MATERIALES Y MÉTODOS. Tipo de Estudio. El presente estudio es de tipo experimental. Tamaño de Muestra

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1 MATERIALES Y MÉTODOS Tipo de Estudio El presente estudio es de tipo experimental. Tamaño de Muestra Participaron diez sujetos (hombres o mujeres) saludables. Criterios de Inclusión Los criterios de inclusión fueron los siguientes: adultos hombres y mujeres clínicamente saludables, no suplementados con vitamina E y con edades entre 20 y 30 años. Criterios de Exclusión Portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Desnutrición severa Alcoholismo o drogas ilícitas Embarazo Cáncer Consumo habitual de vitamina E o suplementos que la contengan Uso de medicamentos inmunosupresores Biometría hemática y Química sanguínea fuera de los valores normales 12

2 Criterios de Eliminación Todos aquellos sujetos que presentaran una baja cuenta celular o viabilidad celular menor al 95% fueron eliminados. 13

3 Muestras Separación de Células Mononucleares Se extrajeron 6 ml de sangre de cada uno de los sujetos de estudio, la cual fue recolectada en tubos con heparina (Vacutainer). La muestra se obtuvo por punción venosa antecubital. A partir de la muestra de sangre se obtuvieron células mononucleares (CMN), utilizando para ello un gradiente de Ficoll (Ficoll- Hypaque, Amersham Biosciences), en relación 2:1 (sangre:ficoll), centrifugando a 1,400 r.p.m., durante 20 minutos a 4 ºC. Una vez obtenidas las CMN, éstas fueron lavadas dos veces con medio RPMI-1640 con antibióticos para después ser resuspendidas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB). Las células fueron contadas utilizando cámara de Neubauer, su viabilidad se evaluó con azul de Tripano (dilución 1:10) y fueron ajustadas a una concentración de 2.5 x 10 6 células/ml. Estimulación y Suplementación de Células Las CMN fueron estimuladas con PHA (fitohemaglutinina), con una concentración final de 25 μg/μl y se suplementaron con vitamina E utilizando tres concentraciones: 10, 50 y 100 μm. Las CMN se cultivaron en microplacas de cultivo con 48 pozos. Para ello, en cada pozo se añadió un millón de células por 24 horas, a 37 ºC, en atmósfera con 5% de CO 2 en medio RPMI-1640 con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2mM de L- Glutamina y 0.05 mm de β-mercaptoetanol. 14

4 Preparación de Vitamina E La vitamina E fue preparada disolviéndola en etanol absoluto y posteriormente se adsorbió en suero fetal bovino para obtener la vitamina a una concentración de 2.31 mm, la cual fue almacenada a -70 C. A partir de esta solución se prepararon diferentes soluciones de vitamina E (40, 200 y 400 μm) en medio RPMI-1640 con SFB al 10%. Estas soluciones fueron preparadas cada semana. Extracción de RNA Para la extracción de RNA de las células mononucleares, se llevó a cabo la cosecha de éstas en tubos estériles. Se realizó una centrifugación a 3,500 r.p.m., por 5 minutos, para sedimentarlas. Se retiró el sobrenadante, se adicionó 1 ml de trizol y se mezcló invirtiendo el tubo 5 veces. Después de mantener el tubo por 5 minutos a temperatura ambiente, se adicionaron 200 μl de cloroformo, se mezcló vigorosamente por 15 segundos utilizando vórtex y el tubo se mantuvo de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido ese tiempo, se centrifugó por 15 minutos, a 4 ºC y a una velocidad máxima de 12,000 g. Se tomó la fase acuosa clara superior (500 μl) y se colocó en un nuevo tubo. Se le adicionaron 500 μl de isopropanol, se mezcló por inmersión y se mantuvo a temperatura ambiente por 10 minutos. Después, se procedió a centrifugar por 10 minutos a 4 ºC y a g. Se eliminó el sobrenadante, se adicionó 1 ml de etanol (75% en 0.1% DEPC-agua tratada) sobre el botón y se mezcló suavemente en vórtex. Se realizó una última centrifugación por 5 minutos a 4 ºC y a 7500 g. Se desechó el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente. Se resuspendió el botón obtenido en 20 μl de agua. El RNA aislado fue cuantificado utilizando un espectrofotómetro (260 nm), utilizando agua como blanco. Se realizaron lecturas de la muestra a 260 nm y 15

5 280 nm. Se calculó la pureza de la muestra dividiendo la lectura a 260 nm entre la obtenida a 280 nm. RT-PCR y Cuantificación de cdna Se obtuvo DNA complementario (cdna) a partir del RNA obtenido haciendo uso de la técnica de PCR con Transcriptasa Reversa (RT-PCR), utilizando el kit de Invitrogen Superscritp First-Strand, de acuerdo al siguiente protocolo: RNA dntp Primer OligodT 0.5 μg/μl 100 ng 1 μl 1 μl Se llevó a cabo una incubación a 65 C por 5 minutos, y después se agregaron, a cada tubo, las siguientes soluciones de trabajo: Buffer RT 10X (2 μl), MgCl 2 25mM (4 μl), DDT 0.1M (2 μl), RNasa Out (40 U/μL). Se mezcló y se realizó una segunda incubación a 42 C por 2min, para después agregar 1 μl de Superscript II RT (50 U/μL) a cada uno de los tubos y se prosiguió con dos incubaciones: una a 42 C por 50 minutos y otra a 70 C por 15 minutos. Posteriormente se enfriaron los tubos de reacción en hielo para después ser centrifugarlos se les agregó 1 μl de RNasa H (2 U/μL) e incubaron por última vez a 37 C por 20 minutos. El cdna obtenido fue almacenado a -10 C. Se utilizó Brilliant SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, el cual incluye la mezcla ya preparada de buffer, Mg 2 Cl, nucleótidos, DNA Taq Polimerasa SureStart y SYBR Green. 16

6 1.875 μl Primer Fw 1 mm μl Primer Rv 1 mm 12.5 μl Master Mix 6.75 μl H 2 O DEPEC 2 μl de la solución de cdna obtenido Los primers que se utilizaron para cada una de las citocinas fueron: IL-2 Fw IL-2 Rv IL-4 Fw IL-4 Rv IL-10 Fw IL-10 Rv IFN-γ Fw IFN-γ Rv β-actina Fw β-actina Rv 5 -AACTCACCAGGATGCTCACATTTA 5 -TCCCTGGGTCTTAAGTGAAAGTTT 5 -CCACGGACACAAGTGCGATA 5 -CCCTGCAGAAGGTTTCCTTCT 5 -GTGATGCCCCAAGCTCAGA 5 -CACGGCCTTGCTCTTGTTTT 5 -TCAGCTCTGCATCGTTTTGG 5 -GTTCCATTATCCGCTACATCTGAA 5 -AAGCAGCAGTATGACGAGTCCG 5 -CGGAACTAAGTCATAGTCCGCC Protocolo para citocinas por PCR Tiempo Real Número de Ciclos Tiempo T C 1 10min seg 95 60seg seg 72 Se utilizó el sistema SmartCycler 1600 de Cepheid para la realización de la PCR Tiempo-Real. 17

7 Análisis de Resultados Los resultados obtenidos por PCR tiempo real fueron analizados mediante una prueba de Kruskal-Wallis, utilizando el paquete estadístico NCSS