MATERIALES Y MÉTODOS. Animales

Transcripción

1 MATERIALES Y MÉTODOS Animales Se utilizaron ratones de género masculino de 8 a 10 semanas de edad, de la cepa singénica C3H/HeJ, adquiridos en The Jackson Laboratories (Maine, USA). Los animales se mantuvieron en el bioterio del Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos de la Universidad de Sonora (DIPA), con fotoperíodos de 12 horas a 25ºC y alimentados ad libitum. Proteína PE_PGRS33 La proteína PE_PGRS33 (Rv1818c) de Mycobacterium tuberculosis que se utilizó en este estudio, fue proporcionada amablemente por la Dra. Clara Inés Espitia Pinzón, del Departamento de Inmunología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la UNAM, a una concentración de 0.75 mg/ml en buffer Tris-HCl 80mM-pH 8.0. La masa molecular relativa de la proteína es de 40.7 KDa y el punto isoeléctrico de 3.9. Líneas Celulares Se utilizaron las líneas M12.A k C3.F6 proveniente de linfoma de células B de ratón, células T BW5147α - β - (ATCC) provenientes de timoma de ratón y CTLL-2 (linfocitos T CD8 + ) para bioensayos con interleucina 2 (IL-2). Los cultivos celulares se mantuvieron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco 20

2 (DMEM), suplementado al 5% con suero fetal bovino (SFB), inactivado por calentamiento. Generación de Hibridomas de Células T Un grupo de 5 ratones fueron inmunizados en cada cojinete plantar, con una emulsión de adyuvante completo de Freund y 1 nmol de la proteína PE_PGRS33 en volúmenes iguales. Posteriormente, al día 10 post-infección, se sacrificaron los ratones, se extrajeron los ganglios linfáticos poplíteos de cada uno y se homogenizaron con medio DMEM suplementado al 10% con suero fetal bovino (D10F). El extracto celular que se obtuvo, se filtró a través de tela de organza estéril y se lavó 2 veces con medio D10F, a 1700 rpm por 7 minutos a 4ºC. Después del lavado, el botón celular se resuspendió en D10F para realizar una cuenta celular en una cámara de Neubauer. Se utilizó azul de tripano a una dilución 1:100 para medir la viabilidad celular. Las células se incubaron in vitro con una concentración de 1 µm de la proteína, por cada 5 x10 6 células/ml, en un frasco de cultivo de 25 cm 2 de superficie, en posición vertical por 3 días a 37ºC, con medio D10F (Ver Apéndice I). Al tercer día de estimulación con la proteína, las células se lavaron 3 veces con medio DMEM a 1500 rpm por 7 minutos a temperatura ambiente, y se realizó una cuenta celular. Por otra parte, se midió la viabilidad celular de las células T BW5147α - β - (ATCC) de timoma de ratón y se ajustó la suspensión a una concentración definida. Para llevar a cabo la fusión de las células, se mezclaron ambos tipos celulares en una relación 1:3 (1 célula proveniente del ratón por cada 3 células BW5147α - β - ) y se lavaron 3 veces a 37ºC con D10F. 21

3 Después del último lavado, todo el medio se decantó y se centrifugó solamente el botón celular a 1000 rpm por dos minutos, para eliminar todo el medio posible; luego las células se colocaron en un baño de agua a 37ºC para realizar la fusión celular. La fusión se realizó de la siguiente manera: se añadió 1 ml de polietilenglicol al 50% (PEG 1500) como agente fusionante, gota a gota por un minuto y se agitaron las células un minuto más; posteriormente se adicionó 2 ml de DMEM gota a gota por 2 minutos y 7 ml de DMEM por 3 minutos. Estos pasos, ya fueron estandarizados, por lo que fue importante controlar tanto el tiempo, volumen y temperatura para la correcta fusión de las células. Después se centrifugó a 1700 rpm durante 5 minutos y se eliminó el medio por aspiración utilizando una pipeta y no por decantación. Las células se resuspendieron cuidadosamente en 10 ml de D10F y se incubaron a 37ºC y 5% de CO 2 por 30 minutos. Posteriormente, se ajustó la concentración celular a 5 x10 5 células/ml y a 2.5 x10 5 células/ml en medio D10F y se colocaron 100 µl por pozo, en 5 placas de cultivo de 96 pozos, respectivamente. Es decir, se obtuvieron 5 placas de cultivo con 25,000 células/pozo en 100 μl, y otras 5 placas con 50,000 células/pozo. El resto del cultivo celular se mantuvo en una caja de cultivo celular de 75 cm 2 (40 ml) como respaldo, a una concentración de 5 x10 5 células/ml. Las placas y la caja de cultivo se incubaron a 37ºC y 5% de CO 2 por 24 horas. Al día siguiente, se adicionaron 100 µl por pozo de medio de cultivo selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina), y 40 ml a la caja de cultivo. El medio HAT permitió solamente el crecimiento de las células fusionadas, las cuales se incubaron entre 8 y 10 días a 37ºC en atmósfera de CO 2, hasta observar crecimiento. Las células que proliferaron se trasfirieron a placas de 48 pozos, y una semana después el medio selectivo HAT se cambió por el medio HT (Hipoxantina-Timidina) utilizando D10F para su resuspensión (Ver Apéndice II). 22

4 Tamizaje de Hibridomas de Células T Específicos Contra la Proteína PE_PGRS33 Se realizó una selección (tamizaje) de los hibridomas específicos de la proteína PE_PGRS33 (Rv1818c), mediante un bioensayo de hibridomas de células T y células presentadoras de antígeno (CPA), en presencia y ausencia de la proteína. Los hibridomas autorreactivos que se activaron en ausencia de la proteína se descartaron. Primero, los hibridomas de células T y las CPA M12.A k C3.F6 se contabilizaron, para ajustar la concentración final de cada una a 1x10 6 células por ml. También se ajustó la concentración de la proteína a 0.1 µm con medio DMEM suplementado al 5% con suero fetal bovino (D5F). En placas de 96 pozos, se colocaron 100 μl (100,000 células) de la suspensión de hibridomas de células T, 50 μl (50,000 células) de la suspensión de células M12.A k C3.F6 y 50 μl de la proteína 0.1µM. Se incubaron por 20 horas a 37ºC en una atmósfera de CO 2, y posteriormente se transfirieron 100 μl del sobrenadante de cada pozo a otra placa de cultivo. Las placas con el sobrenadante se congelaron a -30ºC por lo menos durante una hora. Se utilizó como control negativo de activación: 100,000 hibridomas, 50,000 células M12.A k C3.F6 y 50 μl de medio D5F por pozo, en lugar de la proteína. Los hibridomas de células T, que no se activaron en presencia de 0.1 µm de la proteína PE_PGRS33, se probaron con 0.5 µm, para descartar que fueran hibridomas inespecíficos (Ver Apéndice III). 23

5 Ensayo con Células CTLL-2 Los hibridomas de células T que fueron específicos de la proteína PE_PGRS33, se activaron produciendo IL-2, la cual se utilizó para medir proliferación de las células CTLL-2 dependientes de IL-2 para su crecimiento. Las células CTLL-2 se lavaron 5 veces a 1500 rpm por 7 minutos con DMEM y se ajustó la suspensión celular a 8 x 10 5 células por ml en medio D5F. Posteriormente, se adicionaron 50 μl (40,000 células) a cada pozo de las placas con el sobrenadante (IL-2 proveniente de los hibridomas activados) y se incubaron por 20 horas a 37ºC en atmósfera de CO 2. Se utilizaron como controles internos, células CTLL-2 más IL-2 (1:150) como control positivo. Como control negativo, se utilizaron células CTLL-2 más medio D5F. Evaluación de la Proliferación Celular por el Método de MTT El MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazoliumbromuro] o sal de tetrazolium, se utiliza para desarrollar un ensayo colorimétrico cuantitativo, mediante su reducción a formazán, ocasionado por las células activas (CTLL-2). Después de la incubación de las células CTLL-2 con el sobrenadante, se adicionaron 15 μl de MTT y se incubaron por 4 horas a 37ºC en atmósfera de CO 2. Posterior a ello, se adicionaron 150 μl de isopropanol acídico para solubilizar los cristales de formazán y se midió la absorbancia de la solución en un lector de microplacas a nm. 24

6 Subclonación de los Hibridomas de Células T Específicos Contra la Proteína PE_PGRS33 Los hibridomas de células T que resultaron específicos contra la proteína PE_PGRS33 en el tamizaje y ensayo de células CTLL-2, se subclonaron. Para lo cual, se realizó una cuenta celular de los hibridomas de células T y se ajustó la concentración a 2.5 células por ml en D5F. Se adicionaron 200 µl por pozo a una placa de 96 pozos, de tal manera que se dispuso de 0.5 células por pozo. Los pozos en los que se observó proliferación de los hibridomas, se sometieron nuevamente a un bioensayo con las CPA y CTLL-2. Aquellos hibridomas que resultaron específicos contra la proteína PE_PGRS33 después del ensayo, se consideraron clonales y se expandieron en cajas de cultivo de 25 cm 2 utilizando medio D5F. Posteriormente, los hibridomas se congelaron en nitrógeno líquido a -196ºC (Ver Apéndice IV). 25