ANEXOS ANEXO 1. Obtención de Antígeno Soluble de G. lamblia.

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1 ANEXOS ANEXO 1 Obtención de Antígeno Soluble de G. lamblia. Método 1.- Cultivo axénico y a confluencia de trofozoítos de Giardia (Mantener en hielo por 15 min). 2.- Centrifugar a 800 x g por 10 minutos a 4 C. Lavar 3 veces con 10 ml de PBS ph 7.2 (centrifugado a 800 x g 10 min a 4 C). 3.- Resuspender en 1.4 ml de PBS ph Cuenta celular en hematocitómetro (5 µl de la suspensión µl PBS ph 7.2) (dilución 1:200). 20 µl de suspensión +20 µl de Azul de Tripano (Dil. 1:2). 5.- Lisis Celular (1.500 ml de suspensión en microtubo). Congelar y descongelar 3 veces en N 2 líquido-temperatura ambiente (revisar lisis en microscopio). 6.- Adicionar 140 µl de inhibidores de proteasas (SIGMA, P2714 inh, de proteasas). 7.- Sonicar 2 min a 20 ciclos (2 veces). 8.- Centrifugar a 14,000 x g a 4 C por 15 min. 9.- Se obtiene un precipitado (Pastilla) y un sobrenadante (Ag soluble), etiquetar y almacenar a -30 C por separado. 35

2 ANEXO 2 Infección de Ratones Método 1. Someter a los ratones a infectar a 6 o 9 horas de ayuno, con el fin de favorecer la infección. 2. Mantener el cultivo de G. lamblia por 20 minutos en agua-hielo para liberar los trofozoítos adheridos a la pared del tubo. 3. Lavar los trofozoítos 3 veces en solución reguladora de fosfatos, ph 7.2 (GIBCO), usando centrifuga a 800 x g por 10 minutos a 4 ºC. 4. Previo al último lavado, resuspender la pastilla de trofozoítos en 500 µl de PBS 1X para su cuantificación en hematócimetro utilizando el colorante azul de tripano (Tripan blue solution 0.4 % SIGMA cat T8154). 5. Después del ultimo lavado resuspender la pastilla de trofozoítos en PBS 1X y ajustar a 5 x 10 6 trofozoítos en 200 µl de solución. 6. Con ayuda de una jeringa para alimentación forzada, se inoculan por vía oral 200 µl de la suspensión de trofozoítos a temperatura ambiente (22-25 ºC). 36

3 ANEXO 3 Protocolo de Fusión de Células B Método Los ratones son infectados en 3 ocasiones con 5 x 10 6 trofozoítos por vía intragástrica con aguja de alimentación forzada, a la octava semana posterior a esta infección se da una segunda infección como se mencionó anteriormente, 6 semanas después se infecta nuevamente y 5 días después a esta los ratones son sacrificados para realizar la fusión de las células B de bazo. Día 0 Infecta con 5 x 10 6 trofozoítos 8 semanas Día 1 Reinfecta con 5 x 10 6 trofozoítos 6 semanas Día 1 Reinfecta con 5 x 10 6 trofozoítos 5 días Se sacrifican 1. Infectar un grupo de 3 ratones, con 5x10 6 de trofozoítos de G. lamblia vía oral, en un volumen final de 200 µl para cada ratón. 2. A la 3ª infección, sacrificar los ratones en el 5º día y extraer el bazo. 3. Colocar estos en una placa de petri, con 10 ml de D10F y homogenizarlos (utilizar la parte posterior de una jeringa estéril). Filtrar el extracto obtenido con tela de organza estéril y pasarlo a un tubo cónico de 50 ml. 4. Centrifugar las células por 5 min a 1000 x g rpm. 5. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 5 ml de ACK lysing para eliminar los glóbulos rojos. 6. Centrifugar nuevamente a 1000 x g por 5 min. 7. Resuspender las células en medio DMEM a 37 ºC. 8. Lavar las células 2 veces con DMEM como se mencionó anteriormente y contar las células en este punto. 37

4 9. Contar las células P3 X 63.Ag8 la cantidad de éstas deberá ser igual al numero de células B que se obtuvieron, es decir una relación 1:1 (1 célula B por cada célula P3 X 63.Ag8). Preparación Para la Fusión Celular 1. Mezclar en un tubo cónico de 50 ml ambas células ya en proporción correcta y realizar 3 lavados con DMEM a 500 x g por 7 min a 37 ºC. 2. Después del último lavado, descartar el sobrenadante con pipeta pasteur y centrifugar nuevamente el pellet a 500 x g por 2 minutos, para eliminar la mayor cantidad de medio posible. Retirar el excedente de medio con una pipeta pasteur y colocar las células en un baño de agua previamente equilibrado a 37 ºC. 3. NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse controlando: TIEMPO, VOLÚMEN Y TEMPERATURA estrictamente. Se recomienda usar un cronómetro y tener todas las pipetas y soluciones, listas y temperadas a 37 ºC. Los volúmenes deben ser adicionados uniformemente y gota a gota por los tiempos indicados para las condiciones óptimas de fusión (Adicionar una gota y agitar con la pipeta por 2-3 segundos, adicionar otra gota y agitar). 3. a.- Adicionar 1 ml de 50 % PEG1500 gota a gota por 1 minuto. 3. b.- Agitar las células por 1 minuto. 3. c.- Adicionar 2 ml de DMEM gota a gota por 2 minutos. 3. d.- Adicionar 7 ml de DMEM gota a gota por 3 minutos. 4. Centrifugar a 500 x g por 5 minutos y retirar todo el medio con una pipeta Pasteur. 5. Resuspender la pastilla suavemente en 10 ml de D10F (adicionar medio con una pipeta por encima del pellet, una sola vez y agitar con la pipeta para resuspender, NO ASPIRAR hacia arriba y abajo en este punto). Diluir con D10F hasta 300 ml y adicionar ciclosporina A a una concentración final 300 ng/ml Dejar reposar las células a 37 ºC y 5 % CO 2 por 30 minutos. 38

5 6. Contar las células (hibridomas) y ajustar la concentración a 5 x 10 5 células/ml y 2.5 x 10 5 células/ml utilizando D10F (basado en el número total de células B y P3 X 63.Ag8). 7. Colocar 100 µl/pozo en 5 placas (3-10 placas) de 96 pozos de fondo plano, de cada una; de tal forma que se tengan 5 placas a una concentración de 50,000 células/pozo, y 5 placas a 25,000 células/pozo. El resto del cultivo será el Bulk Culture (ajustar a una concentración de 5 x 10 5 células/ml) y se mantendrá en un frasco de cultivo celular de 40 ml. 8. Incubar las placas con células a 37 ºC en 5 % CO 2 durante toda la noche. 9. Al día siguiente, adicionar 100 µl/pozo de medio D10F HAT 2X/300 ng de ciclosporina A, en las respectivas placas de 96 pozos y permitir el crecimiento hasta que exista crecimiento positivo evidente en los pozos. 10. Dejar que los hibridomas proliferen hasta observar pozos positivos (7-10 días) y dejar que el Bulk Culture prolifere entre 5 y 7 días en medio HAT 1X, por lo cual se necesitará realizar pases de medio. 11. Si los hibridomas de las placas de 96 pozos fueron clonales (cuando menos el 50 % de los pozos fueron positivos), cosechar los pozos en placas de 48 pozos y expandir por 3 días (Variable), después cambiar el medio HAT por HT 1X utilizando D10F. 12. El sobrenadante de los pozos positivos debe ser probado para la producción de anticuerpos monoclonales tan pronto las células crezcan. 13. Después de los 5-7 días, cambiar el medio del Bulk Culture por HT 1X (al menos un pase). 39

6 ANEXO 4 Inmunofluorescencia Indirecta de Trofozoítos de G. lamblia Método 1. Mantener el cultivo de G. lamblia por 20 minutos en agua-hielo para liberar los trofozoítos adheridos a la pared del tubo. 2. Lavar los trofozoítos 3 veces en solución reguladora de fosfatos 1 % azida de sodio 0.1 %, ph 7.2 (GIBCO), usando centrifuga a 800 x g por 10 minutos a 4 ºC. 3. Previo al último lavado, resuspender la pastilla de trofozoítos en 500 µl de PBS- 1 % azida de sodio 0.1 %, ph 7.2, para su cuantificación en hematocímetro utilizando el colorante azul de tripano (Tripan blue solution 0.4 % SIGMA cat T8154). 4. Ajustar la cantidad de 5 x 10 5 trofozoítos por pozo en placas de 96 pozos V- Bottom. 5. Se centrifuga a 800 x g para eliminar el exceso de buffer y resuspender en el sobrenadante del hibridoma a probar. 6. Incubar por 1 hr a 4 ºC. 7. Realizar 3 lavados con PBS-BSA 1%- azida de sodio 1 % ph 7.2 a 4 ºC, en el último lavado se elimina el sobrenadante y resuspender en el anticuerpo secundario en dilución 1:200 (Goat anti-igg Mouse FITC). 8. Se incuba por 1 hr a 4 ºC y protegido de la luz. 9. Realizar 3 lavados como se mencionó anteriormente, los trofozoítos se resuspenden en 100 µl de PBS-BSA 1 %- azida de sodio 0.1 % ph 7.2 y se agrega 100 µl de paraformaldehído 2 %. 40

7 ANEXO 5 Electroforesis en Geles de Poliacrilamida en Condiciones Desnaturalizantes y Reductoras (SDS-PAGE) Método 1. Ensamblar los vidrios en el equipo para geles de 0.75 mm. 2. Asegurarse que no haya fuga de líquido, colocando un poco de alcohol etílico al 70 %. 3. Descartar el alcohol y secar el remanente con papel filtro. 4. Preparar geles de separación al 12 % de 0.75 mm de grosor. Gel separador (2 minigeles de 6 X 8 cm y separador de 0.75 mm) Acrilamida/Bisacrilamida 30 %/8 %...6 ml Buffer Tris 4X con SDS ph ml Agua des-ionizada 5.25 ml Persulfato de amonio (PSA) 0.08 ml TEMED ml 1. Mezclar muy bien y colocar el gel en los vidrios. 2. Adicionar unas gotitas de alcohol isobutílico con una pipeta Pasteur, evitando la formación de burbujas. 3. Dejar polimerizar por aproximadamente una hora a temperatura ambiente. 4. Lavar 4 veces con agua deionizada y secar con papel filtro evitando tocar el gel. 41

8 5. Prepara gel concentrador al 12 % de 0.75 mm de grosor, con pozos de 5 mm de ancho aproximadamente. Gel concentrador (2 minigeles de 6 X 8 cm y separador de 0.75 mm) Acrilamida/Bisacrilamida 30 %/0.8 % ml Buffer Tris-SDS ph ml Agua des-ionizada ml Persulfato de amonio ml TEMED ml 6. Mezclar muy bien y poner el peine que formará los pozos inmediatamente después de colocar la solución del gel separador entre los vidrios para electroforesis. Dejar polimerizar por una hora a temperatura ambiente. 7. Realizar una dilución del extracto antigénico soluble de G. lamblia 1.5 con solución de buffer muestra 6X en un tubo Eppendorf. 8. Mezclar muy bien la solución de antígeno en vórtex (LAB-LINE, Super Mixer, Arthur H. Thomas Co.) y calentar por 5 minutos a 99 C para retener la reacción de desnaturalización. 9. Tomar 8 µl de Marcador Peso Molecular (MPM) 10. Cargar la muestra antigénica y MPM en los pozos respectivos y correr a 100 Voltios constantes por aproximadamente una hora y media, evitando liberar el frente del gel. 42

9 ANEXO 6 Ensayo Inmunoadsorbente Ligado a Enzima (ELISA) Para Determinación de Isotipo Método 1. Adsorber a los pozos de la placa de ELISA, 50 µl del anticuerpo específico de isotipo en dilución 1:1 000, en solución PBS. 2. Incubar 1 hr a 37 C. 3. Lavar cada pozo de la placa con 250 µl PBS 1X, 5 veces. 4. Llenar cada pozo con 50 µl de solución bloqueadora (PBS 1X- BSA 1 %), incubar 1 hora a temperatura ambiente y en constante rotación. 5. Lavar cada pozo de la placa con 250 µl PBS 1X, 5 veces. 6. Adicionar 50 µl de sobrenadante a probar. Incubar 1 hora a temperatura ambiente y en constante rotación. 7. Lavar cada pozo de la placa con 250 µl PBS 1X, 5 veces. 8. Adicionar 50 µl de 2do. Ac (cabra anti-igg de raton conjugado con peroxidasa) diluido 1:1 000 en PBS 1X, incubar 1 hora a temperatura ambiente y en constante rotación. 9. Lavar cada pozo de la placa con 250 µl PBS 1X, 5 veces. 10. Adicionar 50 µl de solución reveladora (ABTS- H 2 O 2 ), por cada 1000 µl de ABTS se adiciona 1 µl de H 2 O 2 30 %. 11. Cubrir la placa con plástico adherente e incubarla por 15 minutos a temperatura ambiente. 12. Medir la D.O. a 415 nm en el lector de ELISA. 43

10 ANEXO 7 Electrotransferencia e Inmunodetección (Western-Blotting) Método Se realiza una electroforesis en SDS-PAGE al 12 % (0.05 % de SDS y 0.05 % de 2- mercaptoetanol) de extracto antigénico soluble obtenido de trofozoitos de G.lamblia y electrotransferirlo a membranas de nitrocelulosa en condiciones semisecas. Nota: preparar geles de poliacrilamida con un pozo de 5 mm de ancho y 1 cm de largo (para cargar marcadores preteñidos (Prestained, (SDS-PAGE) Standard, Broad Range, cat , Control BIO-RAD) y un pozo de 5 cm de ancho y 1 cm de largo para cargar el antígeno ( µg de antígeno en 250 µl de solución). Los marcadores preteñidos deben mantenerse por un minuto a 37 ºC antes de cargarse en el gel. Electrotransferencia en condiciones semisecas 1. Colocar el gel de poliacrilamida, membrana de nitrocelulosa y dos pads (BIO- RAD) en solución de transferencia 1X, ph 8.3 por 5 a 15 minutos. 2. Acomodar de la siguiente manera: pad, membrana de nitrocelulosa, gel de poliacrilamida, y pad, eliminando en cada paso las burbujas que pudieron haberse formado por el buffer pasando un tubo limpio sobre la capa. 3. Electrotransferir en un sistema semiseco (Semi-Dry Blotting System, modelo IMM-1-A, no. de serie 11798) por 40 minutos a 120 mili amperes constantes. 4. Almacenar la membrana de nitrocelulosa a -25º C hasta su uso posterior. 5. Teñir el gel electrotransferido con azul de Comassie para confirmar la adecuada transferencia del antígeno. 44

11 Inmunodetección 1. Bloquear las membranas de nitrocelulosa electrotransferidas con Ag de Giardia, con PBS 1X- BSA 1 % por 1 hora. 2. Enjuagar membranas con PBS 1X para quitar el exceso de solución bloqueadora. 3. Eliminar el exceso de PBS 1X y agregar el primer anticuerpo (sobrenadante de los hibridomas). 4. Dejar incubar por 2 horas en agitación constante. 5. Enjuagar las tiras suavemente y realizar 5 lavados con PBS 1X, ph 7.2, por 5 minutos. 6. Agregar el segundo anticuerpo (cabra anti-ratón anti IgG peroxidasa conjugada, SIGMA) en dilución 1: con PBS 1X-BSA 1 %-leche Svelty al 10 %. 7. Enjuagar las tiras rápidamente para quitar exceso de suero y realizar 5 lavados con PBS 1X, ph 7.2 de 5 minutos. 8. Colocar tiras en papel transparente después de quitar el exceso de agua (NO DEJAR SECAR), y agregar aproximadamente la solución reveladora: una parte de luminol con una parte de peróxido de hidrógeno (Super Signal, best Pico, Chemiluminescent Substrate, prod no , Lot No. EB60813, Pierce) a cada una de las tiras y dejar incubar por 5 minutos aproximadamente. 9. Exponer las tiras por 30 segundos a una película y revelar por medio de un equipo de revelación GENERAL ELECTRIC o manualmente. Proceso de revelado manual: El proceso de exposición y revelado se realiza en un cuarto oscuro: Exponer la película 20 segundos en solución reveladora. Enjuagar en agua por 5 a 10 segundos. Mantener la película en solución fijadora por 20 segundos. Quitar el exceso de solución enjuagando la película con agua varias veces. Dejar secar. 45

12 ANEXO 8 Tamizaje de los hibridomas por Dot-Blott. Figura 5.- Reconocimiento de Antígenos Solubles de G. lamblia por los Anticuerpos Monoclonales. Se muestran tanto los controles positivo y negativos (como positivo se utilizó un anticuerpo policlonal específico hacia G. lamblia (dilución 1:20), como control negativo se utilizó un suero de ratón sin infección, los controles de PBS y HAT). Se utilizó proteína soluble de G. lamblia de la cepa GS/M-H7 (G), WB C6 (W) y el aislado clínico YJJ (Y), la evaluación de los anticuerpos monoclonales de los hibridomas 5F4, 1B10, 2C9, 3C10, 3D10,, 5G8.D7, 4D5 y 6G1 se muestra en la figura. 46

13 Figura 6.- Se muestran tanto los controles positivo y negativos (como positivo se utilizó un anticuerpo policlonal específico hacia G. lamblia (dilución 1:20), como control negativo se utilizó un suero de ratón sin infección, los controles de PBS y HAT). Se utilizó proteína soluble de G. lamblia se la cepa GS/M-H7 (G), WB C6 (W) y el aislado clínico YJJ (Y), se muestra en la figura la evaluación de los anticuerpos monoclonales de los hibridomas 5G8, 4C7, 3C5, 3G6, 2E7, 3B9, 3C3, 3E11, 1E3, 1D11 y 2D8. Figura 7.- Se muestran tanto los controles positivo y negativos (como positivo se utilizó un anticuerpo policlonal específico hacia G. lamblia (dilución 1:20), como control negativo se utilizó un suero de ratón sin infección, los controles de PBS y HAT). Se utilizó proteína soluble de G. lamblia de la cepa GS/M-H7 (G), WB C6 (W) y el aislado 47

14 clínico YJJ (Y), se muestra en la figura la evaluación de los anticuerpos monoclonales de los hibridomas 2E9, 2D5, 1F4, 1B9, 2C9.C7, 2C9.D3, 2C9.F11, 3C10.G5, 6D7, 5F4 y 5G6. Figura 8.- Se muestran tanto los controles positivo y negativos (como positivo se utilizó un anticuerpo policlonal específico hacia G. lamblia (dilución 1:20), como control negativo se utilizó un suero de ratón sin infección, los controles de PBS y HAT). Se utilizó proteína soluble de G. lamblia de la cepa GS/M-H7 (G) y WB C6 (W), se muestra en la figura la evaluación de los anticuerpos monoclonales de los hibridomas 1B10, 2C9, 3C10, 5G8, 5G8.D7,, 3C3, 3C6, 4D7 y 3D3. Figura 9.- Se muestran tanto los controles positivo y negativos (como positivo se utilizó un anticuerpo policlonal específico hacia G. lamblia (dilución 1:20), como control negativo se utilizó un suero de ratón sin infección, el control de HAT). Se utilizó proteína soluble de G. lamblia de la cepa GS/M-H7, se muestra en la figura la evaluación de los anticuerpos monoclonales de los hibridomas 2C9.C7, 2C9.D3, 2C9.D11, 3C10.E9, 3C10.F3, 3C10.F8, 3C10.F11, 3C10.E6, 3C10.E5 y 5G8.D7. 48

15 ANEXO 9 Graficas de ELISA de la determinación de isotipo de los hibridomas. 1B10 2C B C IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 0.0 IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 3C3 3C C C IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 0.0 IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 3D10 3C10.F D10 Abs 415nm C10.F IgA IgM IgG1 IgG2aIgG2b IgG3 5G8.D IgA IgM IgG1 IgG2aIgG2b IgG3 5G G8.D G8 0.0 IgA IgM IgG1 IgG2aIgG2b IgG3 0.0 IgA IgM IgG1 IgG2aIgG2b IgG3 3C10.E9 3C10.E C10.E C10.E IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 0.0 IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 49

16 ANEXO 10 Hibridomas Cuadro de características de los hibridomas de células B Inmunofluorescencia Dot Blott GS:H7 MHG GS:H7 WB C6 YJJ Isotipo Westernblott de G.lamlia GS/M-H7 1B IgG2a + 2C IgG2b - 2C9.D11 ND IgG2b - 3C IgG2b ND 3C10.E5 ND IgG2b + 3C10.E9 ND IgG2b - 3C10.F8 ND IgG2b + 3C IgG2b - 3C IgG2b - 4C IgG2b - 3D IgG2b - 5F IgG2b - 5G IgG2b ND IgG2b + 5G8.D IgG2b + 50