Invasión a epitelios Sporotrhix schenckii

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1 Invasión a epitelios Sporotrhix schenckii GERARDO SANDOVAL BERNAL 1, GLORIA BARBOSA SABANERO 2, ARMANDO PEREZ 3, VÍCTOR TSUTSUMI FUJIYOSHI 4, MYRNA SABANERO LÓPEZ* 1 Palabras clave: adhesión, S. schenkii, epitelios 1 Instituto de Investigación en Biología Experimental, Universidad de Guanajuato, Guanajuato, México. 2 Instituto de Investigaciones Médicas, Universidad de Guanajuato, Guanajuato, México. 3 Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, México D.F 4 Departamento de Patología Experimental, CINVESTAV México D.F INTRODUCCIÓN: La esporotricosis es una micosis adquirida por la inoculación traumática o inhalación de conidias del hongo dimorfico Sporothrix. schenckii. Esta micosis presenta varias formas clínicas la más frecuente es la cutánea, mientras que la sistémica, se presenta en individuos inmunocomprometidos (Kauffman, 1999). La adhesión del patógeno es un prerrequisito para la colonización y diseminación a los tejidos hospederos. Al respecto, el proceso de adhesión ha sido extensamente estudiado en hongos patógenos como Candida albicans, Aspergillus fumigatus,, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum (Mendes-Giannini y col, 2000), sin embargo poco se conoce de los mecanismos de adhesión de S. schenckii a los tejidos. En este trabajo examinamos la interacción de S. schenckiicon células epiteliales desde un enfoque estructural. Los resultados muestran que el patógeno: (1) se adhiere a la superficie de la célula epitelial, (2)altera la integridad de la monocapa epitelial, (3) durante la interacción el hongo presenta diferenciación de levadura a micelio y (4) la ultraestructura muestra el daña y (5) sorprendementente ocurre endocitosis del patógeno. Los resultados reflejan la complejidad de la relación huésped parasito y su conocimiento puede ser utilizado para el diseño de nuevas terapias antifúngicas. MATERIALES Y MÉTODOS Cepas Sporothrix schenckii MP102 fue utilizado en este estudio, siendo amablemente donado por la Dra. Haydee Torres Guerrero (Depto. de Parasitología y Microbiología. Facultad de Medicina. UNAM). Condiciones de cultivo de S. schenckii Para conservar y generar conidias y levaduras de S. schenckii se utilizo el medio YPG constituido por 0.3% de Extracto de levadura, 1% peptona, 2% dextrosa, 2% agar, ph 4.5. Los cultivos se incubaron a 28 C durante 10 días y se obtuvieron las conidias. Para 136

2 propagar los hongos se cultivaron 1X10 5 ml conidias/ml en medio YPG durante 4 días y se cosecharon las levaduras (Rodríguez Del Valle y col., 1983). Cultivo de células epiteliales Las células epiteliales L929 (ATCC-CCL1) son cultivadas (1x10 5 células/ml) en medio D-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 0.1% de una mezcla de antibióticos y antimicóticos (GIBCO), los cultivos se incubaron durante 48-72h a 37 C, 5% de CO 2 y humedad constante (Freshney, 2000). Ensayos de interacción Hongo - célula blanco Los cultivos de epitelios son incubados con 10 4 levaduras/ml por diferentes periodos de tiempo a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO 2. (Mendes- Giannini y col, 2000) Microscopia electrónica Después de la interacción de las células epiteliales con levaduras de S. schenckii, los cultivos se procesaron para microscopia electrónica de transmisión y de barrido (Sabanero y col, 1986, Dutt y col, 2003). Las preparaciones fueron examinadas en el Microscopio electrónico (Zeiss Modelo 1010). RESULTADOS Interesados en caracterizar in vitro la interacción entre las levaduras de S. schenckii y las células epiteliales, se analizo el proceso de adhesión (Fig. 1). Efectuando cinéticas de interacción se observo, que a las 24h de interacción, la levadura es rodeada por extensiones de la membrana plasmática (Fig. 1A) y a 48h de interacción la levadura se encuentra en el interior de la célula blanco (Fig. 1B). Por otra parte la Microscopia de Barrido (Fig. 1C y D), muestra que el patógeno se adhiere íntimamente a la superficie del epitelio, como consecuencia de la interacción el patógeno es capaz de alterar la superficie de la células epiteliales, modificando los procesos celulares, perdida de la continuidad de la monocapa y de los contactos celulares. 137

3 Figura1. Microscopia electrónica de las células epiteliales infectadas con levaduras de S. schenckii (Y). Se muestra la interacción a 24h(A y C) y 48h (B y D). Conclusiones La adhesión microbiana representa un paso esencial durante el proceso de infección. (Klotz et al., 1991). La mayoría del conocimiento acerca de los determinantes de virulencia de los hongos patógenos viene a partir de modelos animales y recientemente a partir de estudios in vitro empleando cultivos celulares (Mendes-Giannini et al., 2000). Nuestros resultados muestra que la pared celular del hongo esta en intimo contacto con la membrana plasmática, sugiriendo la participación de moléculas de superficie en la interacción. El fenómeno de parasitismo depende de la complementariedad en las moléculas de superficie (Mendes-Giannini et al., 2005). Sin embargo la naturaleza de las moléculas involucradas en la adhesión de S. schenkii a los epitelios se desconoce. Futuras investigaciones serán fundamentadas en la caracterización de las moléculas implicadas en dicha interacción hongo célula epitelial. Bibliografía Freshney, RA Culture of animal cells: A manual of basic Technique. New York: John Wiley & Sons. 138

4 Kauffman CA Sporotrichosis. Clin Infect Dis 229: Klotz SA, Smith RL A fibronectin receptor on Candida albicans ALS2 and ALS4 and localization of als proteins to the fungal cell surface. J Bacteriol 180: Mendes-Giannini JS, Taylor ML, Bouchara JB Burger E, Calich KG, Duarte Escalante E, Hanna SA, Lenzi HL, Machado MP, Miayani M, Monteiro da Silva JL, Mota EM, Restrepo A, Restrepo S, Tronchini G, Vincezi LR, Xidieh CF, and Zenteno E Pathogensis II: Fungal responses to host responses: interaction of host cells with fungi. Med Mycol 38: Rodríguez Del Valle N, Rosario M, Torres-Blasini G Effects of ph, temperature, aeration and carbon source on the development of the mycelia or yeast forms of Sporothrix schenckii form conidia. Mycopathologia 82: Sabanero M, González Robles A, Meza I Characterization of a 36,000-dalton protein from the surface of Madin- Darby canine kidney cells involved in cell attachment and spreading. JCB 100: Dutt, K y col, Three dimensional model of angiogenesis (2003). Tissue engineiering 9:

5 Directorio Jefe del Departamento de Ingeniería Química: Dr. Agustín Ramón Uribe Ramírez Director de la Revista: Dr. Jaime Romero González Editores: M.C. Héctor Ismael Olmos Castillo p.i.q. José Omar Hernández Rodríguez Consejo Editorial: Dra. Rosalba Fuentes Ramírez Dra. Rosa Maria Ortiz Hernández Dr. José Ramírez Flores 140