RADIOINMUNOENSAYO PARA PROGESTERONA EN LECHE BOVINA RESUMEN. Keywords: progesterone, radioimmunoassay, bovine milk.

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1 RADIOINMUNOENSAYO PARA PROGESTERONA EN LECHE BOVINA Miriam Ruiz 1, Nancy Figueredo 2, Sonia Castillo 2, Luis Pizarro 2. 1-Departamento de Radioquímica, Instituto Superior de Ciencias y Tecnología Nucleares Ave Salvador Allende y Luaces. Quinta de Los Molinos. Habana, Cuba. mirian@fctn.isctn.edu.cu 2-Centro de Isótopos, La Habana, Cuba. RESUMEN Se desarrollo y validó un ensayo para la determinación de progesterona en leche bovina por Radioinmunoensayo. En el mismo se utiliza un trazador yodado purificado por HPLC, un estándar preparado en leche descremada, y un antisuero antiprogesterona combinado con un segundo anticuerpo. El límite de detección del ensayo es de 0.2 nmol/l determinado como la concentración correspondiente al enlazamiento máximo menos dos desviaciones estándares y la precesión es satisfactoria. Para el ensayo de recobrado se utilizaron 4 muestras de leche diferentes y el recobrado del ensayo es de un 98%. Se analizó el contenido de progesterona en muestras de leche de animales en periodo potsparto, muestreando a los animales tres veces a la semana durante 40 días. El ensayo es simple, rápido y permite la medición de la progesterona directamente sin dilución de la muestra permitiendo distinguir los cambios cíclicos de esta hormona que reflejan la actividad ovárica en los animales. Keywords: progesterone, radioimmunoassay, bovine milk. I. INTRODUCCION Los altos coeficientes de correlación encontrados entre los niveles de progesterona en leche y plasma [1] han sugerido que la leche constituye un medio útil para la cuantificación de niveles circulantes de esta hormona, a la vez que resulta un método conveniente de muestreo cuando se trabaja con un gran número de muestra al no provocar estrés en los animales, por lo que la determinación de progesterona en leche constituye el diagnóstico endocrino más usado en la medicina veterinaria y la ganadería. Se conoce que el uso de estos ensayos contribuye a mejorar la eficiencia de las empresas ganaderas [2] permitiendo la confirmación retrospectiva de la ausencia (o presencia) de corpus luteum en el momento de la inseminación, la observación de los animales en el período postparto, el diagnóstico de desordenes ováricos, el chequeo de resultados de terapias utilizadas, el seguimiento de animales con pequeña probabilidad de concepción, el diagnóstico de gestación precoz y la observación del aclaramiento metabólico de la progesterona. En el presente trabajo nosotros describimos un Radioinmuensay (RIA) de progesterona homologo, directo, rapido y sensible. II. MATERIALES Y METODOS Trazador. Para la obtención del trazador utilizamos un conjugado de progesterona-11α hemisuccinato-tirosina metil éster (P-11HS-TME) sintetizado en el laboratorio. A 10 µl de buffer fosfato (0.5 mol/l, ph 7.4) se le adicionaron 20 µg de P-11HS-TME, 10µg de Cloramina T (MercK) y 1 mci Na 125 I (Amersham), pasados 2 min. la reacción se detuvo por la adición de 10 µg de metabisulfito de sodio (MercK). El trazador se purificó en una columna de PR-18 empleando una mezcla de metanol: agua (70:30). Una vez purificado, este se diluye con tampón fosfato salino (PBS, 0.01 mol/l, gelatina 0.1% ph 7) hasta cpm en 500 µl. Al trazador diluido se le adiciona suero normal de conejo 1:100. Antisuero antiprogesterona. Se utilizó un antisuero antiprogesterona desarrollado en conejo contra la progesterona- 11α hemisuccinato conjugada con Albumina de Suero Bovino (P-11HS-BSA), en el Centro para el Mejoramiento Animal (CIMA), Cuba. El titulo de trabajo fue de 1:20000 preparado en PBS (0.01 mol/l, 0.05 M EDTA ph 7). Estándar de progesterona en leche descremada. Para la preparación del estándar de progesterona en leche descremada utilizamos un pool de muestras de leche

2 descremadas con contenido cero de progesterona dosificadas por el juego de reactivo de progesterona (FAO/OIEA) suministradas por el CIMA. Se prepararon 6 estándares en el rango de nmol/l a partir de un estándar primario de 1 nmol/l preparado en etanol. La concentración del estándar primario se determinó por gravimetría y se comprobó por estectrometría UV a 240 nm. Posteriormente se liofilizaron los estándares y se conservaron a 4 o C. Muestras de control de Calidad. Se prepararon a partir de un pool de muestras descremadas de concentraciones similares cuantificadas por el juego de reactivo FAO/OIEA en el CIMA, en los rangos bajo y medio de la curva estándar, posteriormente se fijó la concentración por un ensayo repetibilidad. Finalmente se liofilizaron y se conservaron a 4 o C durante el tiempo de trabajo. Reactivo precipitante. Como reactivo precipitante se utilizó un segundo anticuerpo anti-inmunoglobulina de conejo en carnero. El anticuerpo se utilizó en una dilución de 1:8 en PBS (0.01 mol/l, 0.05 M EDTA ph 7). Solución Tampón. Se utilizó PBS (0.05 M EDTA ph7). Polietilenglicol 6000 (PEG). Se utilizó el polietilenglicol 6000 al 10% diluido en PBS (0.05 M EDTA ph 7). Ensayo de progestorona.. En el ensayo se hicieron reaccionar durante dos horas 100 µl estándar, 200 µl de antisuero de progesterona y 500 µl de trazador. Posteriormente se adicionaron 200µL de reactivo precipitante y se incubo por una hora, por ultimo se adicionaron 500 µl de PEG y se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 30 min. Al final los tubos se decantaron, secaron y la radiactividad se contó en un minigamma LKB Muestra de leche. Las muestras de leche utilizadas en el trabajo fueron conservadas con dicromato de potasio 0.1 w/v, descremadas por centrifugación a 3000 r.p.m., 4 o C durante 30 min. y guardadas en refrigeración hasta su cuantificación. Cuantificación de progesterona en animales. Se realizó el estudio de 5 animales ubicados en la vaquería 027 del Instituto Superior de Ciencias Agropecuarias de La Habana (ISCAH), en periodo postparto, las muestras se tomaron durante 40 días a partir del primer día, tres veces por semana siempre después del ordeño de la tarde. II. RESULTADOS Y DISCUSION En el siguiente gráfico se muestra la purificación de P- 11HS-TME-I-125 por HPLC, Con la utilización de este método de purificación se logra obtener un trazador puro, de actividad específica de 2000 Ci/mmol. El pico intermedio entre el 125 I libre y la progesterona monoyodada corresponde a pequeñas cantidades de tirosina metil éster que se encuentra en el material de partida. CPM Fracciones Leyenda I libre, 2- Producto monoyodado, 3-Producto diyodado. Figura 1. Purificación por HPLC de P-11HS-TME marcada con 125 I. Validación del ensayo. El ensayo se validó a partir de la determinación de la sensibilidad, la exactitud (recuperación y paralelismo), y la precisión intra e inter - ensayo Sensibilidad. El limite de detección (o la mínima dosis detectable) del ensayo se determinó como la concentración correspondiente al enlazamiento máximo menos dos desviaciones estándares [ 3] fue de 0.2 nmol/l, resultado aceptable para este tipo de ensayos. Recuperación. Para el ensayo de recuperación se prepararon dos muestras concentradas utilizando el estándar cero y un estándar primario de progesterona ( 67.6 y 338 nmol/l). Una alicuota de 50 µl de cada solución fue adicionada a 950 µl de 4 muestras diferentes de leche descremada, las cuales fueron analizadas en el RIA. Se calculó el recobrado como la relación entre la concentración observada en el ensayo y la esperada ( en %). La media del recobrado fue de 98%. Paralelismo. Se tomaron 10 muestras de diferentes concentraciones y fueron diluidas ½ con una muestra de contenido cero de progesterona. Se realizó una correlación entre el valor de la muestra puro y el observado multiplicado por dos. Como resultado obtuvimos una recta de correlacion igual a Y(Puro)=Diliuda -1.7 con un coeficiente de correlación de Precisión inter e intraensayo. La precisión se realizó utilizando las muestras de control de calidad preparadas. Para el intra - ensayo las muestras se analizaron 10 veces en un mismo ensayo y el inter- ensayo se determinó a partir de los valores obtenidos en 10 ensayos de RIA diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos fueron de 8% y 6% en el intra- ensayo mientras que para el inter- ensayo se obtuvo 14% y 10% respectivamente.

3 Características del ensayo. El ensayo final quedo caracterizado de la siguente forma: Bo : 50-30% NSB: 3-5 % pendiente: 0.87 ± 0.07 ED-50: nmol/ L. Control 1: nmol/ L. Control 2: 5-7 nmol/ L Correlación. Para evaluar el ensayo de progesterona desarrollado (CENTIS) analizamos 30 muestras utilizando dos variantes de estudio de correlación: Juego de reactivo para Progesterona del OIEA. Un juego de reactivo procedente de CIS-BIO utilizando como estándar el del juego de reactivo del OIEA. (OIEA-CIS) Los resultados se muestran en la Fig. 2 y 3. Figura 3. Correlación ensayo CENTIS vs Ensayo OIEA- CIS. Los resultados obtenidos muestran una alta correlación entre los ensayos lo que demuestra la especificidad del ensayo CENTIS. Los ensayos comerciales utilizan como método de separación un anticuerpo inmovilizado en tubo. Muestras de animales. A continuación se muestran los gráficos que reflejan el comportamiento de los valores de progestona en 5 animales estudiados. Figura 2. Correlación ensayo CENTIS vs ensayo OIEA. Figura 4. Comportamiento de los valores de progesterona en el animal 1

4 Figura 5. Comportamiento de los valores de progesterona en el animal 2 Figura 8. Comportamiento de los valores de progesterona en el animal 5. Los resultados obtenidos muestran que con el ensayo CENTIS se logra cuantificar diferentes niveles de progesterona permitiendo observar el estado reproductivo de los animales en su periodo postparto. IV. CONCLUSIONES. En este trabajo desarrollamos un ensayo sencillo, rápido y sensible para la determinación de progesterona en leche bovina, el cual puede ser utilizado en los estudios de reproducción de las empresas ganaderas. Figura 6. Comportamiento de los valores de progesterona en el animal 3 AGRADECIMIENTOS Los autores quieren dar las gracias a los trabajadores de la vaquería 027 del Instituto Superior de Ciencias Agropecuarias de La Habana (ISCAH) por la cooperación prestada en la toma de las muestras de leche. REFERENCIAS [1] Lee J.M., Kim S.G., Jeong S.G. and Jung J.K. Sudies on the early pregnancy determination in cows by using the enzyme-immunoassy and radio-immunoassay in milk, AJAS Vol. 9 p [2] Hruska K. Milk progesterone determination in dairy cows, Reprod Dom Anim. Vol. 31 p Figura 7. Comportamiento de los valores de progesterona en el animal 4. [3] Abraham G.E. Solid phase radioimmunoassay for estradiol-17β, J. Clin Endocrinol Metab. Vol. 29 p

5 ABSTRACT A system for the measurement of progesterone in bovine milk by radioimmunoassay has been developed and validated. This assay includes an iodine tracer purificated by HPLC, the standard prepared in fat-free milk and an antibody anti-progesterone combined with second antibody. The detection limit of the assay is at 0.2 nmol/l calculated from the maximum binding menus two standard deviations and the precision is satisfactory. In the recovery assay was used 4 milk different samples and the result was 98% of recuperation. The progesterone was determinate in milk samples from post-partum animals taking samples three times per week for 40 days. The assay is simple, rapid and possibility the progesterone measurement without sample dilution, distinguish the cyclic changes of this hormone that reflect the ovarian activity in the animals.