Este proyecto fue realizado en el laboratorio de Ecotoxicología Acuática de la Unidad de Química Sisal, UNAM.

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José Aguilar Belmonte
hace 6 años
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2 Este proyecto fue realizado en el laboratorio de Ecotoxicología Acuática de la Unidad de Química Sisal, UNAM.

3 Es el estudio del destino y los efectos de los contaminantes en los ecosistemas, intentando explicar las causas y prever los riesgos probables.

4 Miden el efecto de los contaminantes en los organismos a diferentes niveles de organización.

5 Es un insecticida organofosforado de apariencia cristalina y de aroma fuerte. Se usa para el control de plagas en la agricultura y en el hogar También se usa en el ganado para eliminar parásitos.

6 El mecanismo de toxicidad es mediante la inhibición de la enzima Acetilcolinesterasa (AChE). Puede producir una variedad de efectos sobre el sistema nervioso, incluyendo dolores de cabeza, visión borrosa, lagrimeo, excesiva salivación, secreción nasal, mareo, confusión, debilidad o temblores musculares, náusea, diarrea y cambios bruscos en el latido del corazón. Si la exposición es prolongada o a concentraciones muy altas puede producir la MUERTE.

7 Acetilcolinesterasa

8 Acetilcolinesterasa

9 Inhibición de la AChE

(compartimos con estos peces más del 80% del genoma) que permite que

10 Pez muy utilizado como organismo de prueba en estudios toxicológicos. Es especialmente apreciado por su homología genética con el hombre (compartimos con estos peces más del 80% del genoma) que permite que los resultados obtenidos sean potencialmente extrapolables al ser humano.

11 La hembra pone hasta 200 huevos por día de forma continua durante todo el año y los embriones tienen un rápido desarrollo.

12 Sus embriones son transparentes, algo que hace posible observar el efecto de los contaminantes en sus órganos internos en formación.

13 OBJETIVOS Evaluar el efecto del plaguicida organofosforado Clorpirifos en la actividad de la enzima (AChE) a diferentes concentraciones en alevines de pez cebra.

14 Exposición Metodología Se expusieron alevines de 1 semana de edad de peces cebra a 200, 400 y 800 µg/l de Clorpirifos. Se expusieron 5 alevines por réplica y 3 réplicas por concentración.

plaguicidas. El tiempo de exposición fue de 24 horas.

15 Metodología Se preparó también un control solvente que contenía etanol en la misma proporción que los tratamientos con el plaguicidas. El tiempo de exposición fue de 24 horas. Transcurrida la exposición, los alevines se congelaron a -80 C hasta su análisis.

Metodología Preparación de la muestra Se descongelaron

g durante 10 minutos Al pasar el tiempo asignado de la

16 Metodología Preparación de la muestra Se descongelaron los organismos y se homogenizaron por 1 minuto con búfer Tris ph 8.0. Después de la homogeneización se centrifugó a x g durante 10 minutos Al pasar el tiempo asignado de la centrifuga se procedió a extraer el sobrenadante que fue utilizado como fuente de la enzima.

17 Metodología. Determinación de la actividad de AChE Colocamos 170 µl de la solución DTNB/búfer Tris ph 7.4 y 20 µl del homogenizado. (preparar en una placa de 96 pozos) Agitamos para mezclar todo por 5 minutos.

18 Metodología Antes de iniciar la lectura se le agregó 10 µl de acetiltiocolina (ASChI). Leímos la absorbancia en un lector de placas a 405 nm por 1 minuto, utilizando el modulo de cinética. Se obtuvo el parámetro Abs /min que es una relación de cuánto cambia la absorbancia en 1 minuto.

Determinación de proteína por el método de

$bovina (ABS) fracción v en los pozos$ Se pipetearon 2 µl de muestra en los pozos

19 Determinación de proteína por el método de Bradford (para normalizar los datos) Se pipetearon 10 µl de cada una de las soluciones estándares de albumina sérica bovina (ABS) fracción v en los pozos apropiados. Se pipetearon 2 µl de muestra en los pozos y 140 µl de reactivo Bradford. Se colocó la placa en un agitador por 10 min a temperatura ambiente.

20 Metodología Se leyó la absorbancia a 595 nm. La concentración de proteína se calculó interpolando en la curva de ABS y = 4316x x R² =

21 Cálculo de la actividad 1 Abs/min Actividad enzimática = * * nmoles/min/mg proteína (Vh/Vt)*Cp Donde Abs/min= cambio de Absorbancia en el tiempo (se obtiene de la cinética) Vh/Vt= Volumen del homogeneizado/ Volumen total de reacción = 20 ml/200ml Cp= Concentración de proteína mg/ml

22 Resultados 800 AChE nmol/min/mg prot * * * Control Clorpirifos g/l

23 Conclusiones El Clorpirifos es un potente inhibidor de la enzima AChE. Todas las concentraciones de exposición evaluadas en este ensayo tuvieron una inhibición significativa respecto al control. El efecto inhibitorio se observó con tan solo 24 hrs. de exposición.

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