba, clasificó este estudio de bajo riesgo. Las muestras fueron tomadas por estudiantes de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, supervisado por uno de los autores; quienes tuvieron en cuenta, para los procedimientos de toma de muestra, manejo y conservación, las normas éticas, técnicas, científicas y administrativas para la investigación, en animales según la Ley 84 (30). A lo largo del estudio, se mantuvo la confidencialidad de la información de caninos muestreados y seropositivos. RESULTADOS En la Tabla 1 se presenta la población de hembras evaluadas por edad y la seroprevalencia de B. canis por edad en Montería. Tabla 1. Distribución de la seroprevalencia en hembras caninas por edad en Montería (Córdoba) Edad/años n % Seropositivos Seronegativos N % N % ,38 0 0, , ,32 3 4, ,48 >8 7 11,30 1 1,61 6 9,68 Total ,00 4 6,45% 58 93,55% La seroprevalencia de anticuerpos contra B. canis por razas en Montería se presenta en la Tabla 2. Tabla 2. Distribución de la seroprevalencia por razas en hembras caninas de Montería (Córdoba) Raza n % Seropositivos Seronegativos N % N % Mestiza 46 74,20 3 4, ,35 Razas puras 16 25,80 1 1, ,20 Total ,00 4 6,45% 58 93,55% La distribución de la seroprevalencia de B. canis de acuerdo al historial reproductivo en hembras caninas de Montería se presenta en la Tabla 3. Tabla 3. Distribución de la seroprevalencia de acuerdo al historial reproductivo en hembras caninas de Montería (Córdoba) H. clínica N % Seropositivos Seronegativos N % N % Normal 55 88,71 3 4, ,87 Anormal 7 11,29 1 1,61 6 9,68 Total ,00 4 6,45% 58 93,55% 69

70 Juan Carlos Ballut, Alfonso Calderón, Virginia Rodríguez DISCUSIÓN Se encontró que la seroprevalencia de anticuerpos contra B. canis en hembras caninas en Montería fue del 6,45% (4/62). Mediante la misma técnica en caninos callejeros de Medellín, la seroprevalencia fue menor (2,76%, 1,11%-4,42%), cuando se determinó la seroprevalencia por sexo fue mayor en machos (4,6%) que en hembras y cuando la vivienda era compartida con otros animales domésticos la seroprevalencia fue del 7,5%; concluyéndose que por la presencia de estos anticuerpos, persiste el riesgo zoonótico de transmisión, siendo considerada esta enfermedad como profesional (31). Mayores valores absolutos han sido reportados por diferentes técnicas de diagnóstico en caninos de Medellín, por ejemplo, con el uso de la 2-MERSAT la seropositividad fue del 17,2% (32), del 6,78% con la técnica del 2ME- PRAP (33) y con una frecuencia del 11% con 2ß-mercaptoetanol (25). En Villavicencio, mediante la aglutinación rápida en placa con antígeno mucoide, la seropositividad fue menor (1,49%) y se asoció esta con falsos positivos o reacciones cruzadas (34). Inicialmente en Medellín, en el 2,55% de las muestras se aislaron bacterias Gram negativas con patrón bioquímico correspondiente que fueron confirmadas como B. canis (29, 32); finalmente en la misma ciudad, se documentó un caso humano de por B. canis en un criador de caninos, caso en que el aislamiento se hizo de una hembra canina asintomática lactando, con historia previa de la enfermedad, convirtiéndose en una forma de trasmisión para los neonatos y en un riesgo zoonótico para veterinarios, propietarios o humanos si no se toman medidas de prevención (35). Igualmente, anticuerpos contra B. canis en caninos han sido reportados por diferentes técnicas de diagnóstico en San Paulo (Brasil) con SAT del 1,77% y del 0,84% por ME-SAT (36), en Turquía del 12,7% con TAT, del 7,73% con 2ME-TAT y 7,45% por ELISA (37), en Bellavista y Callao distritos de la Provincia Constitucional del Callao (Perú), mediante IDGA la seroprevalencia fue del 15,6±33% (38), en Japón una seroprevalencia del 2,5% en caninos (39). En Buenos Aires con IDGA del 7,3% (40), en Buenos Aires (Argentina) del 14,7% con RSAT y del 10,7% por IELISA (41), en Corea del Sur con 2-ME RSAT la seroprevalencia fue del 14,1 (42) y la infección por B. canis se sigue presentando (39). En Corea del Sur del 18,6% en muestras de sangre animales salvajes (perros, gatos y roedores), del 5,7% con C-ELISA y del 9,7% con PCR en tejidos (43) y de un cadáver de ciervo acuático chino se aisló B. abortus biovar 1. En Curicó (Chile), mediante la técnica de contrainmunoelectroforesis la seroprevalencia fue del 18,18% (44). Todos los anteriores reportes están concluyendo que la infección por B. canis se sigue trasmitiendo, aun en especies silvestres. El aislamiento de cepas de B. canis en Argentina (37, 38, 45), en Medellín (46) y en Austria (2) sugieren que caninos con serología positiva o aislamientos son indicadores de alto riesgo para la salud pública (zoonosis) en poblaciones expuestas. La mayor seroprevalencia por edad (4,84%) se presentó en el grupo etáreo de 4 a 8 años, seguido del grupo donde >8 años con el 1,61%, a diferencia del actual estudio en Medellín se encontró que la mayor seroprevalencia (3,7%) se presentó en caninos menores de un año (31). Troncoso et al. en Chile no encontraron diferencias significativas por sexo y edad (44). La mayor seroprevalencia por razas (4,84%) se presentó en el grupo de hembras mestizas o criollas, seguido del grupo razas puras con el 1,61%. Igualmente en Medellín se encontró que la seroprevalencia en caninos criollos fue del 4,8% (31), pero en Callao no encontraron diferencia estadística significativa entre razas (38). Con relación a la historia reproductiva de las hembras se determinó que en el 88,7% (55/62) la historia reproductiva fue normal mientras 70 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

71 Brucelosis en hembras caninas en montería (Colombia): un problema para la salud pública en el 11,29% (7/62) anormal por el reporte de abortos y reabsorciones embrionarias. Al determinar el historial reproductivo dentro de las hembras seropositivas se estableció que fue normal en el 4,84% (3/62) y en el 1,61% (1/62) fue anormal, aunque estas diferencias no fueron significativas pero (38) en el Perú encontraron diferencia significativa (p<0,05) entre caninos con y sin historia reproductiva (26,5 y 8,6%) (38). En Medellín no encontraron diferencias significativas por sexo pero las poblaciones de caninos callejeros fueron un factor de riesgo para la transmisión de B. canis (33). En Nigeria se determinó una seroprevalencia del 5,46% para B. abortus y 0,27% para B. canis, donde la mayoría de los caninos seropositivos a B. abortus en su alimentación incluían fetos de vacas y abortos (47). En México, un modelo de regresión logística para cepas lisas de Brucella spp. asoció la presencia de perros y cabras seropositivas en el mismo rancho (48). CONCLUSIONES La seroprevalencia determinada en hembras caninas de Montería permite tener presente esta patología en el diagnóstico rutinario y la presencia de serorreactores es una evidencia y un riesgo epidemiológico para la salud pública. 71

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74 Juan Carlos Ballut, Alfonso Calderón, Virginia Rodríguez 44. Troncoso I, Rojas R, Fischer C, Núñez C, Arrué. K Brucelosis en criaderos caninos: seroprevalencia de 33 casos. Hospitales Veterinarios 2013; 5(2): Di Lorenzo C, Cabral M, Argenio L, Miceli AP. Aislamiento de Brucella canis de leche de hembra canina infectada crónicamente. REIE 2010; 5: Olivera M, Di Lorenzo C. Aislamiento de Brucella canis en un humano conviviente con caninos infectados. Informe de un caso. Colombia Med 2009; 40(2): Cadmus SI, Adesokan HK, Ajala OO, Odetokun WO, Perrett LL, Stack JA. Seroprevalence of Brucella abortus and B, canis in household in dogs in southwestern Nigeria: a preliminary report. J. S. Afr Vet Assoc 2011; 82(1) Mikolon AB, Gardner IA, Hernández DA, Hietala SK. Risk factors for brucellosis seropositivity of goat herds in the Mexicali Valley of Baja California, Mexico. Prev Vet Med 1998; 37(1-4): Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

75 ARTÍCULOS DE REVISIÓN

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77 Como citar este artículo: Osorio JH, Vinasco J, Bedoya PA. Actualización en el metabolismo de las hormonas tiroideas y su relación con la reproducción en el cerdo. Biosalud. 2013;12(2): ACTUALIZACIÓN EN EL METABOLISMO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS Y SU RELACIÓN CON LA REPRODUCCIÓN EN EL CERDO José Henry Osorio 1 Jazmín Vinasco Rodríguez 2 Paola Andrea Bedoya 3 RESUMEN El presente artículo de revisión tuvo como objetivo actualizar conceptos sobre el metabolismo de las hormonas tiroideas y su relación con la reproducción en el cerdo. Fue analizada la literatura disponible de los últimos 25 años en las bases de datos BBCS-LILACS, Fuente Académica, IB-PsycINFO, IB-SSCI, IB- Scielo, Scopus y Scirus, al igual que artículos históricos, textos y referencias citadas en trabajos públicos. Se adquirió información pertinente relacionada con los objetivos propuestos, destacando las múltiples funcionalidades y la relación que tienen las hormonas tiroideas con los diferentes tejidos del organismo, clasificándose en cuatro secciones a saber: síntesis, transporte y metabolismo; receptores y mecanismos de acción; efectos de las hormonas tiroideas; hormonas tiroideas y reproducción. Puede concluirse que las hormonas tiroideas tienen acciones importantes en el ovario y el testículo, y juegan un papel crucial en el desarrollo de las células responsables de la reproducción. Alteraciones en estas hormonas pueden desencadenar infertilidad, pues un nivel adecuado de las mismas es necesario para la ovulación y la espermatogénesis.palabras clave: glándula tiroides, pequeños rumiantes, salud animal, producción animal. Palabras clave: fertilidad, porcinos, tiroides. UPDATE ON THE THYROID HORMONES METABOLISM AND ITS RELATIONSHIP WITH BOAR REPRODUCTION ABSTRACT This review article aimed to update concepts on the metabolism of thyroid hormones and their relationship with boar reproduction. The available literature of the past 25 years in the BBCS- LILACS, Academic source, IB-PsycINFO, SSCI IB-, IB-SciELO, Scopus and Scirus databases as well as historical articles, texts and references cited work public, were analyzed. Relevant information to the objectives was gotten, highlighting the multiple functionality and the relationship thyroid hormones have with the different tissues in the organism, thus being classified in four sections as follows: synthesis, transport and metabolism; receptors and mechanisms of action; effects of thyroid hormones; thyroid hormones and reproduction. It can be concluded that thyroid hormones have important roles in ovaries and testicles, and play a crucial role in the development of reproduction cells. Changes in these hormones can produce infertility, as an adequate level of these hormones is necessary for ovulation and spermatogenesis. Key words: fertility, swine, thyroid. 1 Laboratorio de Investigación en Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. 2 Programa de Jóvenes Investigadores de Colciencias. 3 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas. ISSN Recibido: junio 24 de Aceptado: septiembre 25 de 2013 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

78 José Henry Osorio, Jazmín Vinasco Rodríguez, Paola Andrea Bedoya INTRODUCCIÓN Una de las glándulas endocrinas más importantes del organismo es la tiroides, ya que tiene múltiples efectos tanto en el desarrollo como en el metabolismo, regulando la tasa metabólica basal y siendo esencial para mantener constante la temperatura corporal (1). Igualmente, las secreciones de dicha glándula estimulan el consumo de oxígeno y la síntesis de proteínas por la glándula mamaria, conllevando a un aumento de la producción láctea (2). Anatómicamente, esta glándula es un crecimiento externo del piso de la cavidad bucal que pierde de manera subsecuente su conexión celular (conducto tirogloso) con el endodermo faríngeo, se funde con las masas celulares de cada quinta bolsa faríngea o cuerpo último branquial y finalmente asume una relación dorso lateral con la tráquea en la región de la laringe (3). En el cerdo, la tiroides es unitaria y se halla situada en posición ventral en relación con la tráquea, su borde anterior a menudo está en contacto con el cartílago tiroides, mientras que su punta o extremo caudal en general alcanza la entrada del tórax (4). El tejido glandular posee células distribuidas en unas estructuras circulares llamadas folículos (5), los cuales varían en tamaño según la especie (50 a 150 μm en rata y ratón; 150 a 500 μm en cerdo y humanos) (1) constituyendo así las unidades estructurales y funcionales de la glándula. El folículo tiroideo está constituido por un epitelio cuboidal que se forma de células de revestimiento foliculares y está rodeado por una membrana basal y por células C o parafoliculares que constituyen el 90% de la población celular, posee igualmente un lumen que contiene el coloide y está compuesto por una glicoproteína yodada llamada tiroglobulina (Tg) (6). Las hormonas tiroideas incluyen en su estructura el yodo, por lo tanto, la función de la tiroides incluye no solo la síntesis, almacenamiento y secreción de la hormona tiroidea sino también la concentración de yoduro (7); no obstante, la importancia en la regulación del metabolismo general, el desarrollo, crecimiento y la diferenciación tisular se ha reconocido desde hace tiempo (8), teniendo gran impacto las contribuciones de la medicina clínica, fisiología, bioquímica y genética molecular en la comprensión de la acción de las hormonas tiroideas (9). Por todo lo anterior, la presente revisión tiene como objeto conferir información actualizada sobre la importancia que tienen las hormonas tiroideas en el funcionamiento fisiológico del cerdo, además de destacar la influencia que tienen las mismas en el estado reproductivo, ya que tienen un efecto directo sobre la función gonadal y pueden afectar la fertilidad, la gestación y hasta el tamaño de la camada, pretendiendo ser de utilidad en los avances de la ciencia biomédica. SÍNTESIS, TRANSPORTE Y METABOLISMO Las hormonas tiroideas (HT) son sintetizadas en los folículos tiroideos, siendo una glucoproteína larga llamada tiroglobulina (Tg) (10), en dicho proceso tienen importancia dos moléculas: tirosina y yodo. La primera forma parte de la Tg, la cual es formada dentro de la célula folicular y se secreta hacia la luz del folículo; la segunda es convertida en yoduro en el tracto intestinal y luego es transportado hacia la tiroides, en donde las células foliculares lo atrapan por medio de transporte activo (5, 11, 12). La captación de yoduro se efectúa en la membrana basal y pasa al coloide folicular a través de la membrana apical de las células foliculares, mientras que las células parafoliculares liberan calcitonina. El yodo es oxidado por una enzima llamada tiroperoxidasa (TPO) en presencia de peróxido de hidrógeno e incorporado a los residuos de tirosina de la glucoproteína (9, 13) en un proceso conocido como organificación o PBI (protein binding iodide), dando como resultado la formación de monoyodotirosina (MIT) y diyodotirosina (DIT) (1). El acoplamiento de las yodotirosinas para formar yodotironinas tiene dos posibles 78 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

79 Actualización en el metabolismo de las hormonas tiroideas y su relación con la reproducción en el cerdo vías: la combinación de dos moléculas de DIT para formar 3,4,3,5 -tetrayodotironina (T 4 o tiroxina) o la combinación de una DIT con una MIT para formar 3,5,3 -triyodotironina (T 3 ) o 3,3,5 -triyodotironina (rt 3 ) (7), este proceso está regulado por un sistema de retroalimentación negativa que involucra el hipotálamo, la hipófisis y la glándula tiroides (9), y depende de la hormona estimulante de tiroides (TSH) (3) bajo el control del eje hipotalámico-hipofisiario (14); igualmente, en el hipotálamo se sintetiza un tripéptido llamado TRH (hormona liberadora de tirotropina) el cual controla la síntesis y liberación de la TSH (9), además de participar en la liberación de la hormona del crecimiento (GH) y la prolactina (PRL) provenientes de la adenohipófisis del cerdo (2). Por otro lado, la somatostatina y dopamina en el hipotálamo pueden regular negativamente la secreción de TSH (9). La síntesis de las HT se inicia por endocitosis del coloide cerca de la superficie interna de la célula tiroidea (7), por lo tanto, la Tg interiorizada se incorpora en fagolisosomas y se somete a digestión proteolítica siendo endocitada y degradada en prelisosomas y lisosomas liberando dos aminoácidos yodados (T 3 y T 4 ) a la circulación (1); entre tanto, las dos yodotirosinas se desyodan dentro de la glándula por una enzima denominada desyodasa, realizando un ciclo intratiroideo que hace aprovechable el yodo de la tirosina (7); de las dos tironinas yodadas, la tiroxina predomina en todos los animales: aproximadamente el 33% del total del yodo en la glándula está en forma de T 4 y por lo general menos del 10% está en forma de T 3 a pesar de ser esta última biológicamente más activa (7). Aunque la T 4 es la molécula producida en mayor cantidad por la glándula tiroides, su actividad biológica es pequeña e inclusive se le menciona como una prohormona (15), la desyodación extratiroidea o periférica convierte T 4 a T 3, la cual se une al receptor tiroideo en las células diana con mayor afinidad comparada con la T 4 y es la forma preponderante de la molécula metabólicamente activa; la mayoría de la T 3 circulante se genera por el metabolismo de un pre-receptor resultante de la actividad de las enzimas desyodasa yodotironina tipo 1 (D1) y tipo 2 (D2) que convierten T 4 a T 3 por 5 -monodesyodacion (15). La D1 se encuentra en tejidos periféricos como hígado y riñones y es responsable de la conversión de la mayoría de T 4 a T 3 en la circulación. La D2 está presente en cerebro, pituitaria y tejido adiposo marrón o grasa parda y este, a diferencia de D1, convierte T 4 a T 3 para uso intracelular (9). En enfermedades crónicas, ayuno, administración de glucocorticoides o propiltiouracilo, inanición de carbohidratos y en el plasma fetal aumenta la proporción T 4 /T 3, debido a la inhibición de la enzima 5 -desyodasa, lo que genera poca concentración de T 3 circulante, y por lo tanto, un aumento en la desyodación de la T 4 pero el producto final es la rt 3 que es una yodotironina biológicamente inactiva (7, 8). Posteriormente, luego de ser liberadas a la sangre, las HT circulan en forma fija, es decir, unidas a proteínas transportadoras o fijadoras específicas, principalmente a la globulina fijadora de hormona tiroidea (TBG) que tiene una alta afinidad por la T 4; además, se ligan en forma secundaria a la albúmina, que presenta poca afinidad para T 4 y T 3 pero se encuentra en mayor concentración, y a la prealbúmina fijadora de tiroxina (TBPA), la cual muestra una especificidad y una capacidad intermedia entre la TBG y la albúmina (8, 16). Desde la captación de T 3, de forma indirecta se logra calcular la cantidad de TBG en una muestra, la cual está ligada a la mayoría de T 4 circulante; por lo tanto, cambios en la afinidad podrían tener un largo efecto en las concentraciones hormonales de T 4 libre, pero no se refleja en las mediciones totales de las HT circulantes o T 3 libre (17). Las conversiones metabólicas intracelulares de T 4 y T 3 incluyen: 1) Desyodación por 5 -desyodasa y 5 desyodasa, 2) Desaminación, independiente o junto con oxidación o descarboxilación y 3) Conjugación 79

80 José Henry Osorio, Jazmín Vinasco Rodríguez, Paola Andrea Bedoya con glucorónico o sulfato, este último se considera un mecanismo de destoxificación. Todos estos procesos se realizan en el hígado y los ésteres finales se excretan en la bilis; a continuación, la degradación intestinal de dichos ésteres y la reabsorción de moléculas de yoduro hacia la circulación sanguínea se denomina ciclo enterohepático (7), finalmente la forma principal del metabolismo de las HT incluye el retiro de las moléculas de yodo (5), puesto que las formas descodadas y conjugadas de las tironinas se eliminan inicialmente en la orina y las tironinas no metabolizables son eliminadas en las heces mediante la secreción biliar (8). RECEPTORES Y MECANISMOS DE ACCIÓN Las funciones más importantes de los receptores de la HT (TRs) incluyen la regulación del metabolismo y la frecuencia cardiaca, además juegan un papel importante en el desarrollo de los organismos. Dichas hormonas pueden atravesar la membrana plasmática a pesar de ser aminoácidos, ya que son lipofílicas, e interactúan de forma directa con el núcleo uniéndose a receptores específicos de elevada afinidad en el núcleo de las células diana (18), encontrando que T 3 se une con mayor afinidad, aproximadamente 10 veces más que T 4 y tiene actividad biológica proporcionalmente mayor, igualmente, las HT se fijan a sitios de afinidad baja en el citoplasma, pero esta no es la misma proteína que el receptor nuclear (8). Se han descrito dos isoformas del receptor de HT (TR) codificados por genes distintos que son capaces de unir dicha hormona, estos se denominan TRα (thyroid hormone receptor α) y TRß (thyroid hormone receptor ß), los cuales reconocen elementos específicos de respuesta en los promotores de los genes diana y de esta manera activan o reprimen la trascripción (18). Varios estudios han demostrado que la membrana plasmática, sinapsis, el retículo endoplásmico y las mitocondrias pueden ser considerados como potenciales sitios celulares de acción de las HT (acciones no genómicas) (15, 16). Los efectos de la TSH sobre la glándula tiroides están mediados por la interacción específica con el receptor de la tirotropina (rtsh), el cual se encuentra en la membrana basal y es un receptor acoplado a proteína G con 7 dominios transmembranales que en los tirocitos modula la proliferación, síntesis y liberación de las HT (19). De la misma forma, se han identificado receptores de T 3 en la mitocondria donde estimulan la síntesis proteica, aumentan el tamaño mitocondrial y el número de crestas (18). La activación del rtsh induce el acoplamiento de diferentes proteínas G, sin embargo, muchas de las funciones del rtsh son mediadas por la proteína G estimulatoria (Gs), la cual activa la cascada de la adenilato ciclasa (AC)/AMPc. Igualmente, el rtsh induce la disociación de Gs en sus subunidades α y βγ, donde Gs-α estimula la AC incrementando los niveles de AMPc, mientras que las subunidades βγ de la Gs modulan señales intracelulares involucradas en el crecimiento y diferenciación celular (19). Los TR se expresan en casi todos los tejidos, aunque la expresión relativa de las isoformas de TR puede variar entre los tejidos como TRα-1 ARN m que tiene la más alta expresión en el músculo esquelético y la grasa parda, mientras que la TRβ-1 ARN m se expresa en forma predominante en el cerebro, el hígado y los riñones (20). En contraste con las otras isoformas, TRβ-2 ARN m tienen expresión específica de tejido en la glándula pituitaria anterior y áreas específicas del hipotálamo, así como el desarrollo del cerebro y el oído interno, cabe destacar que la TRα-2 también se expresa en diversos tejidos pero es incapaz de unir la hormona (2, 21). EFECTOS DE LAS HORMONAS TIROIDEAS Las HT influyen virtualmente en todos los órganos del organismo, sin embargo, los efectos de estas hormonas se dividen en las siguientes dos secciones (7): 80 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

81 Actualización en el metabolismo de las hormonas tiroideas y su relación con la reproducción en el cerdo 1) Efectos en el crecimiento y desarrollo Los efectos sobre el crecimiento se manifiestan sobre todo durante la vida fetal y en los primeros años de vida posnatal, ya que en los humanos, cerdos y conejos, la tiroides embrionaria es funcional aproximadamente a la mitad de la gestación (7) encontrando que en el comienzo de dicha etapa se encuentran altas concentraciones de T 4 en los diferentes tejidos, y coincide con el inicio de la actividad tiroidea fetal porcina para apoyar el desarrollo temprano del cerebro (22), ya que las HT también influyen en la producción del factor de crecimiento nervioso, lo que explica algunos de los cambios neurales que se dan por hipotiroidismo prenatal (7), aunque ahora se acepta que no hay un período único y fundamental de la acción de estas hormonas en el desarrollo cerebral (23). Sin embargo, durante el desarrollo, parecen controlar el destino y la migración de los primeros neuroblastos en la corteza cerebral, pero no parece influir en su proliferación, y contrario a ello, controlan claramente la proliferación, migración y apoptosis de las células granulares del cerebelo (24). De igual forma, el crecimiento y la erupción de los dientes también están bajo el control de la tiroides. En porcinos los cambios tiroideos causan cambios en la maduración, además afectan la piel y el pelo formando edemas subcutáneos de material con abundantes mucopolisacaridos (mixidema) observándose esta patología principalmente en cerdos nacidos de madres con deficiencia de yodo (7). Así mismo, cuando hay deficiencia de yodo materno o hipotiroidismo congénito se manifiestan déficits neurológicos y retraso del crecimiento (25). Es importante recordar que la enzima peroxidasa tiroidea (TPO) es clave en la síntesis de las HT y se cree que esta enzima podría desempeñar un papel importante en el crecimiento y desarrollo del porcino, por lo tanto, la existencia de mutaciones en el gen TPO pueden afectar dichos procesos (13). Igualmente, la desyodación enzimática de las HT toma importancia ya que forma una barrera que reduce el paso transplacentario de las hormonas y la parte de la placenta fetal es el principal factor en el mecanismo de regulación hormonal (26). Por lo anterior, el abastecimiento de hormonas maternas y yodo por la vía de ingesta de calostro puede estar involucrado en el aumento postnatal, teniendo en cuenta que el requisito de yodo para cerdos en crecimiento es de μg/kg (como un suplemento en la alimentación) (11), aunque la provisión de HT en el calostro sugiere una importancia marginal en el cerdo recién nacido (27). La caída de la temperatura ambiental en el nacimiento puede también jugar un papel fundamental, al inducir un aumento de HT en el plasma, ya sea por la estimulación directa de la glándula tiroidea o indirectamente estimulando eje hipotálamo-hipófisis-tiroideo (28). Por otra parte, en humanos, ratones, ratas, perros y cerdos la administración oral de hormonas liberadoras de tiroides (TRH) incrementa los niveles TSH, T 3 y T 4 en la circulación, además, libera la hormona del crecimiento (GH) y la prolactina (PRL) desde la adenohipófisis del cerdo (29). Por lo tanto, la producción de leche podría aumentar por elevación T 4, GH y PRL en cerdas tratadas con TRH y de esta forma se obtendrán cerdos más pesados al destete (30). Igualmente, la administración de productos que contienen tiroxina, en cerdas lactantes, demuestra que el ritmo cardiaco, respiratorio y temperatura corporal aumentan, y la pérdida de peso corporal y grasa dorsal durante la lactancia se acelera (31). Así mismo, los glucosinatos se utilizan en dietas de cerdos y aves por su bajo contenido en grasa, pero pueden afectar el consumo de alimento y el crecimiento, así como la función de la tiroides y el hígado (32). 2) Efectos metabólicos En los mamíferos la función más sobresaliente de las HT es su capacidad para aumentar el consumo de oxígeno, este junto con el aumento de la actividad tiroidea que se da después de que disminuye la temperatura 81

82 José Henry Osorio, Jazmín Vinasco Rodríguez, Paola Andrea Bedoya ambiental, apoyan la hipótesis de que las HT participan en la termorregulación al aumentar la producción interna de calor (7). La exposición a bajas temperaturas, eleva las concentraciones plasmáticas de T 3, T 4 y cortisol, por medio de la secreción de TSH (33), y es por ello que los cerdos han aprendido a realizar una simple respuesta con el fin de obtener un refuerzo térmico cuando se coloca en un ambiente frío (34); responden con mayor frecuencia cuando se suministra un nivel inferior de la ingesta de alimentos y cuando la ingesta de alimentos es constante, la tasa de utilización de las hormonas no aumenta, por lo tanto los niveles plasmáticos de T 4 aumentan, lo que retroalimenta el eje tiroideo-hipofisiario y restaura la tasa de secreción de tiroxina a su valor anterior (35). En cuanto a la T 3, Berthon et al. (36) contemplan que desempeña un papel activo en la estabilidad térmica de lechones durante 30 horas posparto y en el músculo esquelético la producción de T 3 aumenta por desyodación de la T 4, lo que puede aumentar la producción de calor en el músculo (33). Por el contrario, un clima marcadamente tropical afecta la fisiología del cerdo, resultando en un estrés calórico, ya que se produce un aumento tanto de la temperatura corporal como del ritmo respiratorio y una disminución en la concentración de HT (37). Algunos de los efectos calorigénicos de las HT son debido al metabolismo de los ácidos grasos, además estas hormonas aumentan la actividad de las enzimas ATPasa de Na + -K + en muchos tejidos (38, 39). El aumento del consumo de oxígeno se correlaciona íntimamente con el aumento del transporte de sodio y la inhibición de ATPasa de Na + -K +, finalmente, como resultado del aumento de la hidrólisis de ATP se observa un aumento del metabolismo oxidativo mitocondrial (7), siendo responsables del efecto calorigénico (38, 39). Las HT también estimulan muchos aspectos del metabolismo de los hidratos de carbono, entre ellos la absorción y movilización de glucosa por las células hacia el tejido adiposo y el músculo, el aumento de la glucólisis, aumento de la gluconeogénesis e incremento de la secreción de insulina, además de ello favorecen la lipólisis (38, 5). HORMONAS TIROIDEAS Y REPRODUCCIÓN La alta tasa de productividad en el cerdo depende de la madurez sexual temprana, una tasa de ovulación relativamente alta, de períodos relativamente cortos de gestación y de lactancia, así como la capacidad de repetir el ciclo de preñez poco después del destete de una camada (40). En muchas ocasiones se da TRH en la alimentación a cerdas en gestación y en lactancia para aumentar la producción de leche, pero en estudios realizados se evidencia que esto afecta negativamente su desempeño reproductivo al retrasar el estro después del destete, esto puede deberse al retiro brusco, creando un estado de hipotiroidismo (2). Igualmente, en ocasiones también se les suministra en la dieta altos contenidos de glucosinolatos de canola pero se sabe que estos son tóxicos y que los lechones pueden presentar bajos niveles de hormonas tiroideas en circulación y por lo tanto bajo peso al final de la gestación (41, 42); es por ello que la disponibilidad de nutrientes presentes en la alimentación y la exigencias de los animales en la etapa de crecimiento y lactancia puede comprometer la fertilidad y por lo tanto la gametogénesis (43). A pesar de que las HT son un regulador crítico del crecimiento somático, el metabolismo, el desarrollo del cerebro y otros procesos vitales en el desarrollo de los animales adultos, no fueron vistas históricamente como un importante regulador de las gónadas. Esto ha sido evaluado en los últimos años, y ahora es claro que tienen acciones importantes en el ovario y el testículo (31, 44). Una posible relación entre estas hormonas y la función ovárica ha sido bien documentada en la literatura basada en estudios in vivo e in vitro. En la evaluación de algunos datos experimentales, solo se puede suponer o teorizar que el mecanismo de regulación es probablemente basado en la interacción entre receptores de HT y gonadotropinas en el ovario, además se conoce las interacciones antagonistas entre HT y estrógenos (45, 46). En un estudio realizado en cerdas se evaluó el efecto de la HT en la actividad proliferativa y 82 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

83 Actualización en el metabolismo de las hormonas tiroideas y su relación con la reproducción en el cerdo la apoptosis de las células de la granulosa en las diferentes etapas de crecimiento folicular, encontrándose sinergismo positivo con la hormona folículo estimulante (FSH) para ejercer efectos estimulantes directos sobre la función de las células de la granulosa, así como la formación y la inducción de enzimas androgénica, entre las cuales se encuentra la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG) (46, 47). Estudios han documentado efectos benéficos de T 3 y T 4 sobre la reproducción general, el crecimiento folicular, la ruptura folicular y la formación del cuerpo lúteo, así mismo se ha demostrado que la combinación de la tiroides, la insulina y el cortisol mejora la luteinización en los porcinos inducida por la LH y la FSH, así como la producción de progesterona (48, 49). Otro estudio realizado por Maruo et al. (50) evidenció que las HT junto con la FSH ejercen efectos estimulantes sobre la diferenciación de células de la granulosa porcinas afectando directamente la esteroidogénesis, igualmente hallaron que T 4 estimula la producción de estradiol en estas células. Por otra parte, alteraciones en las HT pueden contribuir al desarrollo de la infertilidad pues un nivel adecuado de dichas hormonas es necesario para la ovulación; en mujeres con hipotiroidismo grave se ha presentado atrofia ovárica y amenorrea y cuando el hipotiroidismo es resultado de alteraciones autoinmunes también es asociado al aumento de la incidencia de abortos y alteraciones en el desarrollo fetal (44); en machos estas alteraciones pueden producir anormalidades en el volumen de eyaculación, la motilidad, la morfología y la densidad espermática (51). El hipotiroidismo disminuye la LH, FSH, GnRH y la testosterona alterando la esteroidogénesis y la maduración folicular, también puede disminuir el tamaño testicular y la producción de esperma (44, 45). Análisis hechos en cerdas jóvenes hipertiroideas mostraron una disminución de la reactividad ovárica a estas hormonas. En cerdas jóvenes con hipotiroidismo, tal como ha sido demostrado en ratas y ovejas; la susceptibilidad aumenta con la formación de quistes ováricos después de la administración de gonadotropina (45, 52). Por lo tanto, un estado funcional tiroideo diferente, ejerce influencia antagonista en reactivar al ovario en respuesta a gonadotropinas (53). La producción de espermatozoides por el testículo es positivamente relacionada con el tamaño testicular; algunos estudios destacan como los testículos son sensibles a las HT solamente durante un periodo límite de tiempo que puede coincidir con la edad prenatal y prepuberal (54), y confirman que el papel esencial de estas en la regulación de la diferenciación terminal en las células de Sertoli coincide con el cese de las células de multiplicación (55). En cerdos adultos, este periodo sensitivo para la proliferación de las células de Sertoli parece ocurrir antes del nacimiento debido a la incapacidad de la castración unilateral en el primer día de vida para producir un aumento significativo del número de células de Sertoli en la madurez (17). Las HT juegan, entonces, un papel crucial en el desarrollo tanto de las células de Sertoli como en las celulas de Leydig en el testículo (56), y la manipulación de dichas hormonas en el medio puede ser utilizada para producir aumentos sin precedentes en el tamaño de los testículos, el número de células de Sertoli y la producción de esperma (53). El efecto estimulante de la T 3 en la diferenciación de las células de Sertoli es consistente con estudios que muestran que T 3 en la exposición in vitro, estimula muchas facetas de la maduración de las células de Sertoli, como las proteínas de secreción y la producción del factor de crecimiento, la expresión del receptor de hormonas esteroides, la disminución de la expresión aromatasa y la producción de proteínas filamentosas intermedias (44). Se conoce que los TRs están presentes en cantidades superiores en células de Sertoli de neonatos, lo indica que la expresión de TR disminuye a niveles bajos en la edad adulta (44, 57). Se ha postulado que los efectos de la T 3 sobre la proliferación de células de Sertoli y una variedad de otros marcadores en el desarrollo son predominantemente directos, aunque la capacidad de T 3 de alterar los niveles de otras hormonas y los receptores en las células de Sertoli indican que también podría tener efectos indirectos a través de su modulación de 83

84 José Henry Osorio, Jazmín Vinasco Rodríguez, Paola Andrea Bedoya otros sistemas endocrinos de señalización (57). Otros autores han indicado que la T 3 puede inducir sus efectos sobre las células de Sertoli de maduración, por lo menos en parte, controlando los niveles de modulación de proteínas clave que regulan el ciclo celular (44). En los animales con hipotiroidismo neonatal, la reducción de T 3 de señalización permite extender la proliferación de células de Sertoli. En neonatos las células de Sertoli expresan tanto TR-α1 y β1 (21). La restauración del eutiroidismo es un hito en este sistema, se produce en esa diferenciación de las células de Sertoli y estas células se vuelven capaces de soportar la espermatogénesis completa. El aumento de la población de células de Sertoli conduce a un aumento concomitante de las células germinales y a un mayor tamaño de los testículos y de la producción de esperma (44). La FSH es un importante regulador de la proliferación de las células de Sertoli postnatal (58, 59), mientras que la hormona tiroidea T 3 es responsable del cambio de estas células en la mitosis, la condición no mitótica se produce antes de la pubertad (60). Los efectos inhibitorios de las HT sobre estradiol en respuesta a FSH han sido localizados más allá de la formación AMPc. Un papel inhibitorio sobre la actividad de la aromatasa, al interferir negativamente con la producción de AMPc se ha descartado y se ha demostrado que T 3 en sí no influye sustancialmente sobre los niveles de AMPc en condiciones basales, así como en la estimulación de FSH (61). Durante el desarrollo temprano, la expresión aromatasa de las células de Sertoli puede producir estrógenos con efecto potencial autocrino/paracrino sobre las células de Sertoli (62). Así, estos datos sugieren que el papel inhibidor de T 3 sobre la actividad aromatasa influye sobre la formación de AMPc. Esta acción inhibitoria es mucho más evidente en las primeras edades postnatales. Además, la alteración de transcripción inducida por la prolongada exposición a T 3, es un mecanismo por el cual la T 3 puede bajar la regulación de la actividad aromatasa (55). Se sabe que los niveles circulantes de HT en cerdos son bajos en el periodo prenatal, posteriormente se da un dramático aumento al nacimiento, hay un pico durante el periodo neonatal y una nueva alza cerca de la pubertad (63). Algunos autores sugieren que los andrógenos pueden jugar un papel inhibitorio en la proliferación de células de Sertoli y ser involucrados en la disminución proliferativa en células de Sertoli visto en roedores neonatos. Sin embargo, T 3 tiene corto efecto estimulador sobre la expresión de los receptores de andrógeno, probablemente como un resultado de estimular efectos sobre la maduración de las células de Sertoli (57). También se conocen efectos del hipertiroidismo sobre la depuración metabólica del estradiol y la testosterona. Otros trabajos han sugerido que el hipertiroidismo puede aumentar la aromatización de andrógenos a estrógenos, pero los resultados en esta área han sido contradictorios (64). CONCLUSIÓN Las hormonas tiroideas tienen acciones importantes en el ovario y el testículo y juegan un papel crucial en el desarrollo de las células responsables de la reproducción. Alteraciones en las HT pueden desencadenar infertilidad, pues un nivel adecuado de dichas hormonas es necesario para la ovulación y la espermatogénesis. 84 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

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89 Como citar este artículo: Martínez MM, Vargas del Río LM, Gómez VM. Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención. Biosalud. 2013;12(2): AFLATOXINAS: INCIDENCIA, IMPACTOS EN LA SALUD, CONTROL Y PREVENCIÓN María Marcela Martínez Miranda 1 Liliana María Vargas del Río 2 Verónica María Gómez Quintero 3 RESUMEN Las aflatoxinas son metabolitos secundarios tóxicos producidos principalmente por Aspergillus flavus. La necesidad de investigar estas toxinas ha crecido en los últimos años debido a su alta incidencia en los alimentos de consumo masivo y a su toxicidad. Con el fin de profundizar en el conocimiento de las aflatoxinas, este artículo presenta una revisión general sobre estudios que reportan su presencia en alimentos en Latinoamérica, su impacto sobre la salud humana y animal, la legislación colombiana e internacional de aflatoxinas totales o individual, procesos de control, prevención, descontaminación y detoxificación, y por último los principales métodos para su análisis. Se encontró que en América Latina se presenta una incidencia importante de aflatoxinas, en especial la aflatoxina B1 en productos de alto consumo. La investigación en este campo ha contribuido al desarrollado de métodos físicos, químicos y biológicos de descontaminación y detoxificación de aflatoxinas, aunque estos podrían incrementar los costos de producción. Igualmente, estudios para detectar y cuantificar estas micotoxinas, han llevado a la generación de métodos analíticos confiables, siendo el más empleado en los últimos 30 años la cromatografía líquida de alta resolución. En concordancia con lo anterior, es relevante implementar medidas para evitar el crecimiento de hongos productores de aflatoxinas, en procesos de cultivo, cosecha, recolección, almacenamiento y transporte, disminuyendo su presencia en alimentos. Finalmente, el impacto negativo en la salud humana y animal, en especial debido a su carcinogenicidad, muestra la importancia de realizar investigación sistemática en Colombia para comprender los mecanismos de producción y de acción de estas toxinas, generando fundamentos científicos más sólidos para prevenirlas y controlarlas, mediante normativas que regulen su concentración en diferentes matrices alimentarias; advirtiendo que en Colombia aún no se cuenta con resoluciones de obligatorio cumplimiento. Palabras clave: aflatoxinas, incidencia, impactos en la salud, prevención y control, legislación sobre alimentos, descontaminación, análisis. AFLATOXINS: INCIDENCE, IMPACT ON HEALTH, CONTROL AND PREVENTION ABSTRACT Aflatoxins are secondary toxic metabolites produced mainly by Aspergillus flavus. The need to investigate these toxins has grown in the last years due to their high influence in massive food intake and due to their toxicity. 1 Bacterióloga y laboratorista clínico. M.Sc. Microbiología. Docente Departamento de Ingeniería. Universidad de Caldas. Autor para correspondencia: marcela.martinez@ucaldas.edu.co 2 Ingeniera de Alimentos. Especialista en Desarrollo Agroindustrial. Universidad de Caldas. 3 Ingeniera de Alimentos. Universidad de Caldas. ISSN Recibido: septiembre 16 de Aceptado: enero 2 de 2014 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

90 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero In order to go deeper in the knowledge of aflatoxins, this article presents a general review of studies that report their presence in food in Latin America, their impact on animal and human health, the Colombian and international legislation of total or individual aflatoxins, control processes, prevention, decontamination and detoxification, and finally the main methods for their analysis. It was found that in Latin America there is an important presence of aflatoxins, especially B1 aflatoxin in products of high consumption. Research in this field has contributed to the development of physical, chemical and biological methods of aflatoxins decontamination and detoxification, although these methods could increase the production costs. To the same extend, studies to detect and quantify these mycotoxins have driven to the creation of reliable analytical methods being the High Performance Liquid Chromatography the most used in the last 30 years. According to has been mentioned above, it is relevant to implement measures to prevent the growth of aflatoxin producing fungi in processes of farming, harvesting, recollecting, storing and transporting thus, reducing their presence in food. Finally, the negative impact in human and animal health, especially because of its carcinogenicity, shows the importance of carrying out systemic research in Colombia to understand the forms of production and action of these toxins in order to create more solid scientific foundations to prevent and control them through rules that regulate their concentration in different food matrices, warning that currently in Colombia there are no resolutions of mandatory compliance. Key words: aflatoxins, incidence, health impact, prevention and control, legislation on food, decontamination, analysis. INTRODUCCIÓN Las aflatoxinas han sido foco de investigación dentro de las sustancias denominadas micotoxinas, principalmente por su alta incidencia en alimentos y porque su consumo en dosis bajas, medias o altas, causa tanto efectos tóxicos en corto tiempo (agudos), como aquellos que pudieran manifestarse a los meses o años (crónicos), siendo estos últimos los más comunes. Los efectos de las aflatoxinas sobre la salud de organismos vivos son negativos, como es el caso de la aflatoxina AFB 1 considerada por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) como evidente cancerígeno en animales de experimentación, convirtiéndose en la aflatoxina de mayor importancia en salud pública. Por otro lado, las aflatoxinas han sido implicadas en la patogénesis de la malnutrición proteico-energética (PEM), y se ha establecido que aun para los diferentes tipos de animales, la dosis letal oral aguda (DL 50, en mg kg -1 ) es diferente. Se ha sugerido que la alimentación de pollos de engorde con alimentos que contengan bajas concentraciones de AFB 1 puede causar hepatotoxicidad e inducir aflatoxicosis crónica. Igualmente, se ha sugerido que hay diferencia de los impactos en la salud por aflatoxinas entre diferentes razas humanas ocasionados por exposición crónica a estas toxinas. Estas micotoxinas se producen en clima tropical, donde están reunidas las condiciones óptimas de crecimiento de los hongos aflatoxigénicos, principalmente respecto a la humedad relativa y temperatura; resultando contaminados alimentos de alto consumo. Durante el desarrollo de esta revisión se analizarán de forma general los aspectos más relevantes de las aflatoxinas, como son su incidencia en alimentos en América Latina, los principales impactos en la salud humana y animal, la legislación actual internacional y en Colombia, los procedimientos de control y la prevención, los métodos de descontaminación 90 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

91 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención y detoxificación y finalmente, las principales metodologías para su detección y cuantificación en alimentos. AFLATOXINAS Las aflatoxinas son un grupo de compuestos químicos orgánicos no proteicos, de bajo peso molecular, cuyo esqueleto básico es un anillo de furano unido al núcleo de cumarina, producidos principalmente por los hongos Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. nonius; así como los metabolitos de estos compuestos originados en el organismo de los animales que han consumido alimentos contaminados con aflatoxinas (Figura 1) (1, 2). Las aflatoxinas son conocidas desde 1960, cuando en Inglaterra se presentó una epidemia que mató alrededor de pavos alimentados con maní infectado con A. flavus proveniente de Brasil. Los micelios de ésta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas de oleaginosas de maní, girasol, algodón, soja, sésamo, avellanas, almendras y cereales y sus derivados almacenados en sacos o silos (3). Se ha reportado la presencia mundial de aflatoxinas, sobre todo en semillas de plantas cuyas zonas geográficas de vegetación se sitúan en clima tropical, donde están reunidas las condiciones óptimas de crecimiento de los hongos aflatoxigénicos, 80 a 90% de humedad relativa y temperatura de 30 a 35 C; esto explica la frecuente contaminación del maíz y otros (4). AFLATOXINAS EN ALIMENTOS EN AMÉRICA LATINA Figura 1. Estructura química de las aflatoxinas B1, B2, G1, G2 y M1. Las aflatoxinas de mayor interés son las B1, B2, G1 y G2 (toman el nombre con base en la fluorescencia que presentan en capa fina de gel) y la M1 que es el metabolito (derivado hidroxilado) de la AFB 1, que se elimina en la leche de los animales que ingieren piensos contaminados con AFB 1 (1). Las aflatoxinas se han detectado como contaminantes naturales en un gran número de productos agrícolas, habiéndose confirmado su presencia en prácticamente todas las zonas del mundo y, en mayor o menor grado, en casi todos los alimentos de primera necesidad. Los alimentos considerados más susceptibles a la contaminación fúngica con la consiguiente producción de aflatoxinas incluyen típicamente al maíz, cacahuates, pistachos, nueces de Brasil, semillas de algodón y la pulpa seca de coco (copra). También se han encontrado aflatoxinas en semillas oleaginosas como el girasol y la soja, en aceites vegetales sin refinar, en otros frutos secos como las almendras, avellanas y nueces, en las especies como el pimentón, el chile, la pimienta, etc., en las frutas desecadas como los higos secos y las pasas, en el café y el cacao, en el resto de los cereales y sus productos derivados y en los piensos (4). A continuación se presenta una tabla resumen sobre la incidencia de aflatoxinas en diferentes alimentos para consumo humano y animal en América Latina (Tabla 1). 91

92 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero Alimentos Maní tipo japonés, nueces, jengibre, comino semilla, sésamo, curri, semillas de lupino, maní salado y maní pelado. Harina de maíz Tabla 1. Incidencia de aflatoxinas en alimentos en América Latina Incidencia Concentración País Aflatoxinas Referencia (%) (µg kg -1 ) Chile 10,5% Totales ,3 (5) Ecuador 26% B1 4,34-11,26 (6) Maíz y arroz Colombia 12,5% Totales 9,2 (7) Maíz blanco Colombia 16,6-33,3% B (8) 16,7% B1 > 10 16,7% B ,3% Totales ,7% Totales > 10 Arepas de 1,8% B maíz blanco 1,8% Totales 3-10 Maíz amarillo Venezuela 16,6% Totales 20 (9) Trigo, harina Venezuela 43% Totales 0,25-34,2 (10) de maíz, harina de soya, maíz amarillo y sorgo Maíz México 56% Totales - (11) Maíz Argentina 8,23-15,52% Totales 9,72-15,52 (12) Maíz Perú 82% Totales 4,2 (13) Maíz México 33,1% Totales 1-18 (14) Leche Colombia 20% M1 15,6 (15) Queso Colombia 67% M1 240 (16) Alimentos Colombia 10% B1 18,42-71,25 (17) de consumo infantil Maíz Panamá 2,8% B (18) Maíz, cereal, Colombia 8,9% Totales 12,6 (19) arroz, semillas y snacks y cereales para el desayuno. Maíz Guatemala 28,57% Totales - (20) Maíz Colombia 100% B1 15,2-282,6 (21) 92 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

93 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención IMPACTOS EN LA SALUD HUMANA Y ANIMAL Las micotoxinas tienen actividad tóxica aguda sobre especies sensibles que produce: inhibición de la síntesis de proteínas, síndromes de Reye y de Kwashiorkor especialmente en niños de los trópicos, inmunosupresión, irritación dérmica, disrupciones endocrinas, hepatitis aguda y otras perturbaciones metabólicas; el cuadro clínico incluye hígado graso y edema cerebral severo. A largo plazo se presentan efectos carcinogénicos, mutagénicos, teratogénicos, estrogénicos, inmunotóxicos, nefrotóxicos y neurotóxicos (2, 22-32). Las micotoxinas suelen entrar en el cuerpo a través de la ingestión de alimentos contaminados, pero la inhalación de esporas toxigénicas y el contacto cutáneo directo son rutas también importantes (2, 22, 30, 31, 33). Son absorbidas en el tracto gastrointestinal debido a su alta liposolubilidad y biotransformadas en el hígado por enzimas microsomales de la superfamilia del citocromo P450, entre las que se encuentran CYP1A2, 2B6, 3A4, 3A5, 3A7 y GSTM1 (24). Las dos enzimas más importantes son representadas por la CYP3A4 (34), que interviene en la formación de la forma exoepóxido y el metabolito aflatoxina Q1 (AFQ 1 ), y la CYP1A2 forma en su mayoría la forma endoepóxido y la aflatoxina M 1 (AFM 1 ). Adicionalmente, en humanos se producen otros metabolitos como son aflatoxicol, AFP 1, AFB 2á y AFB 1-2,2 dihidrodiol (24). Las aflatoxinas pueden tener un efecto muy negativo en la salud de los organismos vivos, la AFB 1 es considerada por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) como evidente cancerígeno en animales de experimentación y también ha sido clasificada como cancerígeno humano (grupo I), y es la de mayor importancia en salud pública (23-25, 35, 36). En el año 2009, se realizó una investigación sobre la farmacocinética de la AFB 1 con tres personas voluntarias a las cuales se les suministraron bajas dosis orales de esta aflatoxina y se encontró que fue rápidamente absorbida en plasma en todos los voluntarios (24). La AFM 1 se origina en el hígado de los mamíferos luego del consumo de alimentos contaminados con AFB 1. La AFM 1 se excreta en la leche y puede ser ingerida por los humanos al consumir este alimento contaminado, siendo la población infantil la más expuesta (23). La AFM 1 se excreta en las 48 horas siguientes a la ingestión y representa entre el 1-4 % de la AFB 1 ingerida (24). El carcinoma hepatocelular es una de las causas de muerte por cáncer, en especial en regiones de Asia y África, originándose estudios epidemiológicos que buscan correlacionar la presentación del carcinoma con el consumo de aflatoxinas y la interacción de éstas con otras enfermedades hepáticas (23, 29-31, 36). Es importante determinar con mayor claridad la influencia de las aflatoxinas sobre el cáncer de hígado, debido al efecto de otros factores, como la infección ocasionada por el virus de la hepatitis B, el cual podría estar implicado en la etiología del cáncer hepático. A nivel molecular está claro que el gen p53 supresor tumoral, puede estar involucrado no solo en las mutaciones en este gen, que es el cambio más frecuente encontrado en los tumores humanos, sino que éste juega un importante papel en la regulación de la transcripción y la traducción de muchos otros genes involucrados en el control de la división celular y la diferenciación (24, 25, 33). El debate sobre el papel de las aflatoxinas y la hepatitis B en el cáncer de hígado parece resolverse cuando se acepta la interacción entre los dos; con la reacción de las aflatoxinas con el ácido desoxirribonucleico (ADN) del gen y el virus de la hepatitis, teniendo un sitio de unión específico a la proteína producto del gen, la posibilidad de estas interacciones parece totalmente admisible (25, 31). La mutagenicidad de la AFB 1 ha sido establecida previamente mediante ensayos con Salmonella typhimurium empleando la prueba de Ames. Los resultados obtenidos para varios tipos de Salmonella indican que la AFB 1 requiere una activación para producir mutaciones. La ruta de activación es la conversión de AFB 1 en el 93

94 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero metabolito electrofílico AFB1-8,9-epóxido. La formación del epóxido requiere la presencia de un doble enlace entre los carbonos C8-C9, por esta razón las aflatoxinas B2 y G2 son prácticamente atóxicas en comparación con las aflatoxinas B1 y G1. La AFM 1, aunque presenta el doble enlace entre los carbonos C8 y C9, es dos órdenes de magnitud menos tóxica que la AFB 1 en cuanto a carcinogenicidad se refiere. En experimentos con roedores se ha evidenciado que en los humanos la enzima CYP3A4 tiene una menor afinidad por la AFB 1 y en cambio la enzima CYP1A2 posee una alta afinidad. Esta última se conoce por su capacidad para bioactivar muchos pro-carcinógenos a su forma carcinogénica activa (24). Por otra parte, las aflatoxinas han sido implicadas en la patogénesis de la malnutrición proteicoenergética (PEM), una condición que afecta a más de 118 millones (aproximadamente 32%) de los niños en el mundo en desarrollo. En el espectro de PEM incluyendo kwashiorkor, marasmo y kwashiorkor marásmico, algunos investigadores han asociado las aflatoxinas con el desarrollo solo de kwashiorkor específicamente; que es una forma de desnutrición que ocurre cuando no hay suficiente proteína en la dieta. Esto se concluyó luego de la detección de aflatoxinas en más altas frecuencias y concentraciones en pacientes con kwashiorkor que en otros grupos nutricionales, lo cual se atribuye a una posible disminución en el metabolismo de las aflatoxinas en los pacientes con kwashiorkor en comparación con otros grupos. Sin embargo, otros estudios también han implicado a las aflatoxinas en la patogénesis de otros tipos de desnutrición, tales como pérdida del tamaño del músculo (emaciación) y retraso del crecimiento y en estudios experimentales en animales las aflatoxinas dan lugar a deficiencias de micronutrientes incluyendo vitaminas A y D, así como zinc y deficiencias de selenio (29, 35). En un estudio realizado en Nigeria para determinar la asociación entre las aflatoxinas y la malnutrición proteico-calórica (PEM) con mediciones de aflatoxinas en el suero, la orina y los alimentos en el plato de niños nigerianos con PEM, se concluyó que las aflatoxinas son frecuentes en los fluidos corporales de niños sanos y de niños con PEM. Sin embargo, se detectan con más frecuencia y en concentraciones más altas en los niños con PEM, posiblemente debido a la disminución de la excreción o el aumento de la exposición. Futuros estudios prospectivos son necesarios para confirmar si las aflatoxinas pueden contribuir a la patogénesis de todos los tipos de PEM y no necesariamente solo a kwashiorkor (35). La intoxicación aguda por aflatoxinas es excepcional, la intoxicación crónica es la que causa preocupación mundial, ya que ha sido establecido que aún para los diferentes tipos de animales la dosis letal oral aguda (DL 50, en mg kg -1 ) varía desde 0,3 en conejos, 0,6 en gatos, 0,5 a 1,0 en perros, 17,9 en ratas (hembras), 5,5 en ratas (machos), 9,0 en ratones y 10,2 en hámster, entre otros. También se ha encontrado diferencia de los impactos en la salud por aflatoxinas entre diferentes razas humanas ocasionados por exposición crónica a estas toxinas, la dosis tóxica (TD 50, en µg kg 1 peso corporal/día) para carcinogénesis de la AFB 1 para humanos es 132 (25, 27, 29). En el año 2006 se realizó una investigación con pollos de engorde, en la cual se evaluó la ingestión de 0,07 mg kg 1 de AFB 1 en el alimento, y se concluyó que no altera significativamente la actividad enzimática sérica de Alanino-aminotransferasa (ALT), pero sí disminuye la actividad sérica de aminotransferasa (AST). Estos resultados sugieren que el consumo de alimento con bajas concentraciones de AFB 1 (0,07mg kg 1 ), pueden causar hepatotoxicidad en pollos de engorde e inducir aflatoxicosis crónica. Otro factor preocupante es la presencia de aflatoxinas en una variedad de materias primas para la producción de alimentos para animales y humanos, especialmente en maíz, cacahuates, semilla de algodón y frutos secos, lo cual reafirma la importancia de prevenir y controlar el efecto negativo de estas toxinas en la salud (30, 37, 38). 94 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

95 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención LEGISLACIÓN INTERNACIONAL Y COLOMBIANA Dentro del campo de las micotoxinas, las aflatoxinas son las más importantes para los países debido a su alta incidencia y toxicidad, por lo cual se dedica mayor atención a su control tanto en matrices alimentarias para humanos como para animales. Los rangos de concentraciones aceptadas de aflatoxinas en alimentos varían de acuerdo con los países y su forma de legislar, sin embargo se pueden encontrar tendencias relacionadas a los bloques económicos mundiales. Entre los que se encuentran la Unión Europea, La Asociación de Naciones del Sudeste de Asia y el Mercado Común del Sur (MERCOSUR). Dichos grupos han armonizado sus normativas para facilitar el comercio entre naciones. La Unión Europea ha legislado estas micotoxinas en géneros alimenticios para consumo humano y actualmente los niveles máximos admisibles están establecidos entre 2 a 8 μg kg 1 para AFB 1 y de 4 a 15 μg kg 1 para la sumatoria de las cuatro aflatoxinas (B1, B2, G1, G2), dependiendo de los diferentes alimentos (maní, frutos de cáscara, frutos secos y subproductos, cereales y subproductos) para consumo humano directo o como materias primas alimenticias. Se incluyen los productos sometidos a selección o transformación física antes del consumo, teniendo en cuenta que esos procesos pueden reducir la concentración original de AFB 1 (4, 39, 40). Otros países no hacen una discriminación entre productos y usos a los que están destinados, por lo que dan un límite en todos los alimentos, unos para AFB 1, no solo por su toxicidad, sino también por su frecuencia de aparición, y otros para la suma de las cuatro aflatoxinas. Los límites permisibles para la primera se pueden encontrar entre 1-20 μg kg 1, pero su mayoría se encuentra principalmente entre 2-5 μg kg 1 (41). Para las aflatoxinas totales los límites varían entre 0-35 μg kg 1, el límite que aparece con mayor frecuencia es de 4 μg kg 1 en países europeos y asiáticos, seguido de 20 μg kg 1, aplicado por países en América Latina (donde existe también un límite armonizado en MERCOSUR) y en varios países del África. También Estados Unidos, uno de los primeros en fijar un límite para las aflatoxinas, se rige por el valor de 20 μg kg 1 (42, 43). La AFM 1 en productos lácteos se legisla comúnmente separada de las demás por ser tan específica en cuanto a su ocurrencia. Sus límites se encuentran entre 0,025 μg kg 1 en alimentos para lactantes y leches de uso medicinal, 0,5 μg kg 1 para leche líquida y 5 μg kg 1 para leche en polvo. Igualmente varían entre naciones (39, 42-45). En Colombia, existen normas técnicas de aplicación voluntaria que establecen los requisitos para el muestreo y análisis de aflatoxinas totales en alimentos como el maíz (NTC 366), cereales, leguminosas secas y sus productos molidos (NTC 271) (45, 46) y las arepas refrigeradas de maíz (NTC 5372) (47), el contenido máximo de aflatoxinas totales en alimentos para consumo humano (NTC 3581) que se establecen en 10 μg kg 1 (43), así como los métodos de análisis de aflatoxinas de ocurrencia natural (NTC 1232) (48). En 2012 el Codex Alimentarius estableció un contenido de 10 μg kg 1 de aflatoxinas totales en los higos secos listos para el consumo. El contenido máximo se basa en la evaluación llevada a cabo por el Comité Mixto FAO/ OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) en su reunión No. 68 sobre el impacto de la exposición y el riesgo para la salud de diferentes contenidos máximos hipotéticos de aflatoxinas en las almendras, las nueces de Brasil, las avellanas, los pistachos y los higos secos. En lo que respecta a los higos secos, el comité llegó a la conclusión de que, cualquiera que fuera el escenario hipotético con respecto 95

96 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero a los contenidos máximos, no habría ninguna consecuencia significativa en la exposición alimentaria total a las aflatoxinas. Se demostró que aplicando buenas prácticas era posible llegar a un contenido total de 10 μg kg 1 de aflatoxinas (49, 50). Sin embargo, el panel encargado de dicha evaluación reiteró su conclusión anterior de que la exposición a las aflatoxinas procedentes de todas las fuentes debe ser tan bajo como sea razonablemente posible, porque las aflatoxinas pueden causar los impactos negativos a la salud expuestos anteriormente. Se debe dar prioridad a la reducción de la cantidad de alimentos que llegan al mercado altamente contaminados con aflatoxinas, independientemente del tipo de producto (50). CONTROL Y PREVENCIÓN La trazabilidad o rastreabilidad puede definirse como la posibilidad de encontrar y seguir el rastro, a través de todas las etapas de la producción, transformación y distribución de un alimento, un pienso, un animal destinado a la producción de alimentos o sustancias destinadas a ser incorporadas a los alimentos o con posibilidad de serlo, es lo que se conoce como la ruta desde la granja a la mesa. Básicamente, la trazabilidad está formada por tres elementos (51, 52): 1) Buenas prácticas agrícolas: referido a todos los procedimientos que se realizan en el campo y durante la cosecha para evitar el crecimiento de hongos que producen las toxinas. 2) Buenas prácticas de almacenamiento y manufactura: son todas las etapas de empaquetamiento, almacenamiento, transporte e industrialización donde se debe controlar variables como: humedad (menor al 12%), actividad de agua en el alimento (menor a 0,7), temperatura (20-22 C), y una adecuada ventilación con aire frío y húmedo para evitar el crecimiento de hongos toxigénicos y la posible producción de micotoxinas. 3) Sistema de análisis de peligros y puntos críticos de control (HACCP por sus siglas en inglés Hazard analysis and critical control points). Con lo cual se debería tener completo dominio del proceso productivo (53). Dentro de las medidas que se pueden llevar a cabo en campo para prevenir la producción de aflatoxinas, se pueden resaltar las siguientes (54): Durante la siembra Limpieza del terreno de siembra para el nuevo cultivo destruyendo o eliminando las cabezas o frutos de semillas (por ejemplo de maíz, maní o cacahuate, etc.) de cultivos susceptibles de acumular aflatoxinas. Hacer estudios de suelo y entorno, para solo usar la cantidad necesaria de fertilizantes, herbicidas e insecticidas. Uso de semillas resistentes a variedades de hongos micotoxigénicos. Evitar la excesiva densidad de siembra. Hacer una buena rotación de cultivos. Durante la etapa de recolección Recolectar los cultivos cuando estén completamente maduros, a no ser que por dejar que el cultivo llegue a su plena madurez se le exponga a condiciones extremas de calor, lluvias o sequía. Realizar un secado, evitar apilamiento de productos húmedos, con lo que se fomentaría el crecimiento de hongos y posteriormente la producción de aflatoxinas. Proteger contra la lluvia durante el secado al sol. Durante el almacenamiento y transporte Tomar las medidas adecuadas de saneamiento en las estructuras de 96 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

97 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención almacenamiento y transporte. Protección de la lluvia y contacto con el agua. Impedir el acceso a insectos, roedores y aves. Cuando se almacena en sacos, ubicarlos encima de estibas o un medio de aislamiento impermeable entre los sacos y el suelo. Asegurarse de que los cultivos que hayan de almacenarse estén libres de mohos e insectos y que se sequen hasta alcanzar niveles de humedad inocuos (lo ideal sería que los cultivos se secaran hasta llegar a tener un contenido de humedad en equilibrio con una humedad relativa del 70%). Procurar una ventilación constante para asegurar el mantenimiento de las condiciones de aireación y temperatura. Es posible utilizar conservantes como el ácido propiónico (ácido orgánico), poniendo atención en las cantidades que garanticen la inhibición del hongo, pero que no sobrepasen los niveles permitidos en los productos en los que se va a utilizar (según normativa para alimentos y piensos de cada país). DESCONTAMINACIÓN Y DETOXIFICACIÓN La descontaminación se refiere a los métodos por los cuales las micotoxinas son eliminadas o neutralizadas de los alimentos, mientras que la detoxificación son los procedimientos para reducir las propiedades tóxicas de las micotoxinas. El método de descontaminación o detoxificación ideal debe ser fácil de usar, económico, no formar compuestos más tóxicos que la micotoxina original y no alterar las propiedades nutricionales ni organolépticas de los alimentos. Existen diferentes métodos de descontaminación físicos, químicos y biológicos aunque se suele usar combinaciones entre ellos (4). Métodos físicos Estos métodos incluyen: extracción con solventes, adsorción, inactivación por calor e irradiación. Extracción: se ha usado para remover aflatoxinas en semillas oleaginosas, maní y semillas de algodón que a su vez pueden solo ser usadas para alimentación animal. Los solventes usados incluyen etanol al 95%, acetona acuosa al 90%, isopropanol al 80%, hexano-metanol, metanol-agua, acetonitriloagua, hexano-etanol-agua y acetona-hexanoagua. La proporción solvente/muestra ha mostrado ser crucial para la recuperación de la toxina. La extracción con solventes puede remover trazas de aflatoxinas con formación de subproductos tóxicos o reducción del contenido de proteínas y calidad, sin embargo, su aplicación a gran escala es limitada por los altos costos y problemas relacionados con la disposición de residuos tóxicos (55). Adsorción: los agentes adsorbentes son aquellos que tienen la capacidad de quelar las micotoxinas, lo cual permite reducir su disponibilidad. Estos agentes se unen a las micotoxinas que se encuentran en el alimento, evitando su disociación en el tracto digestivo del animal. De manera general, los agentes adsorbentes se clasifican como adsorbentes minerales (arcillas, carbón activado, tierra de diatomeas) y adsorbentes orgánicos (fibras de plantas, extractos de paredes celulares de levadura y bacterias) (56). Actualmente, se están realizando varios estudios sobre el uso de arcillas (por ejemplo, NovaSil) para disminuir la amenaza de la aflatoxina. Un estudio propone que la arcilla de esmectita sea administrada a alimentos contaminados para actuar como un agente de unión. La arcilla se une con moléculas de AFB 1, blindando su absorción en el sistema digestivo cuando se consume, lo cual permite pasar inofensivamente a través del cuerpo (57). 97

98 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero Calor: las aflatoxinas tienen altas temperaturas de descomposición que van desde 237 C a 306 C. Se ha intentado usar calor para inactivar las aflatoxinas en alimentos contaminados, pero esto puede tener repercusiones en las cualidades organolépticas y nutricionales en éstos. Es importante tener en cuenta en estos tratamientos, no solo la temperatura, sino el tiempo de aplicación a la cual se ven sometidos, ya que conlleva a una mayor efectividad en el proceso de descontaminación (4). En las Tablas 2 y 3 se muestran diferentes tratamientos con calor que han sido usados para la descontaminación de alimentos contaminados con aflatoxinas. Tabla 2. Reducción de AFM 1 en leche por pasteurización y esterilización (58) Tratamiento Contaminación a Reducción (%) 62 C, 30 min N C, 30 min A 0 62 C, 30 min A C, 40 s A C, 40 min N C, 45 s N C, 30 min A C, 40 s N C, 16 s N 0 80 C, 45 s N C, 15 min N C, 15 min A 24 Pasteurización N 24 a N, natural; A, artificial. 98 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

99 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención Tabla 3. Reducción de AFM 1 en leche por pasteurización y esterilización (57) Tratamiento Alimento Aflatoxina Nivel inicial (µg kg -1 ) Destrucción (%) Contaminación a Asado: 204 C Maní B1-G N Asado: 204 C Maní B1-G N Asado: 121 C, 30 min Maní B1-G A Asado: 121 C, 30 min Maní B1-G A Asado: 204 C, 5 min Maní B1-G A Asado: 204 C, 5 min Maní B1-G A Asado: 150 C, 30 min Maní B N Asado: 150 C, 30 min Maní B A Autoclave: 116 C, 0,7 bar, 30 min, en salmuera 5% NaCl Maní Total b A Calentamiento: 200 C, 20 min Aceite de oliva B A Calentamiento: 250 C, 10 min Aceite de oliva B A Extrusión: 105 C Maíz Total N a N, natural; A, artificial. b B1 + G1 + B2 + G2. 99

100 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero Irradiación: es una de las últimas técnicas físicas empleadas, sin embargo no consigue destruir las micotoxinas y su mutagenicidad (4). Las aflatoxinas son sensibles a los rayos UV. AFB 1 absorbe luz UV a 222, 265 y 362 nm, lo cual puede llevar a la formación de más de 12 productos de fotodegradación que son menos tóxicos. Hay ejemplos de alimentos tratados con este método como aceite de cacahuate, leche e higos secos (58). Por otro lado, el uso de radiación gamma para inactivar aflatoxinas fue investigada. La toxicidad de una harina de maní contaminada con AFB 1 fue reducida entre un 75% y 100% después de la radiación con rayos gamma a una dosis de 1 a 10 KGy, respectivamente. La presencia de agua juega un importante papel en la destrucción de aflatoxina por rayos gamma, ya que la radiólisis del agua lleva a la formación de radicales libres altamente reactivos. Estos radicales libres pueden atacar la AFB 1, en el anillo furano terminal, resultando en productos de baja actividad biológica (58). Métodos químicos Los estudios han demostrado que los alimentos contaminados por aflatoxinas pueden ser detoxificados mediante el uso de sales inorgánicas y ácidos orgánicos, amonificación y el uso de los agentes aglutinantes de la AFB 1 (59). Sales orgánicas y ácidos orgánicos: Shekhar y colaboradores demostraron la eficacia de seis productos químicos en la degradación de los niveles de aflatoxina en el maíz almacenado. Estos productos químicos no tóxicos son seguros para su uso en alimentos e incluyen carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato de amonio, ácido acético y propionato de sodio (60). Otro estudio registró los efectos del ácido cítrico en la detoxificación de arroz contaminado con aflatoxinas. Los investigadores encontraron que al aplicar ácido cítrico al arroz que tenía bajos niveles de aflatoxinas (menos de 30 µg kg -1 ), éstas eran completamente degradadas. En el arroz que contenía altos niveles de aflatoxinas (30 µg kg -1 o más), un 97,22% de las aflatoxinas eran degradadas (61). Amonificación: actualmente es el recurso económicamente más viable para descontaminación. El amoníaco en forma gaseosa se añade a cultivos en un área sellada y permite impregnar durante 1 a 2 semanas. En un estudio sobre maíz contaminado artificialmente, los procedimientos de amonificación destruyeron 90% de aflatoxinas (62). Esta práctica normalmente hace que los productos anteriormente inseguros para consumo, sean seguros para el consumo animal por la disminución de los niveles de aflatoxinas en un rango menor. Los estudios sobre los pollos de engorde demuestran los efectos de la amonificación sobre estos animales. Los investigadores estudiaron dos grupos de polluelos; un grupo fue alimentado con maíz contaminado con aflatoxinas, mientras que se alimentó otro grupo con maíz contaminado con aflatoxinas que había sido tratado con amoníaco. Después de 6 semanas, el primer grupo mostró un aumento significativo en la tasa de mortalidad, en comparación con el segundo grupo. Así mismo, la ingesta dietética, el aumento de peso y la tasa de conversión alimenticia fue suprimida en los pollos del primer grupo, mientras que los del grupo 2 mostraron un crecimiento normal (63). Nixtamalización: la nixtamalización o hidrólisis alcalina es un proceso precolombino de tratamiento del maíz para la obtención de una masa que se emplea en la fabricación de las tradicionales tortillas mexicanas. Ha sido ampliamente postulado que durante el proceso de la nixtamalización se reduce del 75 al 90% del contenido de aflatoxinas del grano. Un estudio realizado en México por Anguiano-Ruvalcaba y colaboradores 100 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

101 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención concluyó que la nixtamalización tradicional destruye 95% de la aflatoxina presente en maíz contaminado de manera natural y que el proceso es capaz de destruir el aflatoxicol, un compuesto reducido de la AFB 1 que se produce por la acción de una reductasa aislada de organismos superiores, pero que también surge de cepas toxigénicas de A. flavus y otros microorganismos (64). Sin embargo, se ha sugerido que la detoxificación por nixtamalización parece no ser muy efectiva como se pensaba; ya que un alto porcentaje del contenido original de aflatoxinas se revierte a su forma original fluorescente en el medio ácido; a un ph similar al que ocurre durante la digestión, lo que lleva a la reconstitución de las moléculas de aflatoxinas; con el consecuente riesgo que esto implica para la salud humana (65). Ozonización: el ozono (O 3 ) reacciona a través de los doble enlaces 8, 9 del anillo de furano de aflatoxinas a través de ataque electrofílico, causando la formación de ozónidos primarios seguido por transposición en derivados de monozonido tales como aldehídos, cetonas y ácidos orgánicos. Un estudio realizado en Turquía demostró que la reducción del contenido de AFB 1 en los pimientos rojos fue del 80% y el 93% después de la exposición a 33 mg L -1 y 66 mg L -1 de ozono durante 60 min, respectivamente (66). Métodos biológicos Hay tres ramas crecientes de investigación en los métodos biológicos: el uso de agentes biológicos de control, enzimas biotransformadoras y plantas modificadas genéticamente (4). En el primer caso se requiere aplicar hongos u otros microorganismos antagónicos que inhiben el crecimiento de hongos micotoxigénicos y por tanto la presencia de la micotoxina en el producto elaborado. El uso de cepas fúngicas no aflatoxigénicas de Aspergillus flavus y A. parasiticus compite con las cepas micotoxigénicas produciendo una reducción en la contaminación por aflatoxinas cercana al 99% cuando es aplicado en cacahuates. La aplicación de microorganismos como Flavobacterium aurantiacum, que degradan ciertas micotoxinas, ha resultado para la degradación de AFB 1 en aceites vegetales, maíz, cacahuates y derivados. También se ha visto que la aplicación de mezclas probióticas como Lactobacillus y Propionibacterium reduce la biodisponiblidad de la aflatoxina en la dieta (4). Alberts y colaboradores investigaron la degradación de la AFB 1 por Rhodococcus erythropolis y encontraron que este degradó efectivamente esta micotoxina mediante extractos celulares en cultivos líquidos, indicando que la degradación es enzimática y que las enzimas responsables son extracelulares y producidas constitutivamente. Además, la degradación coincidió con la pérdida de la mutagenicidad de la AFB 1 (67). El empleo de enzimas biotransformadoras puede modificar la micotoxina en compuestos derivados, menos tóxicos o no tóxicos respecto a la micotoxina original, para eliminados por la orina o las heces, o bien aplicados a la materia prima para reducirla in situ. Este caso puede tener relación con una enzima sintetizada por F. aurantiacum y que podría ser la responsable de la reducción de la AFB 1 (4). Con respecto al uso de plantas para control biológico extractos acuosos obtenidos a partir de semillas y hojas de varias plantas medicinales fueron evaluadas por su habilidad para detoxificar la AFG 1. Se encontró que la degradación de las aflatoxinas B1, G1, B2 y G2 por los extractos de Trachyspermum ammi estuvo entre un 46% y 65% dentro de 6 h a 24 h de incubación, concluyendo que los extractos biológicos de T. ammi puede proveer un método biológicamente seguro para proteger a los alimentos de las aves de corral o ganado y otros productos agrícolas de la contaminación por las aflatoxinas (68). 101

102 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero MÉTODOS DE ANÁLISIS Los métodos normalizados de análisis para diferentes micotoxinas, validados por estudios interlaboratorio, han sido recomendados por parte de la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) y el Comité Europeo de Normalización (ECS). Como métodos oficiales de análisis de la AOAC se pueden encontrar alrededor de cuarenta métodos validados para análisis de micotoxinas pertenecientes a diferentes familias químicas, mientras que el ECS ha publicado un documento con criterios específicos para varios métodos de análisis de micotoxinas. A continuación se abordarán las técnicas analíticas más empleadas en el análisis de aflatoxinas, teniendo en cuenta la extracción y purificación, las técnicas de exploración o screening y las técnicas de confirmación (4). a) Extracción y purificación La mayoría de los métodos utilizados para la determinación de micotoxinas necesitan métodos confiables de extracción y purificación. Estos pasos son vitales para un protocolo exitoso, ya que consumen mucho tiempo (la preparación de la muestra es el principal factor de tiempo en un análisis y toma aproximadamente dos tercios del total) y afectará la elección final de procedimiento de detección. El método de extracción utilizado para extraer micotoxinas de la matriz biológica es dependiente de la estructura de la toxina. Toxinas hidrófobas tales como las aflatoxinas se extraen usando disolventes orgánicos (69). Los solventes orgánicos más empleados son el metanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, diclorometano y hexano y mezcla de ellos (4). La elección de los disolventes de extracción también es dependiente de la matriz de la que se requiere extraer la toxina, ya que mezclas químicas diferentes pueden afectarla. El procedimiento de purificación utilizado en un protocolo es el paso más importante, ya que la pureza de la muestra afecta la sensibilidad de los resultados. Cantidades traza de una molécula diana pueden estar enmascarados por compuestos que interfieren, encontrados no solo en la matriz, sino en los productos químicos, materiales y disolventes utilizados en la técnica. La cristalería también debe estar libre de contaminación, tales como detergentes alcalinos, que pueden formar sales con los compuestos y dando como resultado tasas de detección más bajos (69). Las técnicas más utilizadas para extracción y purificación en el análisis de micotoxinas son las siguientes (4): 1. Extracción en fase sólida: Extracción en fase sólida convencional. Extracción con columnas Mycosep. Dispersión de matriz en fase sólida. Microextracción en fase sólida. 2. Extracción con columnas de intercambio iónico. 3. E x t r a c c i ó n c o n c o l u m n a s d e inmunoafinidad. 4. Extracción por fluidos supercríticos. 5. Extracción asistida por microondas. 6. Extracción acelerada por disolventes. b) Técnicas de exploración o screening La finalidad analítica de las técnica de exploración o screening es la de descartar, de una manera rápida, las muestras negativas y reducir al máximo el número de análisis. Se aplican cuando existe un gran número de muestras, sin embargo es recomendable usar alguna técnica de confirmación para validar los resultados positivos, dado que en general los métodos de screening son relativamente sensibles pero poco selectivos. Las técnicas de exploración más usadas para el análisis de micotoxinas son los inmunoensayos y los biosensores (4). Inmunoensayos. Los inmunoensayos para analitos moleculares pequeños (haptenos) (por ejemplo, las aflatoxinas en solución) se pueden realizar como ensayos homogéneos sin separación de los reactivos, pero más comunes 102 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

103 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención son las pruebas heterogéneas en las que los reactivos sin reaccionar se eliminan antes de la evaluación. Hay tres tipos de ensayo, que utilizan concentraciones limitadas de anticuerpos: 1) ensayo indirecto competitivo; 2) ensayo directo competitivo, y 3) ensayo no competitivo (70). Dos técnicas se han usado ampliamente para el análisis de micotoxinas: el radioinmunoensayo (RIA) y el enzimoinmunoensayo (ELISA). El primero de ellos consiste en añadir al medio de reacción un anticuerpo específico y una cantidad conocida de la micotoxina marcada radioactivamente, la cual se incuba con las muestras problema. Tras un lavado del medio, se mide la radioactividad emitida por la muestra con un contador de centelleo, siendo la medida inversamente proporcional a la concentración de la micotoxina en la muestra problema. La técnica de ELISA se basa en la reacción específica antígeno-anticuerpo y puede ser de tipo competitivo directo o indirecto (71). Biosensores. Un biosensor es un dispositivo analítico para la detección de un analito que combina un componente biológico con un componente detector fisicoquímico. Una tecnología prometedora para la detección rápida de aflatoxinas es el biosensor de resonancia de plasmones superficiales (SRP). El principio de la resonancia de plasmón superficial se basa en la detección de un cambio del índice de refracción del medio, cuando un analito se une a una molécula inmovilizada (anticuerpo) (72). Los biosensores para la detección de aflatoxinas podrían ser muy útiles como una prueba de campo cualitativo/semicuantitativo para la identificación de muestras positivas, lo que reduce el número de muestras que se tienen que analizar en el laboratorio con métodos estándar de análisis. Los ensayos con biosensores son rápidos, fáciles de realizar y de bajo costo, y podrían ser ventajosos en comparación con ELISA o Cromatografía de Gases Masas (GC/ MS) para el análisis de alimentos; pero son necesarias mejoras en los parámetros analíticos tales como la precisión, exactitud y los límites de detección (especialmente en aplicaciones de biosensores para las aflatoxinas) (72). c) Técnicas de confirmación Según Soriano y colaboradores, las técnicas más empleadas en los últimos 30 años para el análisis de las aflatoxinas han sido: cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un 70% de uso, cromatografía de capa fina con un 23% y electroforesis capilar con un 2% (4). El presente artículo de revisión se centrará en HPLC, sus ventajas y desventajas en el análisis y detección de las aflatoxinas. Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). El método más utilizado para detectar aflatoxinas se basa en técnicas cromatográficas como el HPLC combinados con un detector de fluorescencia o con nuevos equipos como el UPLC (Ultra Pressure Liquid Chromatography) que mejoran sus características. La cromatografía es un procedimiento analítico que se basa en la separación, identificación y cuantificación de los constituyentes de una mezcla. El principio se fundamenta en los equilibrios de concentración de los compuestos presentes entre dos fases no miscibles. Una de ellas, llamada fase estacionaria, está inmovilizada en una columna o fijada sobre un soporte y la otra, llamada fase móvil, se desplaza en el seno de la primera. La velocidad de elución de los analitos de interés presentes en la fase móvil dependerá de la solubilidad de éstos en la fase móvil y de la fuerza de interacción de dicho compuesto con la fase estacionaria (73). Varios métodos analíticos para la determinación de las principales aflatoxinas han sido desarrollados y continuamente mejorados. Entre los métodos convencionales, la técnica más frecuentemente usada para medir micotoxinas en cereales y subproductos es HPLC acoplada a extracción con columnas de inmunoafinidad. Varios métodos inmunológicos, ELISA y otras 103

104 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero pruebas rápidas basadas en anticuerpos, son generalmente usadas para screening, aunque estos métodos requieren a menudo análisis confirmatorios con métodos más robustos. En la Tabla 4 se muestran los ventajas y desventajas de los métodos tradicionales y emergentes para en análisis de micotoxinas. Tabla 4. Ventajas y desventajas de métodos tradicionales y emergentes para el análisis de micotoxinas (74) Método Ventajas Desventajas CG Análisis simultáneo de micotoxinas, b u e n a s e n s i b i l i d a d, p u e d e s e r automatizado (automuestreador). Equipo costoso, requiere experticia, requiere derivatización, problemas de interferencia de matriz, curva de calibración no lineal, efectos de arrastre de la muestra anterior, variación en reproducibilidad y repetibilidad. HPLC Buena sensibilidad, buena selectividad, buena repetibilidad, puede ser automatizado (automuestreador), tiempos de análisis cortos, métodos oficiales disponibles. Equipo costoso, requiere experticia, puede requerir derivatización. LC/MS Análisis simultáneo de micotoxinas, buena sensibilidad, provee confirmación, no requiere derivatización. Muy costoso, requiere experticia, la sensibilidad depende de la técnica de ionización, curva de calibración asistida por la matriz (para análisis cuantitativo), falta de estándares internos. ELISA Preparación simple de la muestra, equipo no costoso, alta sensibilidad, análisis simultáneo de múltiples muestras, útil para screening, uso limitado de solventes orgánicos. Reactividad cruzada con micotoxinas relacionadas, problemas de interferencia de matriz, posibles resultados falsos negativos/ positivos, requiere confirmación. GC = Gas Chromatography; HPLC = High Performance Liquid Chromatography. LC/MS = Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry; ELISA = Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. CONCLUSIONES En América Latina se ha encontrado una alta incidencia de aflatoxinas, en especial la AFB 1, en productos agrícolas como el maíz, arroz, maní y sorgo entre otros, confirmando que las aflatoxinas siguen siendo contaminantes naturales ampliamente distribuidos en alimentos y piensos de alto consumo humano y animal. La incidencia negativa en la salud humana y de animales de las aflatoxinas, particularmente debido a su carcinogenicidad demostrada en varias investigaciones, evidencia la necesidad de realizar investigación sistemática en Colombia para comprender los mecanismos de producción y de acción de las mismas en los cultivos de alimentos, las materias primas, el organismo humano y animal y sus efectos negativos, 104 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

105 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención generando cada vez más fundamentos científicos sólidos para prevenir, vigilar y controlar estas toxinas en Colombia. Si bien existen normativas que regulan la cantidad de micotoxinas, en Latinoamérica hace falta reforzarlas con resoluciones obligatorias que especifiquen cantidades según grupos de alimentos, teniendo en cuenta las frecuencias de consumo y riesgo que cada uno de ellos tiene para la población. Todas las medidas que se tomen para evitar el crecimiento de los hongos, en procesos de cultivo, recolección y cosecha, almacenamiento y transporte, llevará a disminuir el riesgo de producción de las aflatoxinas. La aplicación de un plan de trazabilidad desde la granja a la mesa, no solo da un seguimiento de cada uno de los productos, sino un conocimiento específico de cada una de las etapas por las que éste pasa antes de llegar al consumidor final y sus riesgos asociados como la presencia de aflatoxinas. Los métodos de descontaminación o detoxificación de aflatoxinas incluyen métodos físicos, químicos y biológicos y se suelen usar en combinación cuando los alimentos y piensos ya están contaminados con estas para eliminar, neutralizar y/o reducir sus propiedades tóxicas. Es importante contar con métodos analíticos confiables para la detección y cuantificación de aflatoxinas en alimentos, como herramienta indispensable para el control de las mismas. El método más empleado en los últimos 30 años ha sido HPLC, pero independientemente del método de análisis empleado, es crucial una representativa recolección de la muestra y una adecuada extracción y purificación de la misma. 105

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107 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención 20. Salazar Juárez LF. Determinación de la presencia de aflatoxinas en granos de maíz (Sea mays) producidos en Petén y distribuidos en la central de mayoreo de la ciudad capital, y elaboración de un Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (APPCC). Guatemala: Universidad de San Carlos; Acuña CA, Díaz GJ, Espitia ME. Aflatoxinas en maíz: reporte de caso en la costa atlántica colombiana. Rev. Med. Vet. Zoot. 2005; 52: Zahin ME. Impact of mycotoxins on humans and animals. Journal of Saudi Chemical Society 2011; 15: Duarte S, Villamil LC. Micotoxinas en la salud pública. Revista Salud Pública 2006; 8(1): International Agengy For Research On Cancer (IARC). Chemical Agents and Related Occupations: Review of Human Carcinogens - Aflatoxins. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans 2012; 100: Moss MO. Risk assessment for aflatoxins in foodstuffs. Int Biodeterior Biodegradation 2002; 50: Fasullo M, Smith A, Egner P, Cera C. Activation of aflatoxin B1 by expression of human CYP1A2 polymorphisms in Saccharomyces cerevisiae. Mutation Research 2014: 761: Bbosa GS, Kitya D, Lubega A, Ogwal-Okeng J, Anokbonggo WW, Kyegombe DB. Capítulo 12: Review of the Biological and Health Effects of Aflatoxins on Body Organs and Body Systems. Creative Commons Attribution License: INTECH; Kimanya ME, Shirima CP, Magoha H, Shewiyo DH, De Meulenaer B, Kolsteren P, Yun Gong Y. Co-exposures of aflatoxins with deoxynivalenol and fumonisins from maize based complementary foods in Rombo, Northern Tanzania. Food Control 2014; 41: Chen K, Yuan S, Chen J, Peng X, Wang F, Cui F, Fang J. Effects of sodium selenite on the decreased percentage of T cell subsets, contents of serum IL-2 and IFN-c induced by aflatoxin B1 in broilers. Research in Veterinary Science 2013; 95: Liu Y, Chang CC, Marsh GM, Wu F. Population attributable risk of aflatoxin-related liver cancer: Systematic review and meta-analysis. European Journal of Cancer 2012; 48: Asim M, Sarma MP, Thayumanavan L, Kar P. Role of Aflatoxin B1 as a risk for primary liver cancer in north Indian population. Clinical Biochemistry 2011; 44: Schleicher RL, McCoy LF, Powers CD, Sternberg MR, Pfeiffer CM. Serum concentrations of an aflatoxin-albumin adduct in the National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) Clinica Chimica Acta 2013; 423: Yang X, Zhang Z, Wang X, Wang Y, Zhang X, Lu H, Wang SL. Cytochrome P450 2A13 enhances the sensitivity of human bronchial epithelial cells to aflatoxin B1-induced DNA damage. Toxicology and Applied Pharmacology 2013; 270: Li AP, Uzgare A, LaForge YS. Definition of metabolism-dependent xenobiotic toxicity with co-cultures of human hepatocytes and mouse 3T3 fibroblasts in the novel integrated discrete multiple organ co-culture (IdMOC) experimental system: Results with model toxicants aflatoxin B1, cyclo. Chemico-Biological Interactions 2012; 199: Onyemelukwe GC, Ogoina D, Ibiam G E, y GH Ogbadu. Aflatoxins in body fluids and food of Nigerian Children with protein energy malnutrition. African Journal of Food, Agriculture, Nutrition and Development 2012; 12(5): Afshar P, Shokrzadeh M, Kalhori S, Babaee Z, Saeedi Saravi SS. Occurrence of Ochratoxin A and Aflatoxin M1 in human breast milk in Sari, Iran. Food Control 2013; 31: Arrieta D, Pérez M, Gómez C, Molero G, Novoa E, Rincón H, et al. Efecto del alimento contaminado con aflatoxina B1 (0,07 mg/kg) sobre la morfología hepática y actividad enzimática sérica (AST y ALT) en pollos de engorde. Rev Cient (Maracaibo) 2006; 16(1). 38. Kimanya ME, Shirima CP, Magoha H, Shewiyo DH, De Meulenaer B, Kolsteren P, Yun Gong Y. Co-exposures of aflatoxins with deoxynivalenol and fumonisins from maize based complementary foods in Rombo, Northern Tanzania. Food Control 2014; 41: FAO. Reglamentos a nivel mundial para las micotoxinas en los alimentos y en las raciones en el año FAO;

108 María Marcela Martínez Miranda, Liliana María Vargas del Río, Verónica María Gómez Quintero 40. Ministerio de Relaciones con las Cortes y de la Secretaría de Gobierno. Real decreto 475 Límites máximos permitidos de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 en alimentos para consumo humano. Madrid; Gimeno A. La legislación de la Unión Europea y tolerancias para algunas micotoxinas en la alimentación. engormix. [En línea] 20 de octubre de [Citado el 16 de Agosto de 2013]. Disponible en: MA-micotoxinas/articulos/legislacion-union-europea-tolerancias-t524/p0.htm 42. MERCOSUR/GMC. Res No. 25/02: Reglamento técnico Mercosur sobre límites máximos de aflatoxinas admisibles en leche, maní y maíz (derogación de la res. GMC nº 56/94). MERCOSUR; Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Nivel máximo permitido de aflatoxinas en alimentos. NTC Primera Actualización. ICONTEC; Díaz GJ. Aflatoxina M1: un carcinógeno de potencial presencia en la leche. Bogota: Universidad Nacional de Colombia; Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Industria Alimentaria. Maíz en grano para consumo. NTC 366. Cuarta Actualización. ICONTEC; Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Cereales, leguminosas y sus productos molidos. Muestreo de lotes estaticos. NTC 271. Tercera Actualización. Bogotá: ICONTEC; Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Arepas de maíz refrigeradas. Especificaciones de producto. NTC Primera Actualización. ICONTEC; Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. Granos y cereales. Método de análisis de Aflatoxinas de ocurrencia natural (B1, B2, G1 y G2). NTC Primera Actualización. ICONTEC; Comisión Europea. Reglamento (UE) No. 1058/2012 de la Comisión por el que se modifica el Reglamento (CE) No. 1881/2006 en lo que respecta al contenido máximo de aflatoxinas en los higos secos; Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain. Effects on public health of an increase of the levels for aflatoxin total from 4 μg/kg to 10 μg/kg for tree nuts other than almonds, hazelnuts and pistachios. The EFSA Journal 2009; 1168: Insua V. Trazabilidad avanzada: guía práctica para la aplicación de un sistema de trazabilidad en una empresa alimentaria. Ideaspropias Editorial S.L.; ISBN , Marvin HJP, Kleter GA, Van der Fels-Klerx HJ, Noordam MY, Franz E, Willems DJM, Boxall A. Proactive systems for early warning of potential impacts of natural disasters on food safety: Climate-change-induced extreme events as case in point. Food Control 2013; 34(2): FAO. Manual sobre la aplicación del sistema de análisis de peligros y de puntos criticosde control (APPCC) en la prevencion y control de las micotoxinas. ISSN Comisión del Codex Alimentarius. Código de prácticas para reducir la Aflatoxina B1 presente en las materias primas y los piensos suplementarios para animales productores de leche. CAC/RCP ; Borrell J, Gimeno G. Micotoxinas en los alimentos: medidas de prevención y detoxificación. Selecciones Avícolas p Tapia M, et al. Uso de secuestrantes para disminuir la toxicidad de micotoxinas en alimentos para acuicultura. Memorias del Décimo Simposio Internacional de Nutrición Acuícola; p Dixon JB, Kannewischer I, Tenorio Arvide MG, Barrientos Velásquez AL. Aflatoxin sequestration in animal feeds by quality-labeled smectite clays: An introductory plan. Applied Clay Science 2008; 40: Rustom IYS. Aflatoxin in food and feed: occurrence, legislation and inactivation by physical methods. Food Chemistry 1997; 59(1): United States Agency for International Development, USAID. Aflatoxin: A synthesis of the research in health, agriculture and trade. [En línea] [Citado el 27 de Agosto de 2013]. Disponible en: org/~/media/files/projects/aflatoxin%20microsite/paca%20general%20documents/aflatoxin%20desk%20 Study%20Final%20Report% pdf 60. Shekhar M, Singh S, Khan AAA, Kumar S. Efficacy of Inorganic salts and Organic acids against Colony Growth of Aspergillus flavus and Their use to control Aflatoxin level in Post Harvest Maize. Internet Journal of Food Safety 108 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

109 Aflatoxinas: incidencia, impactos en la salud, control y prevención 2009; 11: Safara M, Zaini F, Hashemi SJ, Mahmoudi M, Khosravi AR, Shojai-Aliabadi F. Aflatoxin detoxification in rice using citric acid. Iranian J Publ Health 2010; 39(2): Nyandieka HS, Maina JO, Nyamwange C. Detoxification of Aflatoxin in Artificially Contaminated Maize Crop by Ammoniation Procedures. Discovery and Innovation 2009; 21: Allameh A, Safamehr A, Mirhadi SA, Shivazad M, Razzaghi-Abyaneh M, Afshar-Naderi A. Evaluation of biochemical and production parameters of broiler chicks fed ammonia treated aflatoxin contaminated maize grains. Animal Feed Science and Technology 2005; 122(3-4): Anguiano GL, Vargas AV, Guzmán D. Inactivación de aflatoxina B1 y aflatoxicol por nixtamalización tradicional del maíz y su regeneración por acidificación de la masa. Salud Pública Mex 2007; 47: Arámbula Villa G. La detoxificación de las aflatoxinas, lograda mediante el proceso de nixtamalización, es reversible. Procedente de 1er Simposio La Investigación y el desarrollo Tecnológico. Queretaro; Inan F, Pala M, Doymaz I. Use of ozone in detoxification of aflatoxin B1 in red pepper. Journal of Stored Products Research 2007; 43: Alberts JF, Engelbrecht Y, Steyn PS, Holzapfel WH, Van Zyl WH. Biological degradation of aflatoxin B1 by Rhodococcus erythropolis cultures. International Journal of Food Microbiology 2006; 109: Velazhahan R, Vijayanandraj S, Vijayasamundeeswari A, Paranidharan V, Samiyappan R, et al. Detoxification of aflatoxins by seed extracts of the medicinal plant, Trachyspermum ammi (L.) Sprague ex Turrill Structural analysis and biological toxicity of degradation product of aflatoxin G1. Food Control 2010; 21: Turner NW, Subrahmanyam S, Piletskyb SA. Analytical methods for determination of mycotoxins: A review. Anal Chim Acta 2009; 632(2): Peiwu Li, Zhang Q, Zhang W. Immunoassays for aflatoxins. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2009; 28(9): Zheng MZ, Richar JL, Binder J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia 2006; 161: Mosiello L, Lamberti I. Biosensors for Aflatoxins Detection. [aut. libro] and Lamberti Ilaria Mosiello L. [ed.] Dr Irineo Torres-Pacheco. Aflatoxins - Detection, Measurement and Control p Herrero Querol L. Puesta a punto y validación de un método de análisis de aflatoxinas en frutos secos y cereales. Universidad de Zaragoza; Pascale MN. Detection methods for mycotoxins in cereal grains and cereal products. Proc. Nat. Sci 2009; 117:

110 Como citar este artículo: Osorio JH. Implicaciones metabólicas y clínicas de algunas drogas de diseño. Biosalud. 2013;12(2): IMPLICACIONES METABÓLICAS Y CLÍNICAS DE ALGUNAS DROGAS DE DISEÑO José Henry Osorio 1 RESUMEN Antecedentes: Las drogas de diseño del tipo anfetamina, o de benzil y fenil piperazina, o del tipo pirrolidinfenona, producen sentimientos de euforia, energía y deseos de socializar, por eso son conocidas como rave drugs o drogas de club. A pesar de que los consumidores aducen que son drogas seguras, estudios experimentales en biomodelos y de tipo epidemiológico en humanos, indican riesgos potenciales para quien las usa. Materiales y Métodos: El presente artículo de revisión analiza, cualitativamente, la literatura científica disponible en las bases de datos Science Direct y PUBMED, relacionada con el metabolismo de estas drogas recreacionales y sus implicaciones en salud. Resultados: Se obtuvo información pertinente relacionada con los objetivos propuestos, por lo cual puede clasificarse en 2 secciones a saber: metabolismo de las drogas de diseño e implicaciones clínicas de su consumo. Conclusión: Las vías metabólicas que involucran isoenzimas P450 son responsables de la degradación hepática de las drogas de diseño. Existen riesgos potenciales para quien las consume, entre los que se encuentran el síndrome de serotonina, hepatotoxicidad, neurotoxicidad y psicopatología. Palabras clave: drogas de abuso, drogas de diseño, éxtasis, piperazina, pirrolidinfenona, metabolismo. METABOLIC AND CLINICAL IMPLICATIONS OF SOME DESIGNED DRUGS ABSTRACT Background: Designer drugs of the amphetamine, benzyl, phenyl piperazine, or pyrrolidinophenone type produce feelings of euphoria and energy and a desire to socialize, reason why they are known as rave drugs or club drugs. Although consumers adduce that these are safe drugs, experimental studies using bio models and epidemiological studies in humans, indicate potential risks for users. Materials and Methods: The review article analyses quantitatively scientific literature from Science Direct and PUBMED data bases related to metabolism of these drugs and their implications in health. Results: Relevant information related to the objectives proposed in the present review was found and it can be classified in 2 sections as follows: metabolism of designer drugs and clinical implications of consumption of designer drugs. Conclusion: The metabolic pathways which involve P450 isoenzymes are responsible for hepatic degradation of designer drugs. There are potential risks for consumers such as serotonin syndrome, hepatotoxicity, neurotoxicity, and psychopathology. Key words: abuse drugs, designer drugs, ecstasy, piperazine, pyrrolidinophenone, metabolism. 1 Laboratorio de Investigación en Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. Correo electrónico: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co ISSN Recibido: agosto 15 de Aceptado: febrero 2 de 2014 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

111 Implicaciones metabólicas y clínicas de algunas drogas de diseño Abreviaturas Derivados de la anfetamina: MDA: metilenodioxianfetamina: MDMA: R,S metilenodioximetanfetamina; MDE: R,S metilenodioxietilanfetamina; BDB: R,Sbenzodioxazolilbutanamina; MBDB: R,S-Nmetil-benzodioxazolilbutanamina; Derivados de la piperazina: benzilpiperazinas (BZP: N-benzilpiperazina; MDBP: R, S - m e t i l e n e d i o x i b e n z i l p i p e r a z i n a ) ; fenilpiperazinas (mcpp: 1-(3-clorofenil) piperazina; TFMPP: 1-(3 trifluorometilfenilpiperazina; MeOPP: 1-(4-metoxifenilpiperazina). Derivados de la pirrolidinofenona: PPP: R,S-pirrolidinopropiofenona; MOPPP: R,S-metoxi-pirrolidinopropiofenona; MDPPP: R,S metilenedioxi pirrolidinopropiofenona; MPPP: R,S- metil-pirrolidinopropiofenona MPHP: R,S-metil-pirrolidinohexanofenona. INTRODUCCIÓN El eslogan PLUR (peace, love, unity and respect) comprende los valores de la denominada cultura rave, una versión moderna del fenómeno hippy de los años sesenta, pero en la cual las fiestas clandestinas en las que participan personas plenamente integradas a la sociedad, incluyen música electrónica y el consumo simultáneo de múltiples sustancias químicas con ánimo recreativo (1-3). Últimamente se denomina a esta tendencia cultura de club o simplemente fiesta, por haber sido trasladada a los clubes del mundo (4); en ella predomina el consumo de 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA o éxtasis ) y sus derivados, el gammahidroxibutirato (GHB, éxtasis líquido ), la metanfetamina (speed), la ketamina, el flunitrazepam, el dextrometorfano, el óxido nitroso, la lisergida (LSD) o los hongos tipo Psylocibe, durante sesiones maratónicas de baile al ritmo de la música electrónica, buscando con ello un estado trascendente de euforia, con amplificación de sensaciones de euforia o de alucinación (5). Por eso, es común el consumo asociado de varias drogas a la vez (6-8). El grupo de sustancias de síntesis con efectos intermedios entre los alucinógenos y los estimulantes, se denomina drogas de diseño e incluye sustancias como los derivados anfetamínicos, los entactógenos y los alucinógenos, el cual debe diferenciarse de otro grupo de sustancias denominadas drogas de síntesis, que incluye varias sustancias de consumo ilícito y de naturaleza sintética, como el LSD, heroína, derivados triptamínicos, entre otras. La estructura original de la dextroanfetamina se sintetizó en 1887, y en 1914 Merck patentó drogas como el MDMA, más conocida como éxtasis, el MDA (Adán) y el MDE (Eva), buscando fármacos anorexígenos, pero sus efectos psicoestimulantes solo se describieron hasta 1933 (9, 10). La toxicidad de las anfetaminas se potencia con el alcohol (11). La metanfetamina es el psicoestimulante usado más frecuentemente, puede ser inyectable, fumable o tomada oralmente. La anfetamina es mucho menos popular y los consumidores de otras drogas como la heroína, se inclinan más por el metilfenidato (Ritalina), metcation (cat and goobs) y metilenodioximetanfetamina (MDMA) conocido como éxtasis (12). De manera general, dentro de las drogas de diseño pueden identificarse dos grupos, a saber: anfetaminas entactógenas (capacidad de producir inusitada apertura emocional y empatía afectiva para con el entorno inmediato que rodea al adicto en el momento de padecimiento de los efectos típicos) o derivados metilenodioxianfetaminas, c o m o 3, 4 - m e t i l e n o d i o x i a n f e t a m i n a, conocida como MDA o píldora del amor ; 3,4-metilelenodioximetanfetamina ( M D M A, é x t a s i s, A d á n, X T C ) ; 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA o MDE, Eva ); N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2 butamina (MBDB) y anfetaminas alucinógenas (derivados metoxianfetaminas) como 4-bromo- 2,5-dimetoxianfetamina (DOB);4-metil-2,5- dimetoxianfetamina (DOM, serenity-tranquilitypeace o STP); 2,4,5-trimetoxianfetamina (TMA-2); parametoxianfetamina (PMA) (13). Existen otros dos grupos importantes de drogas de diseño: las derivadas de la piperazina 111

112 José Henry Osorio (benzilpiperazinas y fenilpiperazinas) y las derivadas de la pirrolidinofenona (14). Figura 1. Estructura química de la anfetamina. METABOLISMO DE LAS DROGAS DE DISEÑO Metabolismo de las anfetaminas Las anfetaminas pueden ingresar al organismo vía oral, por inhalación o por inyección intravenosa. Se absorben directamente de la mucosa nasal y gastrointestinal y penetran libremente la barrera hematoencefálica (15). Su metabolismo es muy variable y cerca del 30% del producto consumido puede ser eliminado sin cambios en la orina. La vida media en plasma varía entre 5 y 30 horas, dependiendo del flujo de orina y el ph, presentándose mayor eliminación en orinas ácidas (16). Las anfetaminas o sus metabolitos pueden ser detectadas en la orina por varios días después de la ingestión y su excreción es prolongada después de la administración de grandes dosis o en presencia de orina alcalina; por eso algunos consumidores toman deliberadamente bicarbonato al mismo tiempo, para retardar la excreción y mejorar el efecto de la droga (17). El éxtasis, derivado de la anfetamina, tiene efectos similares que comienzan aproximadamente 20 minutos después de la ingestión, con una duración que va entre las 5 y las 48 horas, siendo metabolizado por el hígado y eliminado vía renal (18, 19). Los metabolitos de las fases I y II de las drogas de diseño, han sido identificados en orina y microsomas hepáticos de humanos y ratas (20). Dos vías son postuladas, la primera incluye demetilación seguida por metilación y la segunda glucoronidación y/o sulfatación. La demetilación es principalmente catalizada por CYP2D1:6 o CYP3A2:4, pero también por mecanismos CYP independientes. En humanos, MDMA y MBDB podrían además ser demetilados por CYP1A2. La N-demetilación es principalmente catalizada por CYP1A2, así como la N-deetilación por CYP3A2:4. (21). Metabolismo de las piperazinas Las benzilpiperazinas son metabolizadas por alteración de su grupo aromático, mediante hidroxilación o mediante demetilación. Luego de una N-dealquilación pasan a piperazina y degradación metabólica de la piperazina heterocíclica a su correspondiente etilenodimina o anilina y sus derivados (22). Las fenilpiperazinas son más extensamente metabolizadas que las benzilpiperazinas y excretadas casi exclusivamente como metabolitos. La mayor cantidad de reacciones metabólicas se dan por la alteración metabólica del grupo aromático por hidroxilación o mediante O-demetilación del metoxi. La correspondiente degradación de piperazina a su correspondiente etilenodiamina o anilina también puede observarse. Una segunda fase de reacciones ha sido reportada, caracterizada por glucoronidación parcial o sulfatación de los metabolitos fenólicos, metilación de los catecols y acetilación parcial a anilina (23). Estudios de identificación de las isoenzimas CYP involucradas en la mayoría de etapas metabólicas muestran que la hidroxilación de mcpp así como de la demetilación de MeOPP son catalizadas exclusivamente por CYP2D6 (24) Se han identificado tres isoformas, CYP1A2, CYP2D6 y CYP3A4, capaces de catalizar la hidroxilación de TFMPP en la cual CYP2D6 es la enzima más importante, responsable de cerca del 80% de su metabolismo (25). Metabolismo de los derivados de la pirrolidinofenona La PPP se muestra metabólicamente alterada a nivel de su anillo pirrolidina el cual se oxida a su correspondiente lactámico o se degrada 112 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

113 Implicaciones metabólicas y clínicas de algunas drogas de diseño metabólicamente mediante doble dealquilación a cationina, seguida de reducción de su grupo ceto. En contraste a sus derivados, no se observa desaminación oxidativa de sus correspondientes metabolitos 2-oxo (26). Todas las otras drogas son metabolizadas principalmente a sus sustituyentes aromáticos, mediante oxidación de sus grupos metilo a su correspondiente ácido carboxílico (MPPP, MHPH), por O-demetilación a metoxi (MOPPP) o por demetilenación de su grupo metilenodioxi (MDPPP). La hidroxilación de la cadena lateral solo se observa en el derivado con cadena lateral elongada MPHP. Una segunda fase de reacciones ha sido reportada, caracterizada por metilación de los catecols., glucoronidación parcial o sulfatación de los metabolitos hidroxi, y glucoronidación parcial de los metabolitos carboxi (27, 28). Las enzimas CYP involucradas principalmente son CYP2D6 y CYP2C19, siendo CYP2D6 la mayor enzima. Estas son las encargadas de las reacciones de hidroxilación, O-demetilación y memetilenación fundamentalmente. CYP1A2, CYP2B6, y CYP2C9 se encuentran adicionalmente involucradas en la hidroxilación de MPPP y MPHP en menor grado (29). IMPLICACIONES CLINÍCAS DEL CONSUMO DE DROGAS DE DISEÑO El mecanismo de acción de las drogas de diseño involucra a varios neurotransmisores como dopamina, serotonina, adrenalina y noradrenalina. Las propiedades entactógenas (capacidad de producir inusitada apertura emocional y empatía afectiva para con el entorno inmediato que rodea al adicto en el momento de padecimiento de los efectos típicos), de algunas de ellas obedecen a un mecanismo mixto, similar al que se propone para las anorexígenas, en el que intervendría una liberación de dopamina en numerosas áreas cerebrales, como la corteza motora, el hipotálamo y el sistema límbico, así como una inhibición de la recaptación de serotonina (30). Otras drogas, como el caso de algunas alucinógenas, presentan afinidad relativamente elevada por los receptores 5-HT2A (31), coincidiendo con el mecanismo propuesto para alucinógenos clásicos como el LSD (32). Por otro lado está el mecanismo de aminas simpaticomiméticas desarrollado por todos los derivados de estructura fenilisopropilamina, y que se caracteriza por una estimulación tanto directa (estimulación de receptores adrenérgicos) como indirecta (incremento de la liberación) del sistema nervioso vegetativo simpático (33). De acuerdo con lo anterior varios sistemas están implicados en los efectos del consumo de drogas de diseño, sin embargo los dos sistemas más implicados son el sistema nervioso central y el cardiovascular. Sobre el sistema nervioso central, a bajas dosis (10 mg vía oral) producen estimulación y conducen a estado de alerta, elación, euforia, incremento en la autoestima y activación conductual (34); cuando se incrementa la dosis entre 50 y 100 mg por vía oral, los sujetos normales desarrollan una euforia exagerada, estado disfórico caracterizado por recelo, deterioro cognitivo, sensación de grandeza, embotamiento, ilusiones, conductas compulsivas y activación o retardo de la psicomotricidad. Cuando se administran 100 mg vía oral diariamente durante 3 ó 4 días, se induce una psicosis florida por anfetaminas (35). Algunos estudios reportan que los disturbios psiquiátricos más comunes entre las personas que usan afetaminas por primera vez son la ansiedad, la manía y el pánico (36). Con relación al sistema cardiovascular, por estimulación del sistema simpático se generan grados variables de taquicardia, vasoconstricción, efectos impredecibles sobre la presión sanguínea y arritmias, dependiendo de la dosis dada y la presencia o ausencia de enfermedad cardiovascular coexistente. La hipertensión es común, pero puede presentarse hipotensión severa, debido a supresión paradójica central del simpático, un estado posterior a la depleción de catecolaminas (37, 113

114 José Henry Osorio 38) Los cambios hemodinámicos asociados a estimulación simpática incrementan la demanda de oxígeno por el miocardio. El uso crónico de anfetaminas o sus derivados puede causar episodios a repetición de espasmo coronario y paroxismos de hipertensión, lo que puede desencadenar daño endotelial, disección de arteria coronaria y aceleración del proceso aterosclerótico (39-42), una vasculitis necrotizante que puede involucrar arterias de mediano y pequeño calibre en la mayoría de los órganos y puede llevar a una isquemia generalizada en algunos consumidores (43); además, la administración prolongada de agentes simpaticomiméticos, puede estar asociada a cardiomiopatía dilatada irreversible (44) y sus efectos tóxicos pueden ser nocivos para vasos pulmonares (45). Los cambios cardiovasculares adversos y la estimulación simpática asociada a la administración de estos compuestos puede precipitar una amplia e impredecible rango de taquiarritmias ventriculares y supraventriculares potencialmente letales (46). Algunos autores (47) clasifican los efectos de las drogas de diseño como objetivos: alteraciones hormonales, estreñimiento o diarrea, cefaleas, incoordinación motora, dificultad en la eyaculación, retención urinaria, cansancio, anorexia, insomnio, locuacidad, euforia, bruxismo, temblores, trismo, hipertermia, piloerección, midriasis, hipertensión, arritmias, taquicardia. subjetivos: empatía, sensualidad, alteraciones sensoriales, disminución del miedo, felicidad, autoestima, espiritualidad, agobio, pensamientos extraños, ansiedad, desorientación, confusión, irritabilidad, obsesión, pánico, angustia, inquietud, percepción del tiempo alterada. Residuales: fatiga, dificultad para concentrarse, anorexia, apatía, insomnio, irritabilidad, depresión, falta de deseo sexual, dolores musculares. Tóxicos: hipertermia, rabdomiolisis, hepatotoxicidad, arritmias cardíacas, hipertensión arterial, pérdida de memoria, asistolias, colapso cardiovascular, coagulación intravascular diseminada, insuficiencia renal aguda, hiponatremia, psicosis anfetamínica. Por otro lado se relaciona constantemente al síndrome de serotonina con el consumo de drogas de diseño; dicho síndrome, también denominado serotoninérgico, es una condición clínica asociada al uso de medicamentos agonistas de la serotonina, que se presenta por una excesiva estimulación de los receptores centrales y perifé ricos de serotonina y produce cambios mentales, autonómicos y neuromusculares. Los síntomas ocurren en cuestión de minutos a horas y pueden ser: agitación o inquietud, diarrea, latidos cardíacos rápidos, alucinaciones, incremento de la temperatura corporal, náuseas, reflejos hiperactivos, pérdida de la coordinación, cambios rápidos en la presión arterial y vómitos. Usualmente se resuelve en las primeras 24 horas de iniciados los síntomas con tan solo la suspensión del agente causal y medidas de soporte, sin embargo puede progresar a falla multisistémica y a la muerte (48). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que entre el 5 y el 9% de los hombres y mujeres de raza caucásica carecen de una enzima perteneciente al grupo CYP-450, responsable de la N-desmetilación del MDMA (CYP2D6) (49, 50). Estos individuos serán menos sensibles a los efectos excitatorios, pero más proclives a sufrir una intoxicación por sobredosis. CONCLUSIÓN Las vías metabólicas que involucran isoenzimas P450 son responsables de la degradación hepática de las drogas de diseño. Existen riesgos potenciales para quien las consume, entre ellos se encuentran el síndrome de serotonina, hepatotoxicidad, neurotoxicidad y psicopatología. Los sistemas orgánicos más seriamente afectados son el nervioso y el cardiovascular. Existen personas con deficiencias hereditarias de CYPD6, que sin saberlo, están más expuestos a la intoxicación por drogas de diseño. 114 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

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121 Como citar este artículo: Correa C. La ayuda diagnóstica es importante: caso de Hepatozoon spp. Biosalud. 2013;12(2): LA AYUDA DIAGNÓSTICA ES IMPORTANTE: CASO DE Hepatozoon spp. Clemencia Correa Restrepo 1 RESUMEN Hepatozoon canis es un protozoario transmitido por Rhipicephalus sanguineus que afecta a caninos domésticos principalmente, pero ha sido reportado en gatos, chacales, hienas, coyotes, leopardos, zorros e inclusive en el hombre. Ha sido reconocido en el sur de Europa, África, Asia, Norte América y Sur América, donde se ha reportado su presencia en Brasil y Venezuela. Se hace el reporte de un caso clínico en un canino proveniente del departamento de La Guajira que presenta historia clínica de anorexia, depresión, vómito, diarrea, fiebre e infestación por garrapatas al que le fue diagnósticado la presencia de gametocitos de Hepatozoon spp. en extendidos de sangre periférica, además de Ehrlichia canis por la detección de anticuerpos tipo IgG. Palabras clave: Hepatozoon spp., caninos, Ehrlichia canis. THE DIAGNOSTIC AID IS IMPORTANT: A CASE OF Hepatozoon spp. ABSTRACT Hepatozoon canis is a protozoan transmitted by Rhipicephalus sanguineus that mainly affects domestic dogs, but that has been reported in cats, jackals, hyenas, coyotes, leopards, foxes and even in men. It has been recognized in southern Europe, Africa, Asia, North America and South America, where its presence has been reported in Brazil and Venezuela. The report of a case of a canine from the Department of La Guajira is done presenting a history of anorexia, depression, vomiting, diarrhea, fever, and tick infestation that was diagnosed by the presence of Hepatozoon spp. gametocytes in a peripheral blood smear plus IgG antibodies for Ehrlichia canis. Key words: Hepatozoon spp., dogs, Ehrlichia canis. 1 Bacterióloga. Esp. LCV. Unidad de Diagnóstico, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia. Correo electrónico: ccorrearestrepo@yahoo.es ISSN Recibido: noviembre 22 de Aceptado: diciembre 13 de 2013 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs

122 Clemencia Correa Restrepo INTRODUCCIÓN El Hepatozoon canis fue descrito por primera vez en la India, en 1905, como agente causal de una enfermedad poco específica, caracterizada por anemia y letargia (1, 2). Ha sido reconocido en el sur de Europa, África, Asia, Norte América y Ssur América, donde se ha reportado su presencia en Brasil (2, 3) y Venezuela (4). El principal vector es la garrapata café del perro, Rhipicephalus sanguineus, el cual es encontrado en regiones tropicales y subtropicales de todo el mundo asegurando su distribución potencial (5). El Hepatozoon americanum fue originalmente detectado en 1978 (6). Se ha encontrado al sur de los Estados Unidos y hasta 1997 se creía que era una cepa muy patógena de H. canis. El principal vector es la garrapata Amblyomma maculatum (1). Con la infección de H. canis es común encontrar coinfección con otros patógenos como Ehrrhlichia canis, Babesia canis, parvovirus, Toxoplasma gondii y Leishmania infantum. La iinmunosupresión inducida por alguno de estos agentes infectantes, o un sistema inmune deficiente en animales jóvenes, influyen en la patogénesis del H. canis (7). El Hepatozoon spp. es adquirido cuando el hospedero vertebrado (canino) ingiere el hospedero invertebrado (Rhipicephalus sanguineus) que contenga ooquistes de Hepatozoon. La transmisión de este parásito por saliva no ha sido documentada (5, 6). El H. canis afecta principalmente a caninos domésticos, pero ha sido reportado en gatos, chacales, hienas, coyotes, leopardos, zorros e inclusive en el hombre (4). SIGNOS Y SÍNTOMAS Los síntomas más destacados son.: fiebre, depresión, anorexia, pérdida de peso, vómito, emaciación, diarrea, conjuntivitis, secresiones óculonasales purulentas, dificultad para caminar. Generalmente el curso de la enfermedad es largo, con períodos de aparente mejoría alternando con episodios de fiebre y dolor muscular (4). La infección por H. canis puede ser asintomática hasta potencialmente fatal. La sintomatología varía con el grado de parasitemia., Uuna sintomatología leve está frecuentemente asociada a con bajos niveles de parasitemia (1-5% de leucocitos infectados) a diferencia de una enfermedad severa, en la cual se encuentran altos niveles de parasitemia (hasta 100%), estos son frecuentemente acompañados de leucocitosis y extremas neutrofilias. Una inmunosupresión inducida por un agente infectante o quimioterapia podría influir en la patogénesis de la infección por H. canis o la reactivación de una pre-existente, además con frecuencia ocurren infecciones concomitantes que probablemente debilitan el sistema inmune y la capacidad de resistir la infección (5). DIAGNÓSTICO El diagnóstico definitivo está dado por la observación microscópica de los gametocitos de H. canis intracelulares, en polimorfonucleares neutrófilos y monocitos circulantes en sangre periférica, utilizando extendidos de sangre coloreados con Wright o Giemsa. Estos se observan de forma capsular o elipsoidal, elongados y con extremos redondeados, de un tamaño entre 8 y 12 µm por 3-6 µm; su núcleo es central, compacto y rojizo, su citoplasma es condensado y electrodenso, se colorea de azul pálido (4, 5, 8). También se pueden observar esquizontes y quistes en muestras histopatológicas de parénquima y músculo en muestras de biopsia (9). CASO CLÍNICO El 22 de mayo de 2006, llegaron, al Laboratorio Clínico y Serología de la Facultad de Ciencias 122 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

123 La ayuda diagnóstica es importante: caso de Hepatozoon spp. Agrarias de la Universidad de Antioquia, muestras de sangre con y sin anticoagulante de un canino procedente de La Guajira, con 4 años de edad, Pastor Belga Mallinois, con historia clínica de anorexia, depresión, vómito, diarrea, fiebre e infestación por garrapatas. El procedimiento de laboratorio incluyó hemograma, hemoparásitos y química sanguínea: alanino amino transferasa (ALT) y creatinina. El hemograma fue realizado utilizando un contador de células veterinario (Diaton abacus junior vet.), los hemoparásitos fueron evaluados en extendidos delgados realizados con sangre capilar tomada de oreja, las muestras fueron coloreadas con Hemacolor (Merck). La química sanguínea se realizó en un equipo veterinario (DT VITROS de Johnson y Johnson Medical). En la primera evaluación del hemograma se observó trombocitopenia y eosinofilia, los demás valores dieron normales (Tabla 1) y en el extendido de sangre periférica se observaron estructuras intraleucocitarias, compatibles morfológicamente con gametocitos de Hepatozoon spp. (Figura 1). Se observó un índice de parasitemia (IP) de 1%, el cual es considerado bajo (5). Tabla 1. Resultados de hemogramas en diferentes periodos de tiempo. FECHA DE MUESTRA PARÁMETROS HEMÁTICOS IP GR Hb HTO MCV MCH MCHC G.B PMNN LINF PMMNE BAS MON PLA Q P.P (%) (10 6 / ul) (g/dl) (%) (fl) (pg) (g/dl) (10 3 / ul) (%) (%) (%) (%) (%) (X103/ ul) 22/05/ ,.73 15,.9 48, ,.6 33,.0 16, ,.0 30/05/ ,.77 18,.3 54, ,.5 33,.7 12, ,.2 14/06/ ,.98 17,.7 50, ,.3 34,.9 10, ,.8 27/06/ ,.99 18,.9 57, ,.7 33,.0 11, ,.4 01/08/ , , ,.9 31,.7 15, ,.8 24/08/ ,.74 18,.6 57, ,.1 13, ,.0 05/09/ ,.72 18, ,.8 32,.8 13, ,.2 13/12/ ,.16 17,.3 54, ,.2 31,.8 13, ,.8 25/01/ ,.08 16,.5 47, ,.7 35,.2 26, ,.2 P: % de parasitemia, GR: Glóbulos rojos, Hb: Hemoglobina, HTO: Hematocrito, MVC: volumen corpuscular medio, MCH: Hemoglobina corpuscular media, MCHC: concentración de hemoglobina corpuscular media, G.B: Glóbulos blancos, PMNN: Polimorfonuclear neutrófilo, LINF: Linfocitos, PMNE: Polimorfonuclear eosinófilo, BAS: Basófilos, MON: Monocitos, PLAQ: plaquetas, P.P: proteíinas plasmáticas. (g/dl) 123

124 Clemencia Correa Restrepo (a) Los leucocitos infectados con gamontes, los cuales circulan en la sangre periférica del perro son tomados por la garrapata hematófaga. (b) Los gamontes, los cuales son liberados de los leucocitos en el intestino de la garrapata, se unen en pares y se diferencian en gametos. La fertilización es seguida por la formación de un zigoto. (c) La meiosis es seguida por la formación de esporogonia. (d) Los ooquistes formados durante la esporogonia contienen numerosos esporoquistes en los cuales se desarrolla el esporozoito infectivo. (e) Una garrapata que contenga ooquistes de Hepatozoon es ingerida por un perro u otro huésped vertebrado. (f) Los esporozoitos son liberados y penetran el intestino del perro y son llevados a órganos blancos del hospedero. (g) La formación de merontes en el proceso de merogonia tiene lugar principalmente en el sistema hemolinfático para H. canis y en el músculo estriado esquelético para H. americanum. (h) Los merozoitos son liberados de los merontes maduros (i) los merozoitos podrían ser formas secundarias de merontes tisulares. (j) Los merozoitos penetran leucocitos y se transforman a gamontes en el proceso de gametogonia. (k) Los gamontes en los leucocitos alcanzan la circulación sanguínea y podrían ser tomados por una garrapata hospedera. Figura 1. Ciclo de vida general de Hepatozoon spp. en caninos. 124 Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

125 La ayuda diagnóstica es importante: caso de Hepatozoon spp. El IP fue calculado por multiplicación del porcentaje de neutrófilos parasitados por el número de neutrófilos determinado por el contador de células (2). Los análisis de química sanguínea fueron normales. Con base en la epidemiología del parásito y el dato de laboratorio de trombocitopenia se realizó la determinación de anticuerpos clase IgG para Ehrlichia canis; obteniendo un título 1:1280; el cual es considerado altamente positivo (Figura 2). Fotografía tomada del microscopio con aumento de 1000x, de un extendido de sangre periférica, coloreado con Hemacolor (Merck) donde se observan gametocitos de Hepatozoon spp. (flecha). Figura 2. Gametocitos intraleucocitarios. Con el diagnóstico de dos enfermedades concomitantes, hepatozoonosis y ehrlichiosis al paciente se le inició tratamiento combinado con doxiciclina, dipropionato de imidocarb y trimetoprim sulfa por 20 días. Al terminar el tratamiento se repitió la evaluación de hemograma y hemoparásitos. El hemograma soólo mostró trombocitopenia y el IP fue menor de 1% en dos análisis consecutivos. El canino continuó en observación y ante la aparición de un nuevo síntoma, la epistaxis, se evaluó nuevamente el hemograma y se encontró trombocitopenia, aunque con un leve aumento en el recuento de plaquetas con respecto al análisis anterior. Se halló un IP de 2%, mayor que el inicial. Se reinició el esquema de tratamiento y se realizaron controles periódicos por el laboratorio. Las plaquetas tuvieron tendencia a aumentar en los análisis posteriores y el IP aumentó hasta alcanzar el 8%. Además, se encontró marcada leucocitosis y neutrofilia, lo cual concuerda con lo citado en la literatura (Tabla 1). Los análisis bioquímicos fueron normales en la mayoría de las determinaciones (Tabla 2). 125

126 Clemencia Correa Restrepo Tabla 2. Valores obtenidos en evaluación bioquímica en diferentes periodos de tiempo. FECHA DE LA MUESTRA PRUEBAS BIOQUÍIMICAS ALT Creatinina Albúmina BUN Fósforo Glucosa AST Fosfatasa (U/l) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (U/l) (U/l) 22/05/ ,.1 3, , /05/ ,.1 NR NR NR NR NR NR 14/06/ ,.9 NR NR NR NR NR NR 27/06/ ,.0 NR NR NR NR NR NR 01/08/ ,.1 NR NR NR NR NR NR 24/08/ ,.2 NR 16 NR NR NR 36 05/09/ ,.2 NR NR NR NR NR NR 13/12/ ,.1 NR NR NR NR NR NR 25/01/ ,.1 3, , NR: no se realizó. Los hallazgos más relevantes a nivel de laboratorio son: anemia leve regenerativa, leucocitosis marcada con nutrofilia, desviación a la izquierda y en ocasiones eosinofilia y monocitosis. Otros autores reportan valores normales de leucocitos; en la química sanguínea se puede observar hipoglicemia, hipoalbuminemia, aumento de la fosfatasa alcalina y en los casos complicados se puede presentar aumento de BUN (4, 5, 10). BIBLIOGRAFÍA 1. Cordero del Ccampillo M. Parasitología Veterinaria. Madrid, España: Ed. Mc Graw- Hill - Interamericana de España;. Madrid, España ppág Levine ND. Protozoan parasites of domestic animals and of man. 2 da edición. Estados Uunidos; Macintire, DK,. et al. Hepatozoonosis in dogs: 22 cases ( ). J. Am Vet Med Assoc 1997; 210: Mateus A, Cala FA, Vargas G, Arcila VH, Castellanos V. Reporte de casos clínicos con Hepatozoon canis en el Centro Médico Quirúrgico Veterinario de la Universidad Cooperativa de Colombia. Rev electrón vet 2007; Volumen VIII( número 5). 5. Gardiner CH, Fayer R, Dubey JP. An Atlas of Protozoan Parasites in Animal Tissues. Segunda edición. Washington, Estados Unidos; Baneth G., Barta JR., Shkap V., Martin DS., Macintire DK., Vincent-Johnson, N. Genetic and antigenic evidence supports the separation of Hepatozoon canis and Hepatozoon americanum at the species level. J Clin Microbiol 2000; 38 (3): 7. Parra MO, Arraga CM. Hepatozoonosis canina en Venezuela. Hallazgos clínicos y de Laboratorio. Revista Científica FCV-LUZ 1996; Vol VI:(2): Soulsby, EJL. Parasitologíia y enfermedades parasitarias en los animales domésticos. México: Nueva Eeditorial Iinteramericana;. México Baneth, G,. et al. Canine hepatozoonosis: two disease syndromes caused by separate Hepatozoon spp. Trends Parasitol 2003; 19: Baneth G, Shkap V, Samish M, Pipano E, Savitsky I. Antibody response to Hepatozoon canis in experimentally infected dogs. Vet Parasitol 1998; 74: Biosalud, Volumen 12 No. 2, julio - diciembre, págs ISSN

127 AUTORES Gisela Gonzalez Ruiz Universidad Cooperativa de Colombia, sede Santa Marta, Colombia. Correo Electrónico: Carlos Silvera Arredondo Universidad del Norte, Barranquilla, Colombia. Correo Electrónico: Jesús Fernando Vasquez Rengifo Universidad del Norte, Barranquilla, Colombia. Correo Electrónico: Sandra Villamarín-Jiménez, Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano, Colombia. Correo Electrónico: hotmail.com María Fernanda Chacón-Castro Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano, Colombia. Correo Electrónico: hotmail.com Ricardo Álvarez-León Fundación Verdes Horizontes Manizales, C o l o m b i a. C o r r e o E l e c t r ó n i c o : ricardoalvarezleon@gmail.com José Henry Osorio Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas. Manizales, Colombia. Correo Electrónico: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co Yirly Johanna Suárez Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas. Manizales, Colombia. Correo Electrónico: jhoanasuarez@gmail.com Jorge Enrique Pérez Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas. Manizales, Colombia. Correo Electrónico: labmicro@ucaldas.edu.co Juan Carlos Ballut Universidad de Córdoba, Colombia. Correo Electrónico: juan.ballut@hotmail.com Alfonso Calderón Universidad de Córdoba, Colombia. Correo Electrónico: alcaran1@yahoo.com Virginia Rodríguez Universidad de Córdoba, Colombia. Correo Electrónico: consuelorr1@yahoo.com Jazmín Vinasco Rodríguez Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Correo Electrónico: jazvin86@hotmail.com Paola Andrea Bedoya Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Correo Electrónico: pbedoyamvz@gmail.com María Marcela Martínez Miranda, Facultad de Ingenierías, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Correo Electrónico: marcela.martinez@ucaldas.edu.co Liliana María Vargas del Río Facultad de Ingenierías, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Correo Electrónico: lilianamaria.vargas@ucaldas.edu.co Verónica María Gómez Quintero Facultad de Ingenierías, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Correo Electrónico: veronica_mariag@hotmail.com Clemencia Correa Restrepo Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Colombia. Correo Electrónico: ccorrearestrepo@yahoo.es 127

128 NORMAS EDITORIALES La revista BIOSALUD es una publicación de periodicidad anual editada en la Universidad de Caldas cuya vocación es la publicación de artículos originales, de revisión, de reflexión y de reportes de caso asociados con diferentes temas de la salud humana; esta publicación ha sido concebida también como una tribuna de opinión sobre diferentes temas relacionados con las políticas y la problemática de la salud y de la investigación en salud en Colombia. La revista ha sido catalogada en la categoría B por el Sistema Nacional de Indexación y homologación de revistas especializadas de CT+I (Publindex), desde el año 2008, con una vigencia de dos años. DEFINICIÓN DE CADA UNO DE LOS TIPOS DE ARTÍCULOS QUE SE PUBLICAN EN LA REVISTA 1. Artículo de investigación científica y tecnológica: es un documento que presenta de manera detallada los resultados obtenidos a partir de un proyecto de investigación. Este artículo debe contener: el título, el resumen en español e inglés, una introducción, los materiales y métodos, los resultados obtenidos y la discusión. 2. Artículo de reflexión: es un documento que presenta un análisis personal y crítico de los resultados de una investigación sobre la base de fuentes originales 3. Artículo de revisión: documento en el cual se hace un análisis y presentación del estado del arte relacionado con un tópico de investigación específico; en este documento se deben resaltar los aportes de los autores en la ampliación de la frontera del conocimiento sobre el tema específico; este documento debe contener al menos 50 referencias provenientes de artículos originales. 4. Artículo corto: es un documento en el que se hace un avance de los resultados obtenidos en el desarrollo de una investigación y que por el impacto de dichos resultados es importante hacer una publicación de los mismos antes de finalizado el proceso investigativo. 5. Reporte de caso: es aquel escrito en el que se presentan los resultados de una situación particular en la cual se dan a conocer hallazgos nuevos, metodologías nuevas o terapias nuevas, asociado con una revisión corta y crítica del estado del arte a nivel mundial de casos similares presentados. 6. Revisión de tema: es el documento en el cual se hace una actualización sobre un tema específico, acompañado además de un análisis de los datos obtenidos para la realización de dicha revisión. 7. Editorial: documento escrito por el editor o cualquier miembro del comité editorial o por una persona invitada por el editor. El editorial puede estar relacionado con problemas actuales en el campo de la salud, en la educación en salud o también un análisis de nuevos hallazgos en el campo de la investigación biomédica. 8. Carta al editor: es un documento enviado al editor por los lectores de la revista en el cual se hacen críticas, se refutan resultados o se hacen reseñas relacionados con artículos publicados en números anteriores de la revista y que a juicio del comité editorial es importante su conocimiento por la comunidad científica. 128

129 9. Reseñas bibliográficas: sección de la revista en la que se hacen comentarios sobre publicaciones recientes realizadas por la comunidad científica de la Facultad de Ciencias para la Salud en particular y por publicaciones realizadas a nivel nacional o mundial. Para la presentación de los diferentes artículos se debe tener en cuenta los requisitos de uniformidad para manuscritos presentados a revistas biomédicas (normas Vancouver), extraídas de: International Commitee of Medical Journal Editors. Uniform Requirement for Manuscript Submitted to Biomedical Journal: Writing and editing for Biomedical Publications, updated February, 2006, IN: ASPECTOS A TENER EN CUENTA ANTES DE LA REMISIÓN DE MANUSCRITOS: Originalidad Cualquier artículo enviado a la revista para su publicación debe ser inédito y los autores de dicho artículo deben remitir al director de la revista un documento escrito en el cual dan su consentimiento para la publicación del mismo en caso de que éste haya sido evaluado satisfactoriamente; en dicho consentimiento los autores también darán fe de que dicho artículo no ha sido publicado total o parcialmente en otra publicación escrita o electrónica, esto con el fin de no infringir las leyes relacionadas con derechos de autor. Sin embargo, es posible hacer una segunda publicación en el mismo idioma de la primera publicación o en un segundo idioma cuando: hay consentimiento de los directores de ambas revistas; la prioridad de la primera publicación se respete por al menos una semana; el grupo de lectores sea diferente; la segunda publicación refleje fielmente la información e interpretaciones de la primera. En la segunda versión a pie de página, se informará a los lectores que dicho artículo ya ha sido publicado parcial o totalmente en otra publicación, citándose dicha publicación; el permiso para la segunda publicación debe ser gratuito. Protección de identidad de sujetos sometidos a estudio Cuando en una investigación se hayan hecho estudios en humanos, se debe evitar al máximo la descripción de detalles que sirvan para identificar una persona o personas sujetos de estudio; está prohibido hacer la publicación de nombres de pacientes, iniciales, números de historias clínicas, fotografías, genealogías o datos personales que puedan lesionar su derecho a la intimidad; si dichos datos es necesario publicarlos, se requiere el consentimiento escrito de dichas personas; en dicho consentimiento debe constar que se conoce y entiende el manuscrito a publicar y están de acuerdo con la publicaciones de las descripciones o imágenes que se hagan allí relacionadas con las personas en cuestión, incluso si el material sujeto de posible identificación va a estar disponible por Internet luego de su publicación. Este consentimiento informado debe ser remitido junto con el manuscrito para su revisión. 129

130 Asimismo cuando en los experimentos se utilizan animales y humanos se debe indicar si los procedimientos seguidos están en concordancia con las normas de los comités de ética médica y animal de la institución patrocinadora de la investigación y con la declaración de Helsinki de 1975, actualizada en el año 2000; para el caso de los animales de experimentación se debe indicar si se siguieron los lineamientos relacionados con el uso y cuidado de los animales de laboratorio. REQUISITOS PARA LA PREPARACIÓN Y REMISIÓN DE MANUSCRITOS Principios generales El texto de los artículos producto de la observación y la experimentación usualmente está dividido en secciones como: introducción, materiales y métodos, resultados y discusión; los artículos extensos necesitan ser divididos en subsecciones especialmente en los resultados y la discusión con el fin de hacer más comprensible su contenido. Otros artículos como por ejemplo: reportes de caso, revisiones, artículos de reflexión y editoriales, probablemente requieren de otros formatos. El uso del doble espacio en todas las porciones del manuscrito y de márgenes adecuadas, hacen posible que editor y revisores editen el texto línea a línea, agregando comentarios o dudas directamente en el manuscrito. Si los manuscritos son remitidos por vía electrónica, dicho artículo también debe ser escrito a doble espacio ya que también debe ser impreso para su revisión y edición. La numeración de las páginas también es otro aspecto importante para que los evaluadores y el editor puedan referenciar porciones específicas de los manuscritos. Cada sección del manuscrito debe ir en páginas separadas de la siguiente manera: Página del título Debe incluir la siguiente información: Título del artículo: debe ser conciso y fácil de entender. Nombres de los autores y afiliación institucional. Nombre de la sección de la institución a la cual los autores están inscritos, con el correspondiente nombre de dicha institución. Correspondencia para los autores: debe contener: dirección, número telefónico, fax y dirección de correo electrónico del autor responsable del manuscrito; también el autor debe colocar si desea que su dirección electrónica sea publicada. Nombre y dirección de los autores a quienes se les puede solicitar reimpresiones. Fuente o fuentes de los recursos que sirvieron para financiar la investigación. Resumen y palabras clave Debe estar en la página siguiente a la página del título. Debe incluirse el resumen en español e inglés. Debe contener un resumen corto de la introducción, los materiales y métodos, los resultados y la discusión, enunciando cada uno de estos apartados antes del contenido de los mismos. Se deben enfatizar aspectos nuevos e importantes 130

131 del estudio u observaciones, los procedimientos básicos, hallazgos principales, en lo posible con sus significancias estadísticas y las principales conclusiones. La extensión no debe ser mayor de 300 palabras. No debe incluir información o aspectos que no son contemplados en el texto, abreviaturas, referencias al texto o citas bibliográficas. Debe redactarse en tercera persona. Ya que los resúmenes son las partes citadas en muchas bases de datos, se requiere especial cuidado en la redacción de los mismos de modo que el resumen refleje fielmente el contenido de los artículos. Pueden incluirse entre 3 a 10 palabras clave en español e inglés; estás pueden ser también frases cortas que capturen los tópicos principales del artículo. Las palabras clave son importantes para la indexación del artículo en las bases de datos. Deben usarse las palabras clave listadas en el Medical Subject Headings (MeSH) del Index medicus: para las palabras en inglés. Para las palabras clave en español utilizar la página electrónica de la biblioteca virtual en salud; descriptores en ciencias de la salud: decsserver.xis&interface_language=e&previous_page=homepage&previous_ task=null&task=start Si no hay palabras disponibles para términos recientemente introducidos, ellos pueden ser usados. Introducción La introducción contiene un contexto del estudio en el cual se justifica el problema a estudiar, cual es el propósito u objetivos de la investigación; el estado del arte sobre el asunto a investigar apropiadamente referenciado, pero no se deben incluir datos o conclusiones de la investigación a publicar. Materiales y métodos Se deben describir aquí las alternativas metodológicas utilizadas para llegar a los resultados obtenidos, no se deben incluir datos producto de la aplicación de dichos métodos; se deben describir claramente los mecanismos de selección de las personas sujetas a observación o de los animales de experimentación, incluyendo los criterios de inclusión. Algunas de las variables utilizadas deben explicarse, por ejemplo la razón por la cual se prefieren individuos de ciertas edades o sexo; en el caso de que se usen variables como etnicidad o raza, se deben enumerar los criterios de clasificación y justificar su relevancia. Se deben identificar los métodos de medición, los equipos utilizados dando el nombre del fabricante y dirección entre paréntesis. Los procedimientos deben ser enunciados de manera que permitan la reproducción de los mismos por otros investigadores; estos métodos deben ser adecuadamente referenciados y en caso de que ellos hayan sufrido 131

132 modificaciones explicar la razón por la cual se han hecho estas modificaciones y además evaluar sus limitaciones. Se deben identificar drogas o sustancias químicas usadas; en el caso de las drogas se debe incluir su nombre genérico, dosis y ruta de administración. Los autores que someten manuscritos de revisión deben incluir una sección describiendo los métodos usados para localizar, seleccionar, extraer y sintetizar datos. Estos métodos deben también ser presentados de manera concisa en el resumen. Los métodos estadísticos utilizados en el análisis de la información deben ser descritos con suficiente detalle, cuando sea posible cuantificar los hallazgos y presentar ellos con indicadores apropiados de mediciones de error o incertidumbre (intervalos de confianza); se deben definir los términos estadísticos, las abreviaciones y muchos de los símbolos utilizados; se debe especificar el programa estadístico de computación utilizado. Resultados Se deben presentar en una secuencia lógica, enunciando los hallazgos principales y más importantes primero. No se deben repetir en el texto todos los datos de las tablas o ilustraciones. Material suplementario o adicional y los detalles técnicos deben ser colocados en un apéndice que no interrumpa el flujo del texto; estos apéndices solo se publicarán en la versión electrónica de la revista. Los resultados numéricos no solo se deben expresar en porcentaje sino también en números absolutos y se deben explicar los métodos estadísticos usados para analizar los mismos. Se deben restringir las tablas y figuras a aquellas necesarias para la argumentación y valoración de la discusión. No se deben duplicar datos en tablas y gráficas. Discusión Enfatizar los aspectos nuevos e importantes del estudio y las conclusiones que surgen de ellos. No repetir datos dados en la introducción o en los resultados. En los estudios experimentales es útil comenzar la discusión resumiendo brevemente los principales hallazgos, posteriormente explicando el porqué de estos resultados; se debe hacer una comparación y contrastación de los resultados con otras investigaciones relevantes; enumerar las limitaciones de la investigación y explorar las implicaciones de los hallazgos para futuras investigaciones y para la práctica clínica si es posible. Relacionar las conclusiones con los hallazgos del estudio pero evitar afirmaciones y conclusiones que no se puedan confirmar con los datos suministrados; en particular no se deben hacer afirmaciones sobre los beneficios económicos a menos que los manuscritos incluyan datos económicos apropiados y análisis; enunciar hipótesis nuevas si ellas están adecuadamente sustentadas, pero es necesario indicar claramente que estas son hipótesis. Bibliografía En los artículos de revisión, se deben utilizar principalmente artículos originales como referencias; evitar el uso de resúmenes como referencias; en caso de que una referencia 132

133 no haya sido publicada aún se debe indicar que está en prensa ; los autores deben obtener un permiso escrito para citar tales artículos así como también verificar que ellos han sido aceptados para su publicación, en caso de que una referencia no haya sido publicada se debe citar en el texto como observaciones no publicadas con el consentimiento escrito de la fuente. Evitar las citaciones de comunicaciones personales a menos que ellas sean una fuente de información esencial no disponible a partir de una publicación, en este caso el nombre de la persona y la fecha de comunicación deben ser citadas en paréntesis en el texto. Para un artículo científico, los autores deben obtener permiso escrito y confirmación de la veracidad de la fuente de una comunicación personal. Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en el cual ellas son mencionadas en el texto. Se deben identificar las referencias en el texto, tablas y leyendas con números arábigos entre paréntesis. Las leyendas citadas en tablas o figuras deben ser numeradas de acuerdo a la secuencia establecida en el texto. Los títulos de las revistas deben ser abreviados de acuerdo al estilo usado en Index medicus, para lo cual se debe consultar la lista de revistas indexadas por MEDLINE o SCIELO: La citación de los autores de una publicación referenciada se debe hacer de la siguiente forma: apellidos en minúsculas, iniciales de los nombres; cada autor debe ir separado por una coma; se deben citar todos los autores de dicha referencia. Con el fin de tener una presentación uniforme de las referencias, se seguirán las normas del comité internacional de editores de publicaciones periódicas médicas, las cuales pueden ser consultadas en: Artículos de Revistas: Proporcionar primer apellido e iniciales de los nombres de cada uno de los autores, título, revista, año de publicación, volumen, número entre paréntesis (si es necesario) y páginas. Incluya sólo seis autores y si hay más de seis colocar después del sexto autor la abreviatura et al.. Soberón GA, Naro J. Equidad y atención de salud en América Latina. Principios y dilemas. Bol Of Sanit Panam 1985; 99(1):1-9. March F, Coll P, Guerrero RA, Busquets E, Cayla JA, Prats G, et al. Predictors of tuberculosis transmission in prisions: an analysis using conventional and molecular methods. AIDS 2000; 14: Si el autor es una institución colocar el nombre de esta en vez de los nombres individuales. Cuando no hay autor: Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994; 84:

134 Libros: Proporcionar primer apellido e iniciales de los nombres de cada uno de los autores o editores, título del libro, número de edición, lugar, editorial, fecha y, si es necesario las páginas después de la abreviatura p. Monson RR. Occupational epidemiology. 2nd Edition. Boca Ratón, Fl: CRC Press; White Kl., Henderson MH, eds. La epidemiología como una ciencia fundamental. New York: Oxford University Press; p Capítulo de libro: Allison RF, Dowling Wl, Munson FC. The role of the health services administrator and implications for education. In: Commission on Education for Health Administration, eds. Education for health administration. Vol. 2. Ann Arbor, MI: Health Administration Press; Antó JM. Los métodos cuantitativos y cualitativos en la salud pública. En: Martínez FN, Antó JM, Castellanos PL, Gili M, Marset P, Navarro V. Salud Pública. Madrid: McGraw- Hill, Interamericana; Sitios en Internet: American Center Society [Internet]. Disponible en: nih. gov/dictionary.html. Consultado Febrero de Las comunicaciones personales deben ser indicadas en el cuerpo del texto, entre paréntesis, no en notas de pie de página, indicando fecha e institución de quien da la comunicación. No deben incluirse como referencias: documentos no publicados, incluso si han sido presentados en conferencias o congresos; artículos enviados para publicación que no han sido aceptados y resúmenes. Si es absolutamente necesario citar fuentes no publicadas, estas deben ser mencionadas en el texto entre paréntesis o en una nota de pie de página. La manera apropiada de citar como referencia otro tipo de material no considerado arriba, debe ser consultada en los sitios de Internet ya indicados. Las tablas Las tablas deben ser concisas con el nivel adecuado de detalle y precisión, para ello es deseable incluir datos más que texto. Cada tabla debe ir en una hoja separada, debe estar adecuadamente identificada y en el orden de su primera citación en el texto; cada tabla debe tener un título corto; no utilizar líneas horizontales o verticales; cada columna debe tener un encabezado corto o abreviación; cuando sea necesario se deben colocar notas aclaratorias al pie de la tabla; se deben explicar todas aquellas 134

135 abreviaturas no comunes; se pueden utilizar los siguientes símbolos secuencialmente para dichas explicaciones: *,,,,,,**,,. Identificar medidas estadísticas de variación como desviación estándar y el error estándar de la media. Asegurarse de que todas las tablas se han citado en el texto. Ilustraciones o figuras Las figuras todas ellas de muy buena calidad deben ser fotografiadas y escaneadas o remitidas como fotografías digitales, también es necesario enviarlas en formato JPEG o GIF, de modo que puedan ser publicadas en la versión electrónica de la revista. Las placas de rayos X, las escanografías, ecografías u otras imágenes diagnósticas, así como también microfotografías deben ser enviadas en blanco y negro, y también en formato digital. Cada figura debe ir en una página aparte y debe tener un título con una numeración consecutiva de acuerdo con el orden en el que se citó en el texto; debe tener además una leyenda que haga énfasis en los que se quiere mostrar. Si en las figuras o fotografías hay símbolos, flechas, números o letras para identificar partes de la misma, estos símbolos deben referenciarse y explicarse claramente en la leyenda de la figura. Si se incluyen fotografías de personas estas no deben permitir la identificación de la misma o en caso contrario deben ir acompañadas del consentimiento escrito de la persona que aparece en dicho documento. Unidades de medida Se prefiere las unidades métricas (metros, kilogramos o litros) o sus múltiples decimales; la temperatura debe estar en grados Celsius, la presión sanguínea en milímetros de mercurio; en los resultados de parámetros sanguíneos no utilizar unidades SI exclusivamente sino las unidades alternativas de medida (ejemplo: mg/ dl., mm/h. mm 3, etc). Símbolos y abreviaciones Usar solamente las abreviaciones más comunes; evitar abreviaciones en el título; el término completo de una abreviación debe preceder dicha abreviación la primera vez que se utiliza en el texto con la abreviación entre paréntesis. Envío del manuscrito El manuscrito puede ser enviado en formato físico y electrónico al director de la revista, al Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas A.A. 275, Manizales-Caldas-Colombia; se debe incluir el nombre de la persona responsable del contenido del artículo, con la dirección para la recepción de correspondencia y para el envío de los manuscritos que requieren correcciones. El manuscrito también puede ser enviado al labmicro@ucaldas. edu.co, revistascientificas@ucaldas.edu.co 135

136 Proceso de evaluación El comité editorial en cabeza de su director, realiza una selección de los artículos que se considera pueden hacer parte de la revista. Posteriormente, se somete el artículo a un grupo de evaluadores (mínimo 2) idóneos en el tema para su respectivo análisis. Dichos pares determinan la pertinencia de la publicación del material. Reserva de derechos Si el manuscrito es aceptado para publicación los derechos de reproducción serán de la Universidad de Caldas. El manuscrito debe ir acompañado de la carta o comunicación original en la cual se otorga permiso para reproducir texto, figuras o cualquier otro material que tenga reserva de derechos. Los autores son responsables de los contenidos, juicios y opiniones de cada uno de los artículos. 136

137 AUTHOR GUIDELINES The BIOSALUD Journal is an annual publication of Universidad de Caldas, whose objective is the publication of original, revision, and reflection articles, as well as case reports associated with different subjects related to human health. This publication has also been conceived as a tribune of opinion on different subjects related to the policies and the health problems and the health researched carried out in Colombia. The journal has been catalogued in the B category by the National System of Indexing and homologation of specialized journals of CT+I (Publindex), since 2008, for a two year period. DEFINITION OF EACH TYPE OF ARTICLE PUBLISHED IN THE JOURNAL 1. Scientific and technological research article: it is a document that presents in detail the results obtained from a research project. This article must contain: title, summary in English and Spanish, introduction, materials and methods, results and discussion. 2. Reflection article: it is a document that presents a personal and critical analysis of the research results, based on original sources. 3. Revision article: a document in which the state of the art of a specific research topic is analyzed and presented. This document must highlight the contributions of the authors in the extension of the knowledge on the specific topic. It must contain at least 50 references from original articles. 4. Short article: it is a document in which an advance of the results obtained in the development of a research project are presented, must be to their impacts, making their publication essential before the investigative process is finalized. 5. Case report: it is a writing in which the results of a particular situation appear, since they are considered to be new findings, methodologies, or therapies, associated with a short and critical revision of the state of the art at a worldwide level of similar cases that have been presented. 6. Subject revision: it is the document in which a specific subject is updated, accompanied by an analysis of the data collected for said revision. 7. Editorial: a document written by the editor or any member of the Editorial Committee or by guest invited by the publisher. The editorial can be related to present problems in the health field, health education, as well as an analysis of new findings in the biomedical research. 8. Letter to the editor: it is a document sent to the editor by the readers of the journal in which critics are made, results are refuted or reviews related to articles published in previous numbers of the journal, that according to the Editorial Committee, their knowledge by the scientific community is considered important. 9. Bibliographical reviews: a section of the journal in which commentaries on recent publications are made by the scientific community of the Faculty of Health Sciences in particular, and by publications made at national or worldwide level. For the submission of different articles, the following requirements for the uniformity of the manuscripts presented to biomedical journals (Vancouver norms) should be followed. These have been extracted from: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform Requirement for Manuscript Submitted to Biomedical Journal: Writing 137

138 and editing for Biomedical Publications, updated February, 2006, IN: icmje.org/ ASPECTS TO CONSIDER BEFORE THE SUBMISSION OF MANUSCRIPTS: Originality Any article sent to the journal for its publication must be unpublished and the authors must send to the director of the journal a written document in which they give their consent for its publication, in case that it was satisfactorily evaluated; in this consent the authors will also give faith that said article has not been published totally or partially in another written or electronic publication, in order to avoid infringing copyright laws. Nevertheless, it is possible to make a second publication in the same language of the first publication or in a second language when: there is consent on part of the directors of both journals; the priority of the first publication is respected by a week; the group of readers is different; the second publication faithfully reflects the information and interpretations of the first. In the second version, as a footnote, the readers will be informed that this article has already been published partially or totally in another journal, mentioning said journal; the permission for the second publication must be gratuitous. Protection of the identity of the subjects of study When a research study involves humans, the description of details should be avoided as much as possible, that might lead to the identification of a person or persons subjects of study. The use of patients names, initials, clinical history numbers, photographs, genealogies or personal data that might injure their right to privacy are prohibited; if it is necessary to publish said data, the written consent of these people is required. Said consent must guarantee that the manuscript is known and understood, and that they agree with the publications of the descriptions or images made with the related people, even if the material subject to possible identification is going to be available on the Internet after its publication. This informed consent must be sent along with the manuscript for its revision. In addition, when the experiments require the use of animals and humans, it should be indicated if the procedures are in agreement with the norms of the medical ethics and animal committees of the sponsoring institution and with the Declaration of Helsinki of 1975, updated in For the specific case of animal experimentation, it should be indicated if the norms related to the use and care of the laboratory animals were followed. 138

139 REQUIREMENTS FOR THE PREPARATION AND SUBMISSION OF MANUSCRIPTS General principles The text of articles product of the observation and experimentation are usually divided in sections such as: introduction, materials and methods, results and discussion. The extensive articles specially need to be divided in subsections in the results and the discussion with the purpose of being more comprehensible. Other articles such as: case reports, revisions, reflection articles and editorials, probably require other formats. The use of double space throughout the manuscript, as well as suitable margins, allow the editor and reviewers to edit the text directly line by line, adding commentaries or doubts in the manuscript. If the manuscripts are sent via , this article also must be doubled space, since it must also be printed for its revision and edition. The page numbers is another important aspect, so that the reviewers and the editor can reference specific portions of the manuscripts. Each section of the manuscript must be separated in the following way: Title page It must include the following information: Title of the article: it must be concise and easy to understand. Names of the authors and institutional affiliation. Name of the section of the institution to which the authors are enrolled, with the corresponding institutional name. Correspondence for authors: it must contain: address, telephone number, fax and electronic mail address of the author responsible for the manuscript. In addition, the author must state if he/she wishes their electronic address to be published. Name and address of the authors to whom reimpressions can be solicited. Source or sources of the resources that served to finance the investigation. Abstract and key words It must be on the following page after the title page. The abstract must be in English and in Spanish. It must contain a short summary of the introduction, materials and methods, results and discussion, enunciating each of these sections before their contents. New and important aspects of the study or observations must be emphasized, as well as the basic procedures, main findings, wherever possible with their statistical significances and the main conclusions. The extension should not exceed 300 words. It should not include information or aspects that are not contemplated in the text, bibliographical abbreviations, references to the text or citations. It must be written in third person. 139

140 Since the abstracts are the parts mentioned in many databases, special care is required in their writing, so that it faithfully reflects the content of the articles. 3 to 10 key words in English and Spanish should be included. They can also be short phrases that capture the main topics of the article. Key words are important for the indexation of the article in databases. The key words used should be listed in the Medical Subject Headings (MeSH) of the Medicus Index: mesh/mbrowser.html, for the key words in English. For the key words in Spanish, use the electronic page of the virtual health library; descriptores en ciencias de la salud: decsserver.xis&interface_language=e&previous_page=homepage&previous_ task=null&task=start If there are no words available for recently introduced terms, they can be used. Introduction The introduction contains a context of the study in which the problem is justified, what is the intention or objectives of the research; the state of the art on the subject being studied should be appropriately referenced, but data or conclusions of the research being published should not must be be included. Materials and methods The methodological alternatives used are should be described here to reach the obtained results. Data product of the application of these methods should not be included. The mechanisms of selection of the subjects of study observed or of the animals experimented on should be clearly described, including the inclusion criteria. Some of the variables used must be explained, for example, the reason why individuals of certain ages or sex were preferred; in case variables such as ethnicity or race are used, their classification criteria must be enumerated, and their relevance should be justified. The measurement methods, the equipment implemented should be identified, including the name of the manufacturer and its address in parentheses. The procedures must be enunciated so that they can be reproduced by other researchers. These methods must be adequately referenced, and in case they have undergone modifications, the reason why these modifications were made must be explained, in addition to evaluating their limitations. The drugs or chemical substances should be identified; in the case of drugs, their generic name, dosage and administration route must be included. The authors who submit their manuscripts must include a section describing the methods implemented to locate, select, extract and synthesize data. These methods must also be presented in a concise way in the abstract. The statistical methods used in the analysis of the information must be described with sufficient detail, whenever possible the findings must be quantified and presented with the appropriate indicators of measurements of error or uncertainty (confidence 140

141 intervals); the statistical terms, abbreviations and many of the symbols used should be defined. The statistical computerized program implemented should be specified. Results They must be presented in a logical sequence, enunciating the main and most important findings first. All the data in the charts or illustrations should not be repeated in the text. Additional material and the technical details must be placed in an appendix that does not interrupt the flow of the text; these appendices will only be published in the electronic version of the journal. The numerical results not only are must be to express in percentage but also in absolute numbers and the statistical methods used are must be to explain to analyze such. The charts and figures to those necessary for the argumentation and valuation of the discussion are must be to restrict. To charts data in and graph are not must be to duplicate. Discussion Emphasizing the new and important aspects of the study, as well as the conclusions derived from them. Information should not be repeated in the introduction or the results. In the experimental studies, it is useful to begin the discussion briefly summarizing the main findings, and later explaining the reason for these results. A comparison and contrast of the results with those of other relevant researches must be carried out. The limitation of the research must be enumerated, as well as exploring the implications of the findings for future researches, and for the clinical practice whenever possible. It is important to relate the conclusions with the findings of the study, but avoiding affirmations and conclusions that cannot be confirmed with the enclosed data; particularly, affirmations regarding economical benefits should not be expressed, unless the manuscript includes appropriate economical information and analysis. New hypotheses should be enunciated if they are adequately backed up, but it is necessary to clearly indicate that they constitute hypotheses. Bibliography Revision articles must implement original articles as references, avoiding the use of abstracts as references. In case that a reference hasn t been published yet, it must be indicated that it is in process ; the authors must obtain a written permit to reference such articles, as well as verifying that the articles have been accepted for its publication. And in case a reference has not been published, it should be identified as unpublished observations with the written consent of the source. Avoid the references of personal communication, unless they are a source of essential information unavailable from a publication, in this case, the name of the person and the date of the mail should be referenced in parentheses in the text. For a scientific article, the authors must obtain written permission and confirmation of the source of said communication. 141

142 The references must be consecutively numbered in the order in which they are mentioned in the text. The references, charts and legends in the text must be identified with Arabic numbers in parentheses. The legends mentioned in charts or figures must be numbered according to the sequence established in the text. The titles of journals must be abbreviated according to the style used in the Medicus Index, consulting the list of the journals indexed by MEDLINE or SCIELO: The citation of the authors of a referenced publication must be done in the following manner: last names in lower case letters, initials of the first names. Each name must be separated by a comma; all the authors of said reference must be mentioned. With the purpose of having a uniform presentation of the references, the norms of the international committee of medical periodic publication publishers will be followed, which can be consulted in: Journal Articles: Provide last name and initials of the first names of each of the authors, title, journal, year of publication, volume, number in parentheses (if necessary) and pages. Include only six authors and if there are more than six, after the last one place the abbreviation et al.. Soberón GA, Naro J. Fairness and health attention in Latin America. Principles and dilemmas. Bol of Sanit Panam 1985; 99 (1): 1-9. March F, Coll P, Guerrero RA, Busquets and, Cayla JA, Prats G, et al. Predictors of tuberculosis transmission in prisons: an analysis using conventional and molecular methods. AIDS 2000; 14: If the author is an institution, place its name instead of the individual names. When there is no author: Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994; 84:15. Books: Provide last name and initials of the names of each of the authors or publishers, book title, edition number, place, editorial, date and, if necessary, the pages after the abbreviation p. Monson RR. Occupational epidemiology. 2 nd Edition. Boca Ratón, Fl: CRC Press; White Kl., Henderson MH, eds. Epidemiology as a fundamental science. New York: Oxford University Press; p

143 Book chapter: Allison RF, Dowling Wl, Munson FC. The role of the health services administrator and implications for education. In: Commission on Education for Health Administration, eds. Education for health administration. Vol. 2. Ann Arbor, MI: Health Administration Press; Antó JM. The quantitative and qualitative methods in public health. In: Martinez FN, Antó JM, Castellanos PL, Gili M, Marset P, Navarrese V. Public health. Madrid: McGraw- Hill, Inter-American; Internet Sites: American Center Society [Internet]. Available at: nih.gov/ dictionary.html. Consulted February Personal communications must be indicated in the body of the text, in parentheses, not as footnotes, indicating date and institution of whom communicates. The following do not have to be included as references: unpublished documents, even if they have been presented in conferences or congresses; articles sent for publication that have not yet been accepted and abstracts. If it is absolutely necessary to mention unpublished sources, these must be mentioned in the text in parentheses or in a footnote. The appropriate way to mention other types of material not considered above, must be consulted on the internet sites already indicated. Charts The charts must be concise with the suitable level of detail and precision, for said purpose, it is desirable to include data instead of text. Each table must go on a separated page, adequately identified and in the order of its first reference in the text. Each table must have a short title; horizontal nor vertical lines should be used; each column must have a short heading or an abbreviation. When necessary, explanatory notes must be placed at the end of the table; all the uncommon abbreviations must be explained; sequentially use the following symbols for these explanations: *,,,,,, **,,. Identify statistical measures of variation as standard deviation and the mean standard error. Make sure that all the charts have been mentioned in the text. Illustrations or figures All the figures must be of an excellent quality, and they must be photographed and scanned or sent as digital photographs, it is also necessary to send them in JPEG or GIF format, so that they can be published in the electronic version of the journal. The x-rays plates, the scanographs, ultra sounds, or other diagnostic images, as well as microphotographs must be sent in black and white, and in digital format. 143

144 Each figure must be placed on a separate page and must have a title with a consecutive numeration in agreement with the order in which it was mentioned in the text; they must also have a legend that emphasizes what they are showing. If in the figures or photographs there are symbols, arrows, numbers or letters to identify their parts, these symbols must be referenced and explained clearly in the legend of the figure. If photographs of people are included, these cannot allow the identification of the people, or in the other case, they must be accompanied by the written consent of the person who appears in said document. Units of measurement Metric units are preferred (meters, kilograms or liters) or their multiple decimals; the temperature must be in degrees Celsius, the blood pressure in millimeters of mercury; in the results of sanguineous parameters SI units should not be used exclusively, but instead, the alternative units of measurement (example: mg/dl., mm/h. mm 3, etc). Symbols and abbreviations The most common abbreviations should only be use. Avoid abbreviations in the title; the complete term of an abbreviation must precede it the first time that it is used in the text with the abbreviation in parentheses. Shipment of the manuscript The manuscript can be sent in physical and electronic format to the director of the journal, at Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas A.A. 275, Manizales-Caldas-Colombia. The name of the person responsible for the content of the article must be included, with the address for the reception of correspondence and the shipment of manuscripts that require corrections. The manuscript can also be sent to the following e mails: labmicro@ucaldas.edu.co, revistascientificas@ucaldas.edu.co Process of evaluation The Editorial Committee led by its director, selects the articles that are considered to be included in the journal. Afterwards, the article is evaluated by at least 2 professionals with experience in the subject for its respective analysis. These pairs determine the pertinence regarding the publication of the manuscript. Reserved rights If the manuscript is accepted for publication the reproduction rights will belong to Universidad de Caldas. The manuscript must be accompanied of the letter or original communication in which permission is granted to reproduce text, figures or any other material that has reserved rights. The authors are responsible for the contents, judgments and opinions of their articles. 144

145 FORMATO DE SUSCRIPCIÓN Nombre / Name Cédula / Identification number Dirección / Address Ciudad / City Departamento / State Código Postal / Zip Code País / Country Teléfono / Phone Number Profesión / Profession Institución / Employer Correo Electrónico / Dirección de envío / Mailing Address Suscriptores Nacionales por un año. (1) Ejemplar Se debe consignar en Bancafé, cuenta de ahorros No código 00HD005 Promoción e indexación de publicaciones científicas. Mayores informes: Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados Universidad de Caldas. Calle 65 N A.A. 275 Manizales - Colombia Tel: ext Fax: ext revistascientificas@ucaldas.edu.co Último ejemplar recibido / Last issue mailed: Año/Year Volumen/Volume Número/Number Fecha / Date

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