UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA DE ALIMENTOS

Transcripción

1 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA DE ALIMENTOS CARACTERIZACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES: CATEQUINA, EPICATEQUINA Y PROCIANIDINAS B 1, B 2 Y C 1 ; EN CACAO CCN-51 DE LAS PRINCIPALES ZONAS PRODUCTORAS DEL ECUADOR. Trabajo de Investigación previo a la obtención del Título de Químico de Alimentos Autor: José Luis Yépez Rivadeneira jlyepezr@uce.edu.ec Tutores: Dr. Iván Rodrigo Samaniego Maigua (INIAP) Msc. Ana María Hidalgo Almeida (UCE) DMQ, Marzo, 2017

2 José Luis Yépez Rivadeneira (2017). Caracterización del Contenido de Polifenoles: Catequina, Epicatequina, y Procianidinas B 1, B 2 Y C 1 ; en Cacao CCN-51 de las Principales Zonas Productoras Del Ecuador. Trabajo de investigación para optar por el Grado de Químico de Alimentos. Carrera de Química de Alimentos. Quito: UCE. 109 pág.

3 Der Mangel an mathematischer Bildung gibt sich durch nichts so auffallend zu erkennen wie durch maßlose Schärfe im

4 DEDICATORIA Este trabajo está dedicado a mi buen amigo y mentor Klaus Ludger Amen, un divulgador de las Ciencias Químicas, quien comparte sus conocimientos en forma de experiencias con el trabajo en el laboratorio.

5 AGRADECIMIENTOS Mi acercamiento a las ciencias Químicas ha sido un camino lleno de agradables e interesantes sorpresas, llegando a ser activamente participe en el enfoque con la que visualizo el mundo. Su derivación aplicada a los alimentos, enorgullece y advierte la enorme responsabilidad que se viene con esta importante sección Alimentaria. Por eso, quiero centrar mis agradecimientos en las personas que hicieron posible este trabajo de investigación, empezando con los integrantes de mi peculiar familia, a mis padres Mesías Yépez y Gladis Lucia Rivadeneira, quienes me brindaron su sacrificio expresado en unidades de apoyo total e incondicional, a mis hermanos, Andrés, Roberto y Ximena con quienes completamos el núcleo familiar. Agradezco de manera especial a la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP, a su gente con quienes contribuimos para realizar este proyecto: Iván Samaniego, Beatriz Brito, Eder Ocaña, Bladimir Ortiz, Carmen Rosales, Rocío Suntaxi, y Soraya Carvajal. Agradezco a la Universidad Central del Ecuador, quien es mi alma mater, a la Facultad de Ciencias Químicas, a la Carrera de Química de Alimentos, a los docentes Ana María Hidalgo, Iván Tapia y Trosky Yánez, quieres son responsables en la formación académica y colaboradores en este trabajo. En este largo arduo camino se presentaron personas como punto de apoyo, que supieron impulsarme hacia la meta universitaria, presentes hasta este trabajo y significativas en mi vida: María Alejandra Gómez y María Judith Suárez. Doy una mención especial a todos mis compañeros de aulas: Germanía Guañuna, Nelly Guzñay, Gabriela Pilco, Ana Pilaquinga, Estefanía Clavijo, Gina Flores, Ingrid Toscano, Jéssica Acosta, Jenny Robalino, Stefy Ruiz, Anaís Yépez, Tania Través, Katherine Andrade. Jeferson Coba, Jhon Sucuy, Cristian García, Richy Lozano, Paúl Ezparza, por acompañarme a la par en este camino siguiendo la misma ruta o una paralela, dándonos fuerzas de apoyo.

6 CESIÓN DE DERECHOS DE AUTOR Yo, José Luis Yépez Rivadeneira en calidad de autor del trabajo de investigación: CARACTERIZACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES: CATEQUINA, EPICATEQUINA Y PROCIANIDINAS B 1, B 2 Y C 1 ; EN CACAO CCN-51 DE LAS PRINCIPALES ZONAS PRODUCTORAS DEL ECUADOR, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior. Firma José Luis Yépez Rivadeneira CI:

7 APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN Yo, Ana María Hidalgo Almeida, en calidad de tutora del trabajo de titulación CARACTERIZACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES: CATEQUINA, EPICATEQUINA Y PROCIANIDINAS B 1, B 2 Y C 1 ; EN CACAO CCN-51 DE LAS PRINCIPALES ZONAS PRODUCTORAS DEL ECUADOR, elaborado por el estudiante José Luis Yépez Rivadeneira, estudiantes de la Carrera de Química de Alimentos, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.. En la ciudad de Quito a los 21 días del mes de febrero del año Firma Ana María Hidalgo Almeida Cd. N

8 APROBACIÓN DEL INFORME FINAL/TRIBUNAL TÍTULO DEL TRABAJO DE TITULACIÓN El Tribunal constituido por: MSc.Ana María Hidalgo, MSc. Iván Tapia, Dr. Trosky Yánez, luego de Calificar el Informe Final de Investigación del trabajo de titulación denominado CARACTERIZACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES: CATEQUINA, EPICATEQUINA Y PROCIANIDINAS B 1, B 2 Y C 1 ; EN CACAO CCN-51 DE LAS PRINCIPALES ZONAS PRODUCTORAS DEL ECUADOR previo a la obtención del título de QUÍMICO DE ALIMENTOS presentado por el señor José Luis Yépez Rivadeneira ARPUEBA el trabajo presentado. Para constancia de lo actuado firman: FIRMA Ana María Hidalgo Almeida CI: FIRMA Trosky Germán Yánez Darquea CI: FIRMA Luis Iván Tapia Calvopiña CI:

9 LUGAR DE REALIZACIÓN La caracterización del contenido de polifenoles en cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del Ecuador, se realizará en el laboratorio de Servicios de Análisis e Investigación en Alimentos (LSAIA) del Departamento de Nutrición y Calidad de la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP.

10 TABLA DE CONTENIDO Introducción El problema Planteamiento del problema Formulación del problema Preguntas directrices Objetivos Objetivo general Objetivos específicos Justificación e importancia Marco teórico Antecedentes de la investigación Fundamento teórico Historia del origen del Cacao Zonas de cultivo de cacao de mayor producción en el Ecuador Composición química del cacao Botánica del cacao Variedades de cacao de mayor importancia Mejoramiento de la calidad de las almendras de cacao por tratamiento postcosecha Los Polifenoles en el cacao Antocianinas Procianidinas Evolución de los polifenoles durante la fermentación Hipótesis: Hipótesis nula (H o ): Hipótesis de trabajo (H 1 ): SISTEMA DE VARIABLES Variable Independiente: Variable Dependiente: Metodología de investigación Diseño de la investigación Enfoque Nivel de investigación

11 3.1.3 Tipo de la investigación Población y muestra Población Muestra Materiales y métodos Materiales y reactivos Metodología Matríz de operacionalización de las variables ETAPA I: Adaptación del método analítico para determinar el contenido de polifenoles individuales en cacao ETAPA II. Caracterización del contenido de polifenoles del cacao CCN-51 de las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos ETAPA III: Evaluación correlacional multivariado de las muestras de cacao CCN Análisis y discusión de resultados ETAPA I. Adaptación del método analítico para determinar el contenido de polifenoles en cacao Estudio de la linealidad Límite de detección y límite de cuantificación Precisión Recuperabilidad ETAPA II. Caracterización del contenido de polifenoles en cacao CCN-51 de las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos Análisis de catequina Análisis de epicatequina Análisis de procianidinas B Análisis de procianidinas B Análisis de procianidinas C ETAPA III: Evaluación correlacional multivariado de las muestras de cacao CCN Análisis de componentes principales (ACP) Conclusiones y recomendaciones Conclusiones Recomendaciones: BIBLIOGRAFÍA... 78

12 ANEXOS... 80

13 LISTA DE TABLAS Tabla 1 Descripción botánica del cacao en estudio CCN Tabla 2 Requerimientos agroclimáticos para el cultivo de cacao CCN Tabla 3 Composición química de los granos de cacao fermentable Tabla 4 Matriz de operacionalización de las variables Tabla 5 Evaluación de la linealidad del método analítico Tabla 6 Evaluación de la precisión de la metodología analítica Tabla 7 Evaluación de la recuperabilidad del método Tabla 8 Contenido promedio de polifenol (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Tabla 9 Factores en estudio para la caracterización de cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del país Tabla 10 Tratamientos para cada una de las provincias productoras de cacao CCN Tabla 11 Esquema del análisis de varianza (ANOVA al 95% de confianza) combinado entre las provincias productoras de cacao CCN-51: Los Ríos, Guayas y Manabí Tabla 12 Análisis de varianza del contenido de polifenol en cacao CCN-51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Tabla 13 Tiempo de retención promedio para cada estándar Tabla 14 Preparación de los niveles de concentración de las soluciones estandar para elaborar las curvas de calibración Tabla 15 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de catequina Tabla 16 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de catequina Tabla 17 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de epicatequina Tabla 18 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de epicatequina Tabla 19 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de procianidina B Tabla 20 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de procanidina B Tabla 21 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de procianidina B Tabla 22 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de procianidina B Tabla 23 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de procianidina C

14 Tabla 24 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de procianidina C Tabla 25 Resultados del Límite de Detección y Cuantificación Tabla 26 Resultados de concentración de polifenoles para análisis de precisión del método Tabla 27 Cálculo del coeficiente de variacion (C. V.) de cada estándar de polifenol Tabla 28 Recuperabilidad del método en función del porcentaje de extracción Tabla 29. Contenido promedio de catequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Tabla 30. Análisis de varianza del contenido de catequina en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Tabla 31 Representación de la prueba de significancia de Tukey para catequina Tabla 32. Contenido promedio de epicatequina (mg/g) en cacao CCN-51 proveniente de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Tabla 33 Análisis de varianza del contenido de epicatequina en cacao CCN-51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Tabla 34 Representación de la prueba de significancia de Tukey para epicatequina Tabla 35 Contenido promedio de procianidina B 1 (mg/g) en cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Tabla 36 Análisis de varianza del contenido de procianidina B1 en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Tabla 37 Representación de la prueba de significancia de Tukey para procianidinas B Tabla 38 Contenido promedio de procianidina B 2 (mg/g) en cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Tabla 39 Análisis de varianza del contenido de procianidina B 2 en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Tabla 40 Representación de la prueba de significancia de Tukey para procianidinas B Tabla 41 Contenido promedio de procianidina C 1 (mg/g) en cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Tabla 42. Análisis de varianza del contenido de procianidina C1 en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Tabla 43 Representación de la prueba de significancia de Tukey para procianidina C

15 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Representación gráfica de la ecuación de Hortwiz Gráfico 2 Curva de calibración global de catequina Gráfico 3 Curva de calibración global de epicatequina Gráfico 4 Curva de calibración global de procianidina B Gráfico 5 Curva de calibración global de procianidina B Gráfico 6 Curva de calibración global de procianidina C

16 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Zonas geográficas de cultivo de cacao en el Ecuador... 7 Figura 2 Estructura de los principales Flavonoides presentes en el cacao Figura. 3 Principales antocianinas en las almendras de cacao Figura 4 Principales procianidinas del cacao Figura 5 Evolución de los polifenoles totales durante la fermentación Figura 6 Evolución de las procianidinas durante la fermentación Figura 7 Cromatograma de la mezcla de los estandares puros de polifenoles flavan-3-ol. 37 Figura 8 Evaluación gráfica de la precisión del método para el análisis de los polifenoles en muestra de cacao CCN Figura 9 Evaluación del nivel de extracción de cada componente durante cada ciclo Figura 10 Cromatgrama típico de una muestra de cacao CCN Figura 11 Contenido promedio de catequina (mg epicatequina/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón Figura 12 Contenido promedio de catequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia Figura 13 Histograma de frecuencia para el contenido de catequina (mg /g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Figura 14 Contenido promedio de epicatequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón Figura 15 Contenido promedio de epicatequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia Figura 16 Histograma de frecuencia para el contenido de epicatequina (mg /g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Figura 17 Contenido promedio de procianidina B 1 (mg/g) en cacao CCN-51 agrupadas por cantón Figura 18 Contenido promedio de procianidina B 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia Figura 19 Histograma de frecuencia para el contenido de procianidina B 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Figura 20 Contenido promedio de procianidina B 2 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón Figura 21 Contenido promedio de procianidina B 2 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia Figura 22 Histograma de frecuencia para el contenido de procianidina B 2 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Figura 23 Contenido promedio de procianidina C 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón Figura 24 Contenido promedio de procianidina C 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia

17 Figura 25 Histograma de frecuencia para el contenido de procianidina C 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Figura 26 Distribución en el plano factorial de las variables del perfil de polifenoles en cacao CCN 51 de tres provincias productoras de la región Litoral Ecuatoriana Figura 27 Proyección en el plano factorial 1x2 de todos los individuos analizados en relación a el contenido de polifenoles

18 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS CARACTERIZACIÓN DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES: CATEQUINA, EPICATEQUINA Y PROCIANIDINAS B 1, B 2 Y C 1 ; EN CACAO CCN-51 DE LAS PRINCIPALES ZONAS PRODUCTORAS DEL ECUADOR. Autor: José Luis Yépez Rivadeneira Tutor: Iván Rodrigo Samaniego Maigua Tutora: Ana María Hidalgo Almeida Marzo 2017 RESUMEN Dentro del presente trabajo de investigación se caracterizó el contenido del perfil de polifenoles en cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del Ecuador (Los Ríos, Guayas y Manabí), con la finalidad de establecer los niveles de concentración de estos metabolitos secundarios en el cacao por zona de producción, y evaluar si estos varían en función del ambiente. La cuantificación e identificación de los polifenoles se realizará utilizando Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC) acoplado a detector de arreglo de Diodos (DAD) a 280 ɳm. La evaluación del efecto del ambiente sobre los contenidos de polifenoles en el cacao CCN-51 se realizó por comparación entre las zonas de producción mediante un análisis de varianza y un análisis de componentes principales para establecer la correlación entre las variables. Las muestras de cacao CCN-51de la provincia de Guayas presentaron la mayor concentración de procianidina B1 (0,88 mg/g), procianidina B2 (6,42 mg/g), procianidina C1 (4,16 mg/g) y epicatequina (13,58 mg/g), mientras que la provincia de Los Ríos presentó mayor concentración de catequina (2,81 mg/g). Se demostró que existe un efecto del ambiente por zona de producción en la concentración de los polifenoles en cacao CCN-51 en las provincias de estudio (Los Ríos, Manabí y Guayas). TÉRMINOS DESCRIPTORES: Cacao, polifenoles, extracción, actividad antioxidante.

19

20 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS CHARACTERIZATION OF POLYPHENOLS CONTENT: CATECHIN, EPICATECHIN AND PROCYANIDINS B 1, B 2 Y C 1 ; IN CACAO CCN-51 FOR THE MAIN PRODUCTIVE AREAS OF ECUADOR. ABSTRACT Author: José Luis Yépez Rivadeneira Tutors: Iván Rodrigo Samaniego Maigua Ana María Hidalgo Almeida Date: March 2017 Along the current investigation, content of polyphenols profile in cacao CCN-51 was characterized for the main productive areas of Ecuador (Los Ríos, Guayas and Manabí), in order to establish extent of concentration of secondary metabolites of cacao per productive area, and find out if they vary in line with the environment. Quantification and identification of polyphenols was conducted by using High Resolution Liquid Chromatography (HRLC) with the Diode Arrangement Detector (DAD) adjusted at 280 ɳm. The evaluation of the effect of environment on phenols content on cacao CCN-51 was conducted by comparing diverse productive areas, through an analysis of variance and main components, intended to establish correlation among variables. Samples of cacao CCN-51from Guayas province showed the highest concentration B1 (0.88 mg/g), procyanidin B2 (6.42 mg/g), procianidin C1 (4.16 mg/g) and epicatechin (13.58 mg/g), while Los Ríos province showed the highest concentration of catechin (2.81 mg/g). The existence of an environment effect was demonstrated per production area on the concentration of polyphenols for cacao CCN-51 in the surveyed provinces (Los Ríos, Manabí y Guayas). DESCRIPTORS: CACAO, POLYPHENOLS, EXTRACTION, ANTI-OXIDATIVE ACTIVITY.

21 Introducción El cacao ecuatoriano es altamente reconocido a nivel mundial por las propiedades organolépticas de sus granos, motivo por el cual es muy atractivo para la industria agroalimentaria, farmacéutica o cosmética. Una de las características del cacao es su aroma inimitable, porque cumple los requerimientos más exigentes del mercado mundial del chocolate para la fabricación de productos de calidad superior, siendo destacable sus notas aromáticas particulares. El sabor y aroma del cacao depende principalmente de la variedad genética, el tratamiento poscosecha (fermentación y secado) y del tostado, procesos en los cuales se producen importantes transformaciones físicas como la restructuración celular, y químicas como la degradación de proteínas, oxidación de polifenoles y generación de precursores de aroma. En efecto, los polifenoles influyen sobre la calidad final del chocolate, siendo los responsables de las notas amargas y astringentes de los mismos, así como limitan las reacciones de Maillard cuando están presentes en grandes cantidades debido a su poder antioxidante. Esta característica, hace que el cacao y sus productos derivados llamen la atención de los productores, industriales, investigadores y consumidores, debido a que se ha comprobado sus efectos benéficos en la salud de sus consumidores, tales como la disminución del riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer. Los métodos habituales para el análisis de polifenoles en cacao hacen uso de extracciones con solventes polares (metanol, etanol, acetona y agua) de muestras desengrasadas, su identificación y cuantificación se realiza principalmente por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). En este trabajo se pretende realizar la caracterización de los polifenoles del cacao CCN-51 procedente de las principales zonas productoras del Ecuador mediante métodos de análisis cromatográficos, con la finalidad de conocer las concentraciones de estos metabolitos secundarios por zona de producción, como herramienta distintiva que permita la búsqueda de mercados específicos del cacao ecuatoriano como materias primas para la elaboración de productos alimenticios de elevada calidad sensorial o en las industrias farmacéuticas como producto base para la extracción y recuperación de los antioxidantes. 1

22 CAPÍTULO I 1. El problema 1.1 Planteamiento del problema En el mercado mundial durante las últimas décadas existe una mayor concientización sobre el consumo de alimentos saludables, por lo cual, ha llevado a la población a cambiar sus hábitos alimenticios adquiriendo cada vez más productos libres de azúcar, bajos en grasa y bajos en calorías. Este comportamiento se ha demostrado con gran fuerza en el consumo de chocolates, puesto que este producto ha sido tradicionalmente conocido como una golosina, pero actualmente existen muchos esfuerzos de parte de los diferentes actores de la cadena de producción del cacao, enfocándose en demostrar los beneficios en la salud que tienen los chocolates, especialmente los de mayor porcentaje de cacao (>60%). Es ampliamente sabido que el cacao constituye una fuente importante de compuestos polifenólicos como los flavonoides o antocianinas, dependiendo de su zona de origen y el procesamiento post-cosecha de los granos (fermentación, secado, tostado, alcalinización y conchado). En relación de la mayor parte de las frutas, el cacao presenta un mayor contenido flavonoides del tipo flavanoles, siendo las más importantes la catequina y epicatequina o agrupaciones poliméricas de estos llamados procianidinas (B 1, B 2, B 3, C 1, etc.). Los factores ecológicos y ambientales están íntimamente ligados con los procesos fisiológicos de las plantas, afectando directamente en su crecimiento, desarrollo y producción de metabolitos nutricionales y secundarios. Fuera del manejo agronómico humano, los factores que afectan sobre las plantas de cacao son principalmente la lluvia, temperatura, horas de luz, humedad relativa y el viento, así mismo tiene gran importancia los factores edáficos, las características físicas y químicas del suelo, y la variedad y calidad de las semillas utilizadas en la siembra. (Dubón, 2015) Debido a la variabilidad climática del Ecuador, existen cultivos de cacao en todas las provincias de este país, siendo las regiones Costa y Amazonía las de mayor producción. Actualmente las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos agrupan alrededor del 77% de los cultivos de cacao a nivel nacional, entre ellas la variedad más cultivada es el complejo nacional-trinitario seguida por la variedad clon CCN-51. Sin embargo, en el mercado mundial no existe diferencia en el precio del cacao ecuatoriano (USD 2072 por tonelada métrica en febrero del 2017) en relación de las variedades genéticas, dando como resultado que los productores prefieran regenerar sus cultivos por las variedades CCN-51 o súper árbol, ya que presentan mayor resistencia a enfermedades y plagas, y generan mayor volumen de producción en relación con el cacao fino y de aroma. 2

23 Por eso, es importante la generación de información como herramientas que permitan la búsqueda de mercados específicos de las variedades de cacao ecuatoriano, ofertándolas como materias primas para la elaboración de productos alimenticios de elevada calidad sensorial o en las industrias farmacéuticas como producto base para la extracción y recuperación de los antioxidantes, por lo cual la identificación y cuantificación de los compuestos polifenólicos y su relación con la capacidad antioxidante, permite valorizar al cacao CCN Formulación del problema La identificación y cuantificación del perfil de polifenoles en cacao CCN-51 permite valorizar a este tipo de cacao y ubicar las zonas de producción que presenten atributos de calidad nutracéuticas al comparar las concentraciones de estos metabolitos secundarios de las poblaciones de mayor producción en el Ecuador permitiendo acceder a nuevos mercados Preguntas directrices. Qué polifenoles en cacao se van identificar por HPLC-DAD en este trabajo? Cuáles son las principales zonas de producción de cacao CCN-51? Cuál es la concentración de polifenoles de las muestras de cacao CCN-51? Existe efecto del medio ambiente sobre los contenidos de polifenoles? Cuál es la provincia que presenta la mayor concentración de estos metabolitos secundarios? 1.3 Objetivos Objetivo general. Caracterizar el contenido de polifenoles (flavan-3-ol) en cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del litoral ecuatoriano utilizando HPLC acoplada a un detector DAD Objetivos específicos. a) Adaptar el método de análisis para polifenoles en cacao, utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) acoplada a detector de arreglo de diodos (DAD). b) Identificar y cuantificar los polifenoles tipo flavan-3-ol (catequina, epicatequina y procianidinas B 1, B 2 y C 1 ) en el cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del Ecuador. c) Correlacionar los contenidos de polifenoles en cacao CCN-51 con las zonas de origen de las muestras. 3

24 1.3 Justificación e importancia En los últimos años, los polifenoles del cacao han ganado un interés considerable debido a su capacidad antioxidante y su intervención en las reacciones de formación de precursores de aroma. Se ha demostrado que este tipo de metabolitos secundarios, al tener en su estructura anillos aromáticos con sustituyentes hidroxilos, tienen la capacidad de actuar como donadores de electrones o hidrógenos, o captadores de radicales libres disminuyendo así el riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares (ECV) y algunos tipos de cáncer. Cabe recalcar que las enfermedades isquémicas del corazón y las enfermedades cardiovasculares representan respectivamente la primera y tercera causa de muerte en el Ecuador. (INEC, 2014) Los polifenoles son responsables de algunas propiedades organolépticas del cacao como por ejemplo el color rojo a violeta intenso y el sabor amargo o astringente, durante el proceso de fermentación su concentración disminuye debido a reacciones de condensación, polimerización o acomplejamiento, que conllevan a la formación de compuestos poliméricos de alto peso molecular de tipo taninos insolubles, disminuyendo la presencia de notas amargas o astringentes y otorgándole a las almendras el color marrón típico del chocolate. Dentro de este contexto esta investigación tiene como finalidad la generación de bases de datos del contenido de polifenoles para uso de productores y exportadores, así como contribuir a identificar zonas de producción donde se ubiquen materiales de cacao con características relevantes en función de las concentraciones de estos compuestos químicos, de igual manera evaluar si existe efecto del ambiente sobre el contenido de estas biomoléculas. 4

25 CAPÍTULO II 2. Marco teórico 2.1 Antecedentes de la investigación El cacao es extraordinariamente rico en polifenoles, estos compuestos son almacenados en las células pigmentarias del cotiledón y según la cantidad de antocianinas presentes en estas células, los granos de cacao adoptan tonalidades de color desde blanco a violeta. Durante la fermentación, los polifenoles disminuyen su concentración por efectos de difusión en los lixiviados de la fermentación, por oxidación y polimerización de los compuestos fenólicos con las proteínas. Este fenómeno es de gran importancia puesto que los polifenoles son los responsables del gusto astringente y amargo, influyendo directamente sobre la calidad final del grano que es usado fundamentalmente para la elaboración de chocolates. (Samaniego, 2012) Los polifenoles están presentes en una cantidad significativa en los granos de cacao (hasta el 20% en masa) y en los chocolates (48 a 137 mg/g de chocolate negro). En el cacao los flavan-3- ols son los polifenoles mayoritarios (37%), siendo la epicatequina el polifenol más abundante con un 35% del total de los polifenoles del cacao, de igual manera en las almendras de cacao existe polifenoles oligomeros; que son polímeros formados por la unión de varios monómeros de (+) - catequina y (-)-epicatequina. Juntos representan el 58% de los polifenoles del cacao, en los chocolates las procianidinas son generalmente formadas por monómeros de epicatequina. (Wollgast & Anklam, 2000). Los polifenoles contribuyen activamente en la calidad del grano de cacao y del chocolate, en efecto son los responsables de la astringencia del chocolate, el pardeamiento enzimático que contribuyen al desarrollo del color y el aroma del chocolate, siendo su caracterización y cuantificación una herramienta muy útil para establecer la calidad de los mismos. (Kye, 2005) Numerosos autores se han interesado por la investigación de los polifenoles de los granos y del chocolate, netamente en razón de su efecto benéfico para la salud y desde 1984 se ha demostrado que existe diferencias en el contenido de epicatequinas en las almendras de cacao fermentado o no, en función del origen geográfico, las cuales son atribuidas a los diferentes niveles de fermentación de los granos, además se ha demostrado que la capacidad antioxidante ligada a la presencia de polifenoles varía en función del origen geográfico de los granos.(kim and Kenney, 1984) (Otham, 2007). 2.2 Fundamento teórico Historia del origen del Cacao Existen varias teorías que involucran a distintas civilizaciones o distintos lugares donde se inició el cultivo del cacao, pero se ha encontrado varias especies a lo largo de varias expediciones de los colonos españoles por las cuencas del río Amazonas de América del Sur, mismas que han 5

26 sido utilizadas en la región desde hace más de años. Desde allí, las semillas y el uso de cacao se fueron difundiendo y evolucionando en grupos de cacao con características fenotípicas y genotípicas bien definidas. Algunos estudios realizados por varios autores consideran que la domesticación, cultivo y consumo de cacao se inició entre los pobladores de Mesoamérica entre lo que hoy es Honduras, Guatemala y México desde en tiempos precolombinos, cerca de los años D. C., por las culturas toltecas, mayas y aztecas, quienes le dieron diversos usos y aplicaciones, convirtiéndolo un bien preciado que tenía gran importancia e impacto en el ámbito social, político, religioso, medicinal y económico. Así lo registraron los cronistas europeos, y un fiel ejemplo de ello, fueron los banquetes organizados por Moctezuma II en honor de Hernán Cortés. Inconveniente, no fue hasta mediados de la década de 1550 D. C. que este producto se introdujo en la corte española, sin embargo, debido a su sabor amargo característico, tardó casi un siglo para que los europeos lo incorporan en su dieta como un producto en mezcla con azúcar, denominado chocolate. Como resultado de la aceptación del chocolate en Europa, el negocio del cacao fue rentable desde mediados del siglo XVI, lo que potenció su cultivo a lo largo de las zonas tropicales de América del Sur, Central y del Caribe. Así, en el Ecuador varios latifundistas guayaquileños implementaron el cultivo de cacao en grandes extensiones de la costa ecuatoriana sobre la cuenca del rio Guayas y sus afluentes, conocidos como Grandes Cacao. En 1789, el país obtiene la facultad de exportar cacao desde Guayaquil, ya que anteriormente existían cultivados ilegales debido a bloqueos comerciales por parte de las Cédulas Reales, desde entonces las zonas de cultivo se expidieron en áreas aledañas del río Guayas, como son el Río Daule y Babahoyo, denominado como de Arriba. Este cacao desde ese entonces, tuvo gran interés por su calidad diferencial y aroma floral típico, proveniente de la variedad autóctona que hoy llamamos Aroma Nacional o Sabor Arriba nombrado a causa de la ubicación. Como respuesta a la aparición y propagación de las enfermedades Monilla y Escoba de Bruja sobre los cultivos de cacao en el Ecuador en los primeros años del siglo XX, se introdujo en el país una variedad de semillas hibridas entre el Criollo y Forastero conocida como Cacao Trinitario, por presentar mayor resistencia ante estas plagas. Hoy en día, la mayor parte de los cultivos de cacao en el Ecuador corresponden a una mezcla de las variedades Nacional y Trinitario, atribuyendo que esta variedad (complejo Nacional Trinitario) presenta mayor resistencia a esas enfermedades. No obstante, el sabor de Arriba permanece latente debido a las condiciones agrícolas y climáticas del Ecuador para el desarrollo cultivos de alta calidad. Como consecuencia de la suma de varios estímulos gubernamentales, investigaciones agropecuarias y el compromiso de los productores de cacao, el Ecuador presenta un crecimiento anual en la producción y exportación de los granos de cacao, así para el año 2015 se ubicó dentro de los cinco mayores productores de cacao en volumen, alcanzando un promedio anual de 260 mil toneladas métricas (TM) al finalizar el año de 2015, contribuyendo al 4,6% del mercado 6

27 mundial. A pesar que durante las últimas décadas el cacao ecuatoriano ha perdido reconocimiento de alta calidad en el mercado, la producción y exportaciones tienen un crecimiento de 10% en relación al 2014, por lo que constituyen productos agrícolas importantes para la exportación, así las exportaciones de cacao entre enero y noviembre del 2011, llegaron a TM en grano y TM en semi-elaborados, que juntas representaron 494 millones de dólares de divisas para el país (ANECACAO, 2016). El Ecuador es el líder mundial en la producción y exportación de cacao fino de aroma aportando con el 61%, este cacao posee una calidad única en el mundo, debido a sus características aromáticas particulares (con aromas florales muy perceptivas) y es conocido como el cacao de arriba. Actualmente hay pocas plantaciones de cacao nacional puro, porque predominan las variedades a consecuencia de cruzamientos naturales entre el nacional y el trinitario denominado como complejo nacional-trinitario, este cacao es muy atractivo para la industria chocolatera. (Rodríguez, 2010), (Ramírez, 2010) Zonas de cultivo de cacao de mayor producción en el Ecuador. Las zonas de cultivo de cacao de la región costa ecuatoriana, comprende desde el oeste de la Cordilla de Los Andes, hasta el Océano Pacífico a lo largo de toda su extensión como se muestra en la figura 1, siendo las zonas de mayor producción las provincias de Guayas, Los Ríos y Manabí. Figura 1 Zonas geográficas de cultivo de cacao en el Ecuador Fuente: (Lica, 2008) 7

28 Estas extensiones dedicadas al cultivo de cacao existen desde la época de La Colonia cuando se crearon, desde entonces las superficies dedicadas a su producción se expandieron principalmente en 4 zonas ecológicas: 1) La zona de Arriba que comprende la zona de la cuenca baja del río Guayas, básicamente las actuales provincias de Los Ríos y Guayas; se lo llamó el cacao de Arriba, debido a que venía de río arriba; 2) La zona de Manabí, con el cacao llamado de Bahía, que corresponde a la zona húmeda de la provincia de Manabí; 3) La zona de Naranjal, hacia el sur, que comprende una pequeña parte de la provincia del Guayas y la provincia de El Oro; 4) La zona de Esmeraldas, que tenía un cacao acriollado muy especial, al que se le denominaba esmeraldas (Enríquez, 2004). Actualmente las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos agrupan por si solas más del 77% de la superficie cacaotera plantada a nivel nacional. En el Ecuador la producción de cacao en grano en la provincia del Guayas representa el 57% de toneladas métricas cosechadas, siguiéndole Los Ríos con el 17% y Manabí con el 9.4% aproximadamente (CORPEI, 2008). Del total de cacao cultivado en el país el 50% son pequeños productores con superficies menores a 10 hectáreas de cacao (Lica, 2008). La variedad CCN-51 es el resultado de actividades científicas que han generado materiales que se adapten a las condiciones de las diferentes áreas de producción del país, pero dentro de las mismas también existe el caso de variedades (ICS-95, EET-95, La Gloria) de las que se conoce muy poco sobre su origen y no han sido probadas por métodos científicos y se comercializa. Es destacable que esta variedad a corto plazo cumple las exigencias de productores en rendimiento y resistencia a adversidades; sin embargo, se ha visto que estos cultivos presentan una gama de problemas al pasar los años, como es el caso de la pérdida de la resistencia a enfermedades que se creían superadas, información que surge del diario vivir del mediano y pequeño productor (iica, 2011) Como se ha mencionado antes, la producción cacaotera ecuatoriana tiene un crecimiento anual de aproximadamente del 10%, el cual no suple los requerimientos de algunos mercados de la región; y a su vez tanto los cultivares que actualmente se encuentran en el territorio ecuatoriano como los nuevos cultivos que se implementan no cuentan con un control adecuado por parte del ente estatal, el cual debería ser el encargado de zonificar la producción cacaotera, regir la introducción de materiales genéticos y generar vías de apoyo al sector, protegiendo al productor y conservando los mercados internacionales, generando así nuevas puertas para los inversionistas extranjeros. Es por este motivo que con el incremento de producción anual que presenta Ecuador, la demanda mundial y sus exigencias de calidad, y la realidad actual cacaotera; el país se encuentra en un estado de riesgo productivo y competitivo a nivel mundial, lo que amerita una reforma general 8

29 del proceso productivo, la cual debería enfocarse al manejo del cultivo, post-cosecha y comercialización del cacao; tomando muy en cuenta las dos últimas ya que son los procesos que mayor cantidad de pérdidas causan al momento, al pequeño y mediano productor Composición química del cacao. La composición química de los granos de cacao depende de múltiples factores como el tipo de cacao, origen geográfico, grado de madurez, calidad de la fermentación y secado. Después del proceso de beneficio, las almendras de cacao contienen esencialmente manteca de cacao (48-57%), compuestos fenólicos (8-20 %), proteínas (9%), agua (5-7%), teobromina (1,3-2,0%), cafeína (0,1-0,7%). además, aminoácidos libres (0,8%), almidón (4,5-7%), pectinas (4,1%), celulosa (9%), ácidos orgánicos (0,05-0,5 % por cada ácido), minerales (2,6 a 4,2%), azúcares: glucosa (0,1%), fructosa (0,4-0,6%) (Álvarez, 2008), (Amores, 2009). Cabe mencionar que las almendras de cacao fermentadas contienen fundamentalmente manteca de cacao, compuestos fenólicos y proteínas Botánica del cacao Se ha designado el nombre científico Theobroma cacao al árbol cacaotero, por el científico naturalista sueco Carl Linnaeus debido a que los pueblos aztecas creían que el árbol del cacao era de origen divino y que su bebida (xoaxactl) confería discreción y sabiduría, por lo que le denominó el alimento de los Dioses o Theobroma en el vocablo griego. El cacao es una especie altamente alógama (tiene mecanismos de fecundación cruzadas), contiene 20 cromosomas. Las características del árbol de cacao dependen de las expresiones fenotípicas de las diferentes variedades, pudiéndose decir que, en general es un árbol de hoja perenne que alcanza una altura entre 6 y 12 m, cuyos frutos miden entre 15 a 30 cm de longitud y en su interior encuentran entre 25 a 75 semillas con cotiledones de colores variables, debido a es un carácter genético que se asocia al tipo de cacao (Jiyoung, 2011); (Enríquez, 2004); (Alvares, 2008). En la tabla 1 se describe la nomenclatura científica: Tabla 1 Descripción botánica del cacao en estudio CCN-51. Reino Plantae Subreino Tracheobionta División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Dilleniidae Orden Malvales Familia Malvaceae Subfamilia Byttnerioideae Tribu Theobromeae Género Theobroma Especie T. cacao 9

30 Variedades CCN-51 Fuente: (Rivadeneira, 2013) Variedades de cacao de mayor importancia Las variedades de cacao que se reconocen actualmente con mayor importancia, son las del tipo Criollo, Forastero Amazónico, Trinitario y Nacional del Ecuador (denominado fino y de aroma y actualmente como cacao Ecuador) (Camino, 2013). El cacao Nacional del Ecuador (cacao Ecuador) actualmente se lo suele considerar como una cuarta variedad genética, debido a las características organolépticas propias de aroma y sabor, las cuales son significativamente diferentes de las demás variedades Cacao criollo o nativo La denominación de esta variedad de cacao como criollo o nativo fue designada por los conquistadores españoles, quizás para denotar su apoderamiento en las tierras hispanoamericanas, que originalmente fueron los cultivos de Venezuela. Esta variedad se caracteriza porque sus granos son de cascaras finas y redondas, de sabor aromático y amargo, alto contenido de manteca y aceites esénciales que le da atributos de calidad altos para fabricar chocolates finos (Cacao Silvestre Boliviano, s.f.). La descripción agronómica de esta variedad es: el árbol es bajo, poco robustos, de hojas grandes verde oscuro, sus mazorcas son de superficie rugosa, tienen forma alargada con o sin depresión en el cuello y con terminación en punta recta o curva; son verde-rojizos cuando no están maduros y amarillos con tendencia al rojo cuando maduran. (Rodrígez, 2010) (Camino & Carpio, 2013) Cacao forastero amazónico Se les llama amazónicos, porque están distribuidos en forma natural en la cuenca de ese río y sus afluentes (Suárez, 1998). Son considerados como cacao ordinario, los árboles son robustos y muy grandes, sus hojas pequeñas de color verde claro, sus mazorcas son de forma amelonada y a veces con un pequeño cuello de botella en la base, con una superficie lisa o ligeramente rugosa; inmaduras son verdes y amarillas al madurar, las almendras son pequeñas, aplanadas y de color morado (Rodríguez et al., 2010); (Enríquez, 1985) Cacao trinitario Constituyen las poblaciones híbridas de cruzamientos espontáneos de criollos y forasteros, que se formó en la Isla de Trinidad de ahí su nombre, siendo su calidad fenotípica y genotípica intermedia entre ambas variedades (Enríquez, 1985) Cacao nacional de ecuador 10

31 Fue cultivado exclusivamente en Ecuador hasta 1920, cuando llegaron las enfermedades conocidas como monilia (Moniliaroreri) en 1918 y escoba de bruja (Crinipellis perniciosa) en 1922, las cuales destruyeron las plantaciones de cacao nacional, el cruce espontáneo del cacao trinitario conocido como venezolano fue incrementando, por cuanto se suponía que era más resistente (Vera et al, 1984). Tiene sus características propias y constantes parecidas al forastero, pero muy diferentes en su sabor y aroma, actualmente hay pocas plantaciones con nacional puro; predominan las de cruzamientos naturales entre el nacional con trinitario conocido como complejo nacional - trinitario (Rodríguez et al., 2010) Cacao CCN-51 El agrónomo Homero Castro Zurita investigó desde 1952 las diversas variedades del grano cacao hasta que en 1965 obtuvo una variedad de cacao denominada CCN-51 (Colección Castro Naranjal Cultivar 51), siendo destacable al presentar mayor tolerancia a algunas enfermedades, tiene una productividad alta de hasta cuatro veces más que las variedades nativas y tras un adecuado proceso post-cosecha tiene resultados de alta calidad, sin ser considerado como fino de aroma. Esta variedad es el resultado de investigaciones independientes del cruce F 1 entre el material genético IMC-67 x ICS95 con el material O 1 (obtenida por Castro en una caminata al Valle de los Canelos), teniendo notabilidad de su siembra después que el Ecuador fue afectado por el Fenómeno del Niño en 1997 (MELO, 2011). Durante la presidencia de Alfredo Palacios, el 22 de junio del 2005, la variedad CCN-51 fue declarada como un bien de alta productividad mediante una declaratoria ministerial del Ministerio de Agricultura con la cuál fomenta el cultivo, comercialización y exportación de este cacao. Al momento el cacao CCN-51 representa el 25% de la producción nacional, y se estima que el 90% de los cultivos de cacao durante los últimos 20 años se han renovado por la variedad. Actualmente se está cultivando en distintos lugares de Centro América, pero se ha detectado que esta variedad no se adapta a las condiciones agro-climáticas (Ver tabla 2) de otros lugares del mundo. Tabla 2 Requerimientos agroclimáticos para el cultivo de cacao CCN-51. Altitud 0 a 1000 msnm Temperatura 20 a 26 C Humedad 75% Precipitación 1500 a 2500 mm/año Luminosidad 820 a 2300 h/año Suelo Franco arcilloso Profundidad efectiva 1,2 m Tolerancia a inundaciones 3 a 4 días ph 5.0 a 7.5 Fuente: (Rivadeneira, 2013) Elaborado por: José Luis Yépez Rivadeneira 11

32 2.2.6 Mejoramiento de la calidad de las almendras de cacao por tratamiento postcosecha. El proceso de mejoramiento de la calidad se debe a dos etapas: la fermentación y secado de las almendras del fruto maduro. Para garantizar la correcta fermentación, se clasifican las mazorcas durante la recolección, discriminando las enfermas y evitando recolectar aquellas que no tengan un grado de madurez adecuado. Una vez recolectadas y acopiadas las mazorcas, se procede a la extracción de los granos utilizando un machete para la apertura de la corteza y herramientas como cucharas metálicas para separar las almendras de cacao Fermentación En el proceso de la fermentación en cacao intervienen un conjunto de microorganismos produciendo transformaciones bioquímicas que conduce a la degradación de la pulpa o mucílago, provocando la muerte del embrión, de esta manera se activan en el interior de los granos una serie de reacciones bioquímicas generando como consecuencia el desarrollo de los precursores del aroma térmicos del chocolate (Álvarez, 2008). El primer paso para desencadenar el proceso de la fermentación requiere el traslado de las almendras de cacao extraídas hacia un biorreactor (fermentador), permitiendo la creación de un ambiente semi-cerrado donde se pueda controlar las condiciones óptimas de temperatura, humedad, drenaje y disponibilidad de aire (oxígeno). Debido a que se producen una serie de reacciones enzimáticas y bioquímicas en el interior del cotiledón que escarnecen a las células, producen la muerte del embrión y se producen cambios físicos en la testa (cascarilla) y en el mucílago que la recubre. Estas reacciones conducen a la transformación de los compuestos químicos presentes en otros más simples, de manera que las proteínas se transforman sus aminoácidos correspondientes, los polisacáridos en azúcares simples y los polifenoles son polimerizados formando compuestos de alto peso molecular (la mayor parte de tipo taninos insolubles); lo que ocasiona como resultado la generación de precursores del aroma típicos del chocolate, sensorialmente descritos como el resultado de la disminución del amargor y la astringencia (Samaniego, 2012) (Rodríguez et al, 2010). Otra consecuencia visible a medida que avanza la fermentación, se evidencia en el cambio progresivo de coloración hasta una tonalidad más oscura, de manera que un análisis de color, haciendo un corte en la mitad de los granos, sirve como criterio de aprobación para definir el final de este proceso. La fermentación de la masa de cacao en baba colocada en el biorreactor, se debe a la proliferación de diferentes grupos de microorganismos propios del cacao manifestados oportunamente según las variaciones de la composición química (ver Tabla 3) y las condiciones físicas del sistema, dando como resultado tres tipos de fermentación, alcohólica, láctica y acética, respectivamente. La matriz inicial de la masa de cacao rica en azucares, es óptima para que se desencadene primero la fermentación alcohólica producida por las levaduras Saccharomyces cerevisiae, 12

33 Candida krusei, Kloeckera apiculata. Esta microflora es la responsable de la formación de numerosos compuestos volátiles (Álvarez, 2008) entre las 24 a 36 horas después de iniciado el proceso, transformando los azúcares de la pulpa en alcohol etílico y dióxido de carbono, consumiendo el ácido cítrico de manera que el ph aumenta a 4,5 al mismo tiempo que la temperatura se incrementa medianamente. Posteriormente, los cambios de la matriz de cacao en su ph y en la estructura de la pulpa, permite aireación leve que favorece la fermentación láctica por el establecimiento de las bacterias Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, transformando los azucares en ácido láctico. Después de la primera remoción de lixiviados, la presencia de oxígeno en la masa de cacao favorece el establecimiento de una fermentación acética de bacterias: Acetobacter rancens, A. ascendes, A. xylinum, A. lovaniensis, A. aceti y Gluconobacter oxydans, éstas aprovechan el etanol formado por las levaduras en la primera fermentación, para producir ácido acético. Al finalizar la tercera fermentación, el ácido acético provoca una disminución del ph, que junto con el calor de la fermentación (45 C) causan la muerte de las almendras durante el segundo día de fermentación. La muerte de las almendras está acompañada de un aumento en la permeabilidad de las paredes celulares, lo cual permite la interdifusión de los componentes del jugo celular, de esa forma las enzimas se ponen en contacto con los polifenoles y las proteínas (Álvarez, 2008); (Camino & Carpio, 2013) Tabla 3 Composición química de los granos de cacao fermentable. COMPONENTES CANTIDAD Ácido cítrico 2% ph 2,4-4,0 Glucosa 12-15% Pectinas 5-7% Tensión de Oxígeno Baja Fuente: (Rivadeneira Mercado, 2013) Tan pronto se muere la semilla, la enzima glicosidasa se activa hidrolizando las antocianinas (3- β-d-galactosidil cianidina y la 3-α- L- arabinosidil cianidina) que son las responsables del color púrpura de las almendras, que gradualmente van perdiendo su color debido a que se descomponen azúcares y antocianidinas, éstas últimas serán oxidadas luego a compuestos quinónicos que contribuyen al color pardo característico del cacao fermentado (IICA, 1989); (Bertorelli et al., 2009). Las proteínas son hidrolizadas por dos proteasas específicas que conducen a la formación de más de 80 oligopéptidos y aminoácidos libres diferentes. La especificidad de las enzimas en estas reacciones depende del ph. Las proteínas son hidrolizadas por una endoproteasa aspártica (ph óptimo 3,5) que conduce a la formación de oligopéptidos. La hidrólisis de estos sustratos por una carboxipeptidasa (ph óptimo 5,5-5,8) conduce a la formación de oligopéptidos hidrófilos y de aminoácidos libres hidrófobos (Álvarez, 2008). 13

34 Posteriormente, las procianidinas y las proteínas o los productos de su degradación se combinan durante esta etapa. Ninguna de estas reacciones incluye oxígeno. Durante la fase de fermentación debe mantenerse una aireación que no sea muy escasa, porque impediría la multiplicación de las levaduras y bacterias acéticas, que estaría acompañada de una reducción de ácido acético y del calor generado, ni tampoco excesiva, por cuanto en este caso no solamente daría lugar al desarrollo de mohos, sino que también impediría la formación del precursor de sabor (Enríquez, 1985). A medida que el oxígeno se difunde dentro de los tejidos, la oxidasa se activa y las condiciones aeróbicas, así como los productos de oxidación de los polifenoles, progresivamente inhiben las enzimas que estaban activas durante la fase anaeróbica. Las antocianidinas y los complejos fenol-proteína que se formaron durante la fase anaeróbica sufren reacciones oxidativas (icca, 1989). Las antocianidinas son polimerizadas junto con catequinas presentes en el cacao, por la enzima polifenol oxidasa formando taninos complejos insolubles, pero esta disminución en el contenido de polifenoles no es debido solo a los procesos de oxidación sino también es causado por el pardeamiento y la difusión de estos componentes en los exudados de la fermentación (Wollgast, 2000) Métodos de fermentación La fermentación dura generalmente entre 3 y 6 días y puede realizarse de diferentes formas, resultado del desarrollo de tecnologías de centros de investigación o por experiencia técnicainvestigativa empírica del agricultor. Los métodos más comunes utilizados en nuestro medio son: cajas de madera, sacos de cabuya, montones, marquesinas, sacos plásticos y gavetas Rohan, todas tienen como principio crear un ambiente semi-cerrado, eliminar los líquidos de exudación de las almendras y permitir que estas alcancen hasta 45 C, para así matar al embrión e iniciar el proceso químico de transformación. Los factores que influyen sobre la cinética de esta etapa son: el tipo de cacao, tiempo de almacenamiento de las mazorcas, la apertura y desgrane, el método de fermentación (microbiota fermentadora) y frecuencia de remoción de la masa fermentable. Actualmente se ha establecido que el mejor método de fermentación es el realizado en cajas de madera y el tiempo de fermentación para cacao nacional (complejo Nacional-Trinitario) es de 4 días (Rodríguez et al, 2010). Los mejores resultados se obtienen mediante este método, los cajones son construidos de maderas blancas y sin sustancias como taninos o resinas, un buen material es el laurel (Enríquez, 2004); (Rodríguez et al., 2010). Este método consiste en colocar las almendras frescas en cajas de madera fuerte con fondo perforado para el drenaje de las exudaciones. Después de permanecer en una caja por uno o dos días, las almendras se trasladan a una segunda caja; durante esta operación, que se efectúa con palas de madera, hay escape de anhídrido carbónico y la temperatura desciende apreciablemente. La temperatura vuelve a subir pronto y prosigue la cura. Después de unos dos o tres días más, las almendras se ponen en una tercera caja y se mantiene allí hasta completar unos 6 días, generalmente no más de 8 (Enríquez, 1985). 14

35 - Fermentación en Montones Este método es el más sencillo, de menor inversión, razón por la cual es el más utilizado por los pequeños y medianos productores. Las almendras (cacao en baba) se colocan e montones sobre una superficie de caña guadua picada o de madera, que posea pendiente o un sistema de drenaje simple para protegerlas de encharcamientos de los líquidos exudados, evitando excesos de humedad que generen putrefacción de la masa. La masa en fermentación extendida en los tendales se debe cubrir con hojas de plátano para conservar la temperatura y evitar contaminación por hongos. Los montones permanecerán de 5 o 6 días y deben ser movidos constantemente de un lugar a otro para mejorar el proceso de fermentación (Benitez,2001) (Rodríguez et al., 2010). - Fermentación en tendales. En el Ecuador, este método ha sido ampliamente utilizado por los agricultores de varios sectores y épocas, consiste en colocar en montones las almendras sobre el tendal y protegerlo con hojas de plátano para así conservar la temperatura requerida para la fermentación; para distribuirlo en el tendal en el día y en la noche volver a apilarlo y protegerlo. Este proceso es útil, pero existe riesgo de que la almendra se moje con una tempestad, lo cual dañaría gravemente el producto final (Muyo, 2010). - Fermentación en Gavetas Rohan. Este procedimiento de fermentación consiste en colocar las almendras a fermentar, en gavetas de 1,20 m de largo x 0,80m de ancho x 0,10 m de alto, y pueden ser apiladas hasta un total de 12 gavetas, para 16 finalmente ser tapadas la parte superior con tela de gangocha o lonas útiles para el proceso, el piso de las gavetas deberá tener aberturas de entre 5 a 10 cm lo cual permite una aireación de las almendras, de esta forma se puede presentar una fermentación más general en las almendras sin la necesidad de mover las mismas. En algunos lugares del mundo las Gavetas Rohan son fabricadas de bambú, ya que este es el material principal de la región, los materiales de este método variaran de acuerdo al lugar en cuestión. El tiempo de fermentación dependerá del material genético a manejarse, en la variedad CCN-51 se usa un proceso de fermentación de 3 a 4 días (Muyo, 2010). - Fermentación en Sacos En este método consiste en colocar los granos frescos de cacao en sacos de plástico o parecidos, de preferencia nuevos o exclusivos para cacao y de tejido ralo para permitir el exudado de la baba, para luego proceder a colocar de 5 a 6 días estos sacos en bodegas, y así permitir el fluido normal de los líquidos de las almendras recién cosechadas. Es recomendable colocar los sacos con el producto en lugares con buena aireación y cambiar de sacos cada 2 días para mejorar el proceso de fermentación y permitir que se presente un proceso uniforme de fermentación ya que, al no mover las almendras, se presentarán almendras sin fermentar en el fondo de los sacos En la fermentación por saquillos generalmente las personas no realizan remociones de la masa motivo 15

36 por el cual el grado de fermentación no es uniforme. Además, cuando los saquillos plásticos tienen un tejido muy tupido, el cacao tiende a quedar con cierto sabor a ahogado o podrido. Por lo tanto, este es el método menos adecuado para fermentar cacao, debido al bajo porcentaje de fermentación y calidad inferior obtenida. (Pérez, 2009) Secado Al culminar el proceso de fermentación, las almendras de cacao tienen alrededor del 55% de humedad. Por el alto riesgo microbiológico que representa las almendras recién fermentadas, deben ser sometidas a un proceso de secado para eliminar el exceso de agua de su interior hasta alcanzar 7-8% de humedad (Pérez, 2009), lo que evita la putrefacción por el desarrollo de mohos que deterioren la calidad, dando como resultado facilidad en las condiciones de almacenamiento, manejo y comercialización del cacao. En la etapa de secado continúa la fase oxidativa iniciada en la fermentación terminándose algunas transformaciones químicas y físicas, contribuyendo a la generación de características organolépticas (compuestos del aroma y sabor) y se desarrollan pigmentos de color marrón a partir de los compuestos fenólicos (Rodríguez et al, 2010). Los procesos de secado se realizan de forma natural al sol o en secadores artificiales. Los métodos artificiales utilizan la energía proveniente de algunos tipos de combustibles o electricidad para generar calor y acelerar el secado. Haciendo comparación, en el uso de los secadores eléctricos el consumo de energía es menos costoso que la de los combustibles (Rodríguez, 2010). El secado de las almendras se lo realiza por medio del uso de plataformas de concreto llamadas tendales hechas de caña guadua y/o cemento como superficie de secado, donde se reparte y extiende los granos de cacao para que por medio de la radiación solar pierdan la humedad. Haciendo uso de proceso natural, es común encontrar afecciones graves a las almendras causadas por la lluvia, ataques fúngicos y robos de producto que podría afectar la calidad e incrementar las pérdidas. El secado por exposición al sol es afectado por: la textura del piso, frecuencia de remoción de los granos y condiciones climáticas. Dependiendo de la cantidad de horas de luz (exposición a la radiación solar), se procede a medir el porcentaje de humedad realizando un corte y palpando, generalmente en los 3 o 4 días siguientes (Rivadeneira Mercado, 2013). Durante el proceso de secado se pone en evidencia la aparición de nuevos compuestos de origen bioquímico (ésteres, aldehídos y cetonas) o térmico (aldehídos, pirazinas, pirroles y fenoles) y así mismo la desaparición de otros inicialmente presentes (los alcoholes y los ácidos). Los compuestos fenólicos disminuyen a partir del tercero y cuarto día. Muchos compuestos tienen importancia por ser las responsables de las características aromáticas del cacao y por ende se relacionan con la calidad sensorial del chocolate. En el caso de los aldehídos y ésteres se relacionan con el sabor afrutado y floral. El linalol pertenece a la familia de los terpenos que se asocia al sabor floral del chocolate. Este compuesto se encuentra en cantidades considerables en cacaos finos, es un compuesto clave que permite la clasificación de los cacaos en función de su origen. Como lo reporta (Portillo et al., 2009), las almendras de cacao bien fermentadas y secas 16

37 de Ecuador, Trinidad y Venezuela mostraron contener hasta 8 veces más linalol que los cacaos ordinarios de Ghana, Costa de Marfil y Brasil. - Secado en tendales. Los mismos tendales utilizados como áreas de fermentación, pueden servir para el proceso de secado. Los materiales más frecuentes de los tendales son la madera, caña o bambú, y cemento, el cual es el más usado al momento en el país por tener mayor tiempo de vida útil. Todos los nombrados cumplen con la característica de ser una superficie plana donde se pueda colocar el cacao y aprovechar la luz solar para poder reducir la humedad de las almendras. Es así como un metro cuadrado de tendal puede ser usado por 50 kg de almendras frescas con un espesor de 5 cm, de ser escasa la luz solar se puede colocar una capa de 3 cm para lo cual los 50 kg de almendras frescas ocuparan 1.5 a 1.6 metros cuadrados (Catie, 1999). - Secado en marquesinas. La tecnología y uso de marquesinas de secado ha sido un cambio radical en los procesos pos cosecha de varios países y regiones productoras de cacao, ya que esta usa la optimización de los rayos solares mediante el uso de plástico de invernadero, el mismo que almacena y evita la reducción de temperatura moderada útil para el proceso de secado de cacao. Existe una gama de diseños de marquesinas desarrollados en las áreas productoras de cacao; teniendo, así como principio la elaboración de una mesa aireada de madera, cemento, metal o mixta, útil para colocar las almendras frescas y fermentadas y, una estructura plástica que conserve la temperatura de la misma manera como lo hacen los invernaderos (Catie, 1999). El tamaño y materiales de la marquesina varían de acuerdo a la producción que la finca en cuestión tiene, como también a los materiales disponibles del sector y la economía que maneja el productor, es así como la marquesina va desde una construida con caña y plástico; hasta marquesinas en túnel con mesas de cemento y metal, y estructuras de tubo en forma de ojiva, con plástico de invernadero, siempre teniendo en cuenta que toda esta gama de marquesinas cumpla con el mismo principio. - Secado en estufas. El mayor volumen de la producción mundial proviene de países donde se seca las almendras usando la luz solar, pero en algunos países tropicales se usa secadoras de estufa, las cuales usan aire seco y caliente para pasar por la masa de cacao y así reducir su humedad antes de comercializarlas. Este método es el más práctico, rápido y controlable que existe al momento, pero también es uno de los más caros, ya que es una máquina que al momento es comercializada por algunas empresas y su fabricación no es casera; pero su precio se ve reflejado en su utilidad y beneficios que la estufa alcanza para el producto final. Existe de igual manera una gran gama de diseños de estufas. El funcionamiento de las estufas consiste en un tubo de metal por la cual se coloca una fuente de calor sea esta leña, carbón, diésel o electricidad y por esta es canalizada el 17

38 aire caliente hacia una plancha perforada donde reposaran las almendras de cacao; y en la superficie se coloca un techo para conservar la temperatura (Beckett,1994). En el país se comercializa al momento secadoras a gas, la misma que cumple con el mismo principio, y consiste en una fuente de viento como un ventilador que funciona con electricidad que proporciona el aire necesario, el cual pasa a través de una fuente de calor alimentada por gas licuado de petróleo; para así pasar hacia la cámara de secado que consta de una caja metálica con piso perforado donde se encuentran las almendras y son secadas mediante el movimiento constante del producto, estas máquinas varían en su tamaño teniendo capacidades que van desde 136 hasta 272 kilogramos, y completan el proceso de secado en aproximadamente 6 horas Los Polifenoles en el cacao Los polifenoles constituyen uno de los grupos de sustancias químicas más abundantes y ampliamente distribuidos en la naturaleza, y a la fecha se han identificado más de 8000 estructuras polifenólicas distintas (Sotero et al., 2011). Los polifenoles son productos del metabolismo secundario de las plantas, surgen biogenéticamente a partir de dos principales vías; la vía de síntesis del shikimato y la vía del acetato. En las almendras de cacao se ha identificado que la mayor cantidad de polifenoles presentes, corresponde a un grupo particular conocido como flavonoides, y específicamente un subgrupo de flavonoides llamados flavanoles (Figura 2). (Gasser et al, 2008) (Wollgast et al., 2000) En el cacao se distinguen tres grupos de polifenoles: las antocianinas (aprox. 4%), catequinas o flavan-3-oles (aprox. 37%), y procianidinas (aprox. 58%) y su contenido en almendras de cacao secas si fermentar y libres de grasa varía entre el 15-20% P/P (Pereal et al., 2009); (Wollgast et al., 2000). Los polifenoles se caracterizan por su capacidad antioxidante, sus anillos aromáticos con sustituyentes hidroxilos les brindan una estructura especialmente adecuada para ejercer una acción antioxidante al poder actuar como donadores de hidrógenos o electrones o servir como atrapadores de radicales libres. Esta característica hace que el cacao y sus productos derivados llamen la atención de los consumidores ya que se ha comprobado efectos beneficiosos en la salud, tales como la disminución del riesgo de enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer, por su capacidad de controlar reacciones claves implicadas en la oxidación de las LDL o de daños oxidativos al ADN (Buenaventura, 2002). 18

39 Figura 2 Estructura de los principales Flavonoides presentes en el cacao Fuente: (Rimbach et al., 2009) Antocianinas Son pigmentos hidrosolubles con características de glicósidos, están constituidos por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azúcar por medio de un enlace β-glicosídico, y en algunos casos por un enlace α-glicosídico, las principales antocianinas de las almendras del cacao se presentan en la Figura 3. El color de las antocianinas está distribuido en una gama de tonalidades que va desde el rojo hasta el azul dependiendo de la estructura de la molecula y el ph del medio (Ocampo et al., 2008) Procianidinas Figura. 3 Principales antocianinas en las almendras de cacao. Fuente: (Rimbach et al., 2009) Las procianidinas son en su mayoría flavan-3,4-dioles, formando dímeros, trímeros condensados u oligómeros de epicatequina como la extensión principal (Wollgast et al., 2000). Se caracterizan por ser sustancias capaces de dar combinaciones estables con las proteínas y con otros polímeros como los polisacáridos, esto afecta también a las enzimas pudiendo inhibir su actividad (López, s/f). Las estructuras químicas se especifican en la figura 4. 19

40 Figura 4 Principales procianidinas del cacao Evolución de los polifenoles durante la fermentación. Según Amores (2009) si la fermentación es bien realizada, la concentración de polifenoles totales en los granos de cacao, se reduce en un 40% o más. Las concentraciones de polifenoles disminuyen hasta el segundo día de fermentación a partir del cual se mantiene constante en cacaos nacionales, como se aprecia en la figura 4. Figura 5 Evolución de los polifenoles totales durante la fermentación Fuente: (Amores, 2006) Las procianidinas desde las formas monómeras hasta los decámeros disminuyen durante la fermentación, mostrando su mayor decrecimiento a partir del segundo día de fermentación y llegan a disminuirse en un 54% hasta el cuarto día de fermentación (Fig. 5). 20

41 Figura 6 Evolución de las procianidinas durante la fermentación. Fuente: (Wollgast et al., 2000) Las antocianinas suelen desaparecer rápidamente durante el proceso de fermentación que se evidencia por la pérdida del color púrpura, el cual disminuye en un 93% después de 4 días (Wollgast et al., 2000). 21

42 2.3 Hipótesis: Hipótesis nula (H o ): H o : No existe diferencia significativa en el contenido de polifenoles del cacao CCN-51 cultivado en las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos analizada por HPLC-DAD Hipótesis de trabajo (H 1 ): H 1 : Existe diferencia significativa en el contenido de polifenoles del cacao CCN-51 cultivado en las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos analizada por HPLC-DAD. 2.4 SISTEMA DE VARIABLES Variable Independiente: Zonas de producción de cacao CCN-51; las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos Variable Dependiente: Concentración de polifenoles: Catequina, Epicatequina y Procianidinas (tipo B 1, B 2 y C 1 ). 22

43 CAPÍTULO III 3. Metodología de investigación 3.1 Diseño de la investigación Enfoque. El actual trabajo de investigación tiene un enfoque cuantitativo, debido a que se necesitó evaluar el contenido de polifenoles en cacao CCN-51 para establecer modelos de comparación para examinar el efecto del ambiente sobre los mismos, para lo cual, se recolectó datos numéricos de mediciones instrumentales siguiendo el método científico que permitió la demostración de las hipótesis después de realizar un análisis estadístico Nivel de investigación. La tipología de investigación en este trabajo, es de carácter exploratoria correlacional, debido a que se identifican y miden las variables que intervienen en la caracterización de polifenoles individuales en el cacao CCN-51. Aplicando modelos estadísticos se verificó el grado de relación y significancia entre las zonas geográficas de cada muestra, con el valor de los resultados analíticos, generando información de tipo innovador que sirve como criterio de manufactura para productores e industriales Tipo de la investigación. Los tipos de investigación en este estudio son de tipo documental, bibliográfico, de campo y experimental. Es investigación tipo documental y bibliográfica, porque tiene como propósito conocer, contrastar, ampliar y profundizar con diferentes estudios previos sobre el cacao (Theobroma cacao L.), acerca de sus componentes químicos (polifenoles totales), proceso de beneficio del cacao, entre otros, utilizando documentos, revistas, periódicos, medios electrónicos, informes y otras publicaciones como fuente de información. De igual manera la investigación es de campo puesto que las muestras fueron tomadas directamente de las fincas de los productores y se cuenta con los datos de georeferenciación de las zonas de producción de cacao CCN-51 en las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos. Esta investigación es experimental puesto que necesita de laboratorios, equipamiento instrumental, materiales, reactivos y un método para determinar el contenido de polifenoles individuales en las muestras de cacao desengrasadas. 23

44 3.2 Población y muestra Población. La población para el presente estudio corresponde a las fincas productoras de cacao CCN-51de las provincias de mayor producción: Los Ríos, Guayas y Manabí (Anexo 2). Con la colaboración de los Técnicos de la Asociación de Exportadores de Cacao (ANECACAO) y del grupo de Investigación del Cacao del MAGAP, se estableció un plan de muestreo seleccionando en cada provincia los cantones de mayor volumen de producción de esta variedad de cacao. En cada cantón se seleccionaron fincas representativas de la población, tomándose un total de 27 muestras en duplicado (N=54); 9 en la provincia de Los Ríos, 9 en Manabí y 9 en Guayas Muestra. Para el muestreo en cada finca se escogieron al azar 10 árboles de cacao CCN-51 y se cosecharon 20 frutos por duplicado (40 frutos por finca) con la finalidad de obtener aproximadamente 1 Kg de cacao seco y fermentado de cada muestra para el análisis de laboratorio. En cada finca se tomaron los datos de latitud y longitud geográfica mediante GPS (Sistema de Posicionamiento Global) para facilitar la referencia y ubicación de los muestreos Tratamiento post-cosecha de las muestras de cacao. El manejo post-cosecha (fermentación y secado) de todas las muestras recolectadas se realizó utilizando los protocolos establecidos en el programa de cacao de la Estación Experimental Litoral Sur del INIAP. En cada muestra se extrajeron las almendras y se sometieron a un proceso de presecado al sol durante ocho horas, posteriormente se realizó micro fermentaciones durante cuatro días en cajas de madera de laurel de 120 cm de alto, 120 cm de ancho y 180 cm de profundidad, con capacidad para 120 kg de cacao. El proceso de secado se realizó exponiendo al sol los granos en tendales de cemento, hasta obtener aproximadamente 7% de humedad en los granos. Las muestras fermentadas y secas se transportaron al laboratorio (LSAIA) de la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP y se almacenaron en congelación (-20 C) hasta la fecha de los análisis. 3.3 Materiales y métodos Materiales y reactivos Estándares. Estándar de Catequina Sigma Aldrich de pureza >98% Estándar de Epicatequina Sigma Aldrich de pureza >98% Estándar de Procianidinas B 1 Sigma Aldrich de pureza >90% Estándar de Procianidinas B 2 Sigma Aldrich de pureza >90% Estándar de Procianidinas C 1 Sigma Aldrich de pureza >75% 24

45 Reactivos. Agua bidestilada Ácido fórmico grado P. A. a % Acetonitrilo grado HPLC Metanol grado HPLC Materiales. Viales ámbar de 2 ml Frascos de vidrio de 1 L Balones volumétricos ámbar de 25 ml Balón aforado de 1L Membranas de 0,45 μm de tamaño de poro Jeringas plásticas de 10 ml Tubos plásticos para centrífuga con capacidad de 15 ml Micro-pipetas volumétricas de 100, 1000 y 5000 μl Equipos. Balanza analítica de precisión g Shimadzu, Modelo AUX 220 Baño de ultrasonido Cole Parmer 8892-MTH Agitador de tubos MISTRAL MULTI-MIXER 4600 Centrífuga vorn J. E. GERBER & CO. type M56A No Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC) AGILENT 1100 SERIES, detector de arreglo de diodos 1260 DAD VL serie G1315D Metodología. La investigación se realizó en tres etapas; en la primera etapa se procedió a la adaptación de la metodología de análisis utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) acoplado a detector de arreglo de diodos (DAD) para la determinación de catequina, epicatequina, procianidinas B 1, procianidinas B 2 y procianidinas C 1 ; en la segunda etapa se efectuó la caracterización de estos metabolitos secundarios en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Manabí, Guayas, Los Ríos, utilizando la metodología previamente adaptada en la primera etapa; en la tercera se correlacionó todas las variables para evaluar si existe influencia del medio ambiente en la concentración de polifenoles en el cacao CCN Método de Análisis. El método cromatográfico utilizado en este trabajo para el análisis de polifenoles individuales en muestras de cacao (Anexo 3) fue adaptado por (Samaniego, 2012) a partir del método de análisis de polifenoles en frutas y vegetales del Laboratorio de Investigación de la Calidad Nutricional y 25

46 Funcional de los Alimentos del CIRAD-UMRQUALISUD de Francia, utilizando Cromatografía Liquida de Alta Resolución HPLC, acoplado a un Detector de Arreglo de Diodos DAD como producto de investigación publicado en la revista JOURNALD OF AGRICULTURAL AND CHEMISTRY, actualmente se encuentra implementado y validado en departamento de Nutrición y Calidad dentro del Laboratorio de Servicio de Análisis e Investigación de Alimentos (LSAIA), lugar donde se realizó la etapa experimental. El principio de la metodología se basa en la diferencia de la polaridad de los analitos (catequina, epicatequina y procianidinas B 1, B 2 y C 1 ) dando como resultado una distribución dependiente del nivel de afinidad hacia la fase estacionaria o fase móvil, utilizando como mecanismo de separación el reparto. Dentro de este contexto se sigue el siguiente procedimiento para el tratamiento de las muestras: Descripción general del método Catequinas, Epicatequinas, Procianidinas: B 1, B 2 y C 1 1. Pesar 0,3000 g de muestra de polvo de cacao desengrasado en un tubo de centrífuga de 15 ml de capacidad. 2. Adicionar 5 ml de la solución de extracción, acetona / agua /ácido fórmico 70:30:0,1 (V/V/V). 3. Tapar bien el tubo de centrífuga y agitar vigorosamente durante 3 minutos en el vórtex. 4. Colocar el tubo por 10 minutos en el baño de ultrasonido. 5. Centrifugar el tubo durante 10 minutos a 5700 rpm. 6. Recolectar la solución sobrenadante en un balón volumétrico ámbar de 25 ml. 7. Repetir el procedimiento por 3 ocasiones. 8. Aforar los balones ámbar con la solución de extracción, acetona / agua /ácido fórmico 70:30:0,1 (V/V/V). 9. Purificar los extractos a través de filtros de membrana de 0,22 μm. 10. Pasar los extractos a viales de inyección de 2 ml. 11. Inyectar 20 µl en el Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución, acoplado a un detector DAD. Culminado este procedimiento, se espera la emisión de las respuestas del equipo cromatográfico, las cuales son impresas, recolectadas y agrupadas para el procesamiento de datos. 3.4 Matríz de operacionalización de las variables En la Taba 4 se presenta de manera abstracta el plano concreto de la presente investigación, resumiendo la conceptualización, las variables de estudio, las dimensiones de cada una, sus indicadores e Items, orientando la ejecución de todo el proceso de la caracterización del contenido de polifenoles de las principales zonas de producción del Ecuador. 26

47 Tabla 4 Matriz de operacionalización de las variables. Conceptualización Variables Dimensiones Indicadores Ítems Manabí Cantones Concentración Zonas de Guayas Cantones de polifenoles producción en cacao Los Ríos Cantones CCN-51 de Procianidina B 1 Concentración mg/g las principales Procianidina B 2 Concentración mg/g zonas de Compuestos Procianidina C 1 Concentración mg/g producción polifenólicos Catequina Concentración mg/g del Ecuador. Epicatequina Concentración mg/g ETAPA I: Adaptación del método analítico para determinar el contenido de polifenoles individuales en cacao. En esta etapa se realizó el proceso de adaptación de la metodología con la finalidad de asegurar que los resultados obtenidos sean confiables, para lo cual se evaluó los siguientes parámetros: linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, rango de trabajo, precisión expresada como desviación de la repetibilidad y recuperabilidad de los analitos extraíbles expresada como porcentaje de recuperación. Posteriormente se hizo un estudio de regresión lineal para la calibración del equipo, usando estándares de epicatequina en concentraciones de 5, 25, 50, 75 y 100 ppm durante tres días Sistema de recolección de datos A. Linealidad La linealidad del método se evaluó relacionando la señal analítica del equipo con la concentración de las soluciones del estándar certificado de epicatequina por triplicado como se presenta en la Tabla 5. Tabla 5 Evaluación de la linealidad del método analítico Respuestas del equipo* Curva 1 Curva 2 Curva 3 Promedio* Concentración del estándar* C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 *Unidades: Concentración = mg/l; Respuestas del Equipo=mAUs*s Con los resultados obtenidos se realizó una gráfica promedio del área (mau*s) en el eje de las ordenadas y la concentración (mg/l) en el eje de las abscisas, y se hizo el estudio de 27

48 regresión línea siguiendo el Procedimiento PG-LSAIA-005 para la validación del método del Manual de Calidad interno del laboratorio (LSAIA), evaluando los siguientes parámetros: Coeficiente de correlación de Pearson de la curva (r): xy x y / n r / 2 1/ (1) 2 x 2 y x y n n Pendiente de la curva (m): m xy x y / n Syx 2 2 x x Sxx n (2) Intercepto (L): y m x L y m x (3) n Desviación de la pendiente (S m ): Sm x S yx Syx x Sxx n (4) Desviación del intercepto (S L ): SL x x Sm Sm n n (5) Error Típico (S y,x ): y yˆ 2 y, (6) n 2 S x Límite de confianza de la pendiente: m : m t. Sm 28 (7)

49 Límite de confianza del intercepto: L : L t. SL (8) B. Límite de Detección Utilizando el estudio de regresión lineal, se evaluó el límite de detección del método con la siguiente relación: LD S m (9) 3 y, x / Donde, S y,x, es el error típico m, es la pendiente C. Límite de cuantificación: Utilizando el estudio de regresión lineal, se evaluó el límite de cuantificación del método con la siguiente relación: LC S m (10) 6 y, x / Donde, S y,x = Error típico m = pendiente D. Rango de trabajo El rango de trabajo se estableció según las curvas de calibración de los analitos, y se estableció el rango de trabajo entre el límite de cuantificación y el nivel máximo (100 mg/l). Para cuantificar la concentración de los polifenoles, se procedió a integrar individualmente los picos identificados en los cromatogramas de los análisis en muestras de cacao, transformando las unidades de área (mau*s) por unidades de concentración (mg/l) haciendo uso de las curvas de calibración correspondientes de cada analito. [PLF] = A b a (11) Donde, [PLF], es la concentración de los analitos en estudio expresadas en mg/l. A, es el área de integración de la respuesta instrumental del análisis cromatográfico en mau*s a, es la pendiente curva de la calibración en mau*s*l/mg b, es a ordenada al origen o intercepto de la curva de calibración en mau*s 29

50 A continuación, estos valores fueron expresados en gramos de muestra de polvo de cacao, para ello se utilizó el volumen de aforo (V) de las extracciones (25 ml) y la masa (m) registrada de cada ensayo de cada muestra ( 0,3000 g) como se muestra en la siguiente ecuación: C PLF = [PLF] V m (12) Análisis de las unidades de los resultados. Las unidades de los resultados de los análisis de las muestras de cacao, límite de detección, límite de cuantificación, precisión y recuperabilidad, se reportan de la siguiente manera: E. Precisión C PLF = [PLF](mg L ) V(L) = ( mg m(g) g ) El estudio de la precisión del método se realizó mediante un ensayo de repetibilidad de los resultados, para lo cual se analizaron cinco veces una muestra de cacao CCN-51 utilizando la metodología analítica propuesta. (Tabla 6) Tabla 6 Evaluación de la precisión de la metodología analítica. Respuestas experimentales de los estándares Repeticiones (mg/g) E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Promedio Con los resultados del análisis se graficó el contenido de cada polifenol, posteriormente calculó la desviación estándar (S r ) y el coeficiente de variación (C. V.) mediante las siguientes fórmulas: S r = n i=1 (x i x) 2 n 1 (13) C. V = S 100 (14) X 30

51 Donde, S r, es la desviación estándar X, es el promedio Los resultados del coeficiente de variación (C. V.) se compararon con los valores referenciales para las concentraciones medidas presentadas en la ecuación de Horwitz (Gráfico 1), de tal manera que nos permite establecer si el error está dentro de los niveles aceptados en la magnitud de mg/g. Polifenoles en cacao Gráfico 1 Representación gráfica de la ecuación de Hortwiz Fuente: (University Kwazulu-Natal, 2009) 31

52 F. Recuperabilidad Se determinó el número de ciclos de extracción necesarios para recuperar el mayor porcentaje de los analitos de la muestra de cacao CCN-51, haciendo un análisis de las muestras por triplicado como se presenta en la Tabla 7. Tabla 7 Evaluación de la recuperabilidad del método. Respuesta Experimental Número de extracciones Σ(polifenol) (mg/g) Recuperación (%) Acumulado (%) E 1 E 2 E 3 E 4 E X Con los resultados se calculó el porcentaje de recuperación de los polifenoles en cada ciclo de extracción utilizando la siguiente relación: %Recuperacion = C Obtenido C Total x100 (15) Donde, C Obtenido, es la concentración de polifenoles obtenidos en el ciclo de extracción. C Total, es la concentración de polifenoles obtenidos de la suma de todos los ciclos de extracción ETAPA II. Caracterización del contenido de polifenoles del cacao CCN-51 de las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos. En esta etapa se realizó el análisis de polifenoles en 54 muestras de cacao CCN-51 fermentadas y secas de las provincias en estudio, siguiendo el procedimiento descrito en el literal Análisis estadístico Los resultados de cada polifenol analizado fueron agrupadas por cantón para su evaluación estadistica (Tabla 8). 32

53 Tabla 8 Contenido promedio de polifenol (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas Provincia Los Ríos Guayas Manabí Cantón Ventanas Quinsaloma Mocache Milagro Naranjal Yaguachi Santa Ana Chone Portoviejo Polifenol (mg/g) Desviación estándar Con los resultados de la Tabla 8, se realizaron dos gráficos en columnas para comparar el contenido promedio y la desviación estandar de los polifenoles asociados, en el primer gráfico evaluando por cantón y en el segundo grafico por provincia. A continuación se realizó un gráfico de histograma de frecuencias para evaluar como se distribuyen los datos en el rango de los resultados Factores de estudio En este trabajo de investigación se consideraron como factores en estudio a las provincias de mayor producción de cacao CCN-51 del Ecuador (Tabla 9). Tabla 9 Factores en estudio para la caracterización de cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del país. RESPUESTAS EXPERIMENTALES (mg Epicatequina / g) PROVINCIAS CANTONES FINCAS *CAT *EPCAT *PB 1 *PB 2 *PC 1 G M Guayas Manabí Y YAGUACHI F 1 F 2 F 3 M 1 MLAGRO F 1 F 2 F 3 N NARANJAL F 1 F 2 F 3 S SANTA ANA F 1 F 2 F 3 P PORTOVEJO F 1 F 2 F 3 C CHONE F 1 F 2 F 3 V VENTANAS F 1 F 2 F 3 LR Los Ríos Q QUINSALOMA F 1 F 2 F 3 M 2 MOCACHE F 1 F 2 F 3 *Abreviaciones: CAT= catequina; EPCT= epicatequina; PB 1=procianidina B1; PB 2= Procianidina B 2; PC 1= procianidina C 1. 33

54 Elaborado por: José Luis Yépez Rivadeneira Tratamientos La definición de los tratamientos se realizó de manera individual para cada una de las provincias productoras de cacao CCN-51: Los Ríos, Guayas y Manabí. En los tratamientos se considerarán, que en cada cantón se elegirá tres fincas productoras (F 1, F 2 y F 3 ) para la toma de muestras, como se presenta en la Tabla 10. Tabla 10 Tratamientos para cada una de las provincias productoras de cacao CCN-51. Guayas (G) Manabí (M) Los Ríos (LR) N Tratamientos N Tratamientos N Tratamientos 1 GYF 1 1 MSF 1 1 LRVF 1 2 GYF 2 2 MSF 2 2 LRVF 2 3 GYF 3 3 MSF 3 3 LRVF 3 4 GM 1 F 1 4 MPF 1 4 LRQF 1 5 GM 1 F 2 5 MPF 2 5 LRQF 2 6 GM 1 F 3 6 MPF 3 6 LRQF 3 7 GNF 1 7 MCF 1 7 LRM 2 F 1 8 GNF 2 8 MCF 2 8 LR M 2 F 2 9 GNF 3 9 MCF 3 9 LR M 2 F Diseño experimental: En la primera fase del análisis, se utilizó un diseño completamente al azar DCA, combinado entre las provincias con 27 tratamientos y dos repeticiones por tratamiento. (Tabla 11). Tabla 11 Esquema del análisis de varianza (ANOVA al 95% de confianza) combinado entre las provincias productoras de cacao CCN-51: Los Ríos, Guayas y Manabí. Fuente de variación Grados de Libertad TOTAL (F*t*r)-1 53 Productor /Finca (F) (F-1) 2 Productor /Finca (F) x Repeticiones (r) (F*r) 6 Tratamientos (t) (t-1) 8 Productor /Finca (F) x Tratamientos (t) (F*t)-1 26 Error Experimental 11 Según la tabla 12, se hizo un análisis de varianza del contenido de cada polifenol según las tres provincias de mayor producción del litoral ecuatoriano como se muestra en la Tabla

55 Tabla 12 Análisis de varianza del contenido de polifenol en cacao CCN-51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Efecto SC G. de Libertad MC F P Entre Dentro Error Donde, SC, es la suma de cuadrados. G. de Libertad, es los grados de libertad. MC, es la media cuadrática. F, es la prueba F de Fisher. p, es la medida del azar Análisis Funcional Para los tratamientos e interacciones significativas se aplicó la Prueba de Tukey al 5% ETAPA III: Evaluación correlacional multivariado de las muestras de cacao CCN Análisis de Componentes Principales (ACP) En la tercera etapa se realizó un análisis de componentes principales, para evaluar la correlación de las variables en estudio y el efecto del ambiente sobre el contenido de los polifenoles, mediante una proyección de los individuos en un plano factorial PC1 y PC2 que permitió determinar la correlación de las muestras para relacionarlos con los lugares de procedencia. Para ello se hizo uso del software estadístico stadistics y se realizó dos gráficos para estudiar la relación de las diferentes variables y reducir las dimensiones comunes que permitan clasificarlos. Un primer gráfico describe la distribución en el plano factorial de las variables del perfil de polifenoles en cacao CCN-51 y las tres provincias productoras de la región Litoral Ecuatoriana que permite ver su nivel de la correlación, y en el segundo se evalúa la proyección en el plano factorial 1x2 de todos los individuos analizados, donde los datos se representan en términos de mínimos cuadrados, de manera que se pudo evaluar conjuntos de observaciones de las variables correlacionadas de otro en un conjunto de valores de variables. 35

56 CAPÍTULO IV 4. Análisis y discusión de resultados 4.1 ETAPA I. Adaptación del método analítico para determinar el contenido de polifenoles en cacao Una vez seleccionada la metodología analítica (Anexo 3), se procedió a realizar varias pruebas en el laboratorio para establecer las condiciones óptimas del proceso de análisis, utilizando estándares de catequina al >98% de pureza, epicatequina al >98% de pureza, procianidina B 1 al >90% de pureza, procianidina B 2 al >90% de pureza y procianidina C 1 al >75% de pureza. Para establecer las condiciones del sistema cromatográfico, se realizaron pruebas en el equipo, tomando como referencia la técnica para análisis de polifenoles en cacao (método: Epicatequina, Catequina, Procianidinas del Manual para el análisis de parámetros químicos asociados a la calidad del cacao publicado por el INIAP) obteniendo los siguientes parámetros de trabajo: Columna: C18 (4,6 x 250 mm), tamaño de partícula de 5 μm Temperatura de columna: 35 ºC Flujo: 0,8 ml/min Volumen de inyección: 20 μl Detector: DAD, longitud de onda 280 ɳm Tiempo de cromatografía: 75 minutos Fase móvil: Eluyente A: Agua / Acetonitrilo / Acido fórmico (99:0,8:0,2) V/V/V Eluyente B: Acetonitrilo grado HPLC Gradiente de elución: 5 a 100 % de B en 75 minutos. Una vez establecidas las condiciones cromatográficas, se inyectó estándares puros de catequina, epicatequina, procianidina B 1, procianidina B 2 y procianidina C 1; determinándose el tiempo de retención y el orden de salida de cada analito, para la identificación y cuantificación en las muestras de cacao, obteniendo los siguientes resultados (Tabla 13): Tabla 13 Tiempo de retención promedio para cada estándar. Orden Polifenoles *Tiempo de retención. (min) 1 Procianidina B 1 17,53 ± 0,52 2 Catequina 19,83 ± 0,45 3 Procianidina B 2 21,22 ± 0,48 4 Epicatequina 23,11 ± 0,51 5 Procianidina C 1 24,35 ± 0,47 *Promedio de 20 inyecciones 36

57 En la figura 7, se presenta el cromatograma obtenido en la mezcla de estándares puros de 100 mg/l, donde se evidencia que todos los picos cromatográficos son altamente definidos, ligeramente asimétricos y tienen una forma leptocúrtica. Procianidina B 1 Procianidina B 2 Catequina Epicatequina t R =17,53 t R =21,22 t R =23,11 t R =24,35 t R =19,83 Procianidina C 1 Figura 7 Cromatograma de la mezcla de los estándares puros de polifenoles flavan-3-ol. Elaborado por:josé Luis Yépez Rivadeneira Estudio de la linealidad. Para evaluar la linealidad del método analítico, se preparó una solución madre de 100 mg/l de los estándares de cada polifenol por triplicado, de las cuales, se prepararon por dilución los diferentes niveles de concentración para elaborar las curvas de calibración, como se resume en la Tabla 14: Tabla 14 Preparación de los niveles de concentración de las soluciones estandar para elaborar las curvas de calibración. Volumen A (µl) Volumen B (µl) 37 Concentración (mg/l) A= Solución madre de Epicatequina. B= Metanol grado HPLC.

58 Area (mau*s) Una vez preparados los estándares se realizaron tres curvas de calibración, para ello se inyectó 20 μl de cada uno por triplicado en el equipo de cromatografía líquida Linealidad de catequina. Los resultados asociados a la curva de calibración promedio de catequina se resumen en la Tabla 15. Tabla 15 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de catequina Repeticiones Concentración* 5,00 25,00 50,00 75,00 100,00 Curva 1 90,90 434,91 890, , ,51 Curva 2 89,21 464,23 891, , ,20 Curva 3 90,44 461,95 827, , ,58 Promedio* 90,18 453,69 869, , ,10 *Unidades: Concentración = mg/l; Áreas=mAU*s Con base a los resultados de la tabla 15, se realizó un gráfico de la concentración promedio de catequina (mg/l) en la abscisa (X), versus el área promedio (mau*s) en la ordenada (Y), de las tres repeticiones. (Gráfico 2) , , , , , ,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00 A = 17,768 [CAT] + 2,2845 R² = 0, Concentración (mg/l) Gráfico 2 Curva de calibración global de catequina. La ecuación lineal para la curva de calibración obtenida en el gráfico 2 muestra un valor de pendiente de 17,768 (mau*s*l/mg), y de 2,2845 (mau*s) como ordenada al origen. El coeficiente de correlación lineal R 2 calculado es de 0,9994; lo que indica que existe una alta correlación lineal entre los resultados instrumentales de las áreas, en función de la concentración 38

59 de catequina. Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de regresión lineal para la curva de calibración global, cuyos resultados se presentan en la Tabla 16. Tabla 16 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de catequina. Donde, Parámetros Globales m= 17,77 L o = 2,28 m mín = 16,96 Lo mín = -47,14 m máx = 18,57 Lo máx = 51,71 S m = 0,25 S Lo = 15,53 t= 3,18 S y,x = 19,25 t calculada = 70,10 LD= 0,05 m, es la media de la curva de calibración global de catequina. L o, es el intercepto de la curva de calibración global de catequina. S m, es la desviación estándar de la media de la curva de calibración global de catequina S Lo, es la desviación estándar del intercepto de la curva de calibración global de catequina S x,y, es la desviación estándar del área bajo la curva de cada pico cromatográfico t, es el valor t de student obtenido de tablas LD, es el límite de detección de la catequina Los resultados de la prueba t de student para el coeficiente de correlación R, permitió verificar que existe una correlación lineal significativa entre el área (A) y la concentración de catequina ([CAT]). Observando los resultados se puede establecer que el valor de t calculado (70,10) es superior al valor t teórico (3,18), lo que permitió demostrar que existe una alta correlación lineal entre el área y la concentración. En el análisis de regresión lineal de la curva de calibración promedio global, se puede observar que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor de 17,77 (mau*s*l/mg) y de la ordenada al origen (L 0 ) es de 2,28 (mau*s). Los valores de la desviación estándar de la pendiente (S m ) y la desviación estándar de la ordenada al origen (S Lo ), son 0,25 (mau*s*l/mg) y 15,53 (mau*s) respectivamente. Utilizando los valores de la pendiente, intercepto y desviaciones estándar de cada parámetro, se establecieron los límites de confianza para cada uno de ellos, determinándose que la pendiente puede estar en un rango de 16,96 a 18,57 (mau*s*l/mg), y el intercepto en el rango de -47,14 a 51,71 (mau*s) con un nivel de confianza del 95%. El error típico (S x,y ) de la curva de calibración promedio global tiene un valor de 19,25 (mau*s), que representa una incertidumbre de ±0,08 (mg/g), es decir el grado de dispersión de los resultados con respecto al valor teórico. 39

60 Area (mau*s) Linealidad de epicatequina. Los resultados asociados a la curva de calibración promedio de epicatequina se resumen en la Tabla 17. Tabla 17 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de epicatequina. Repeticiones Concentración* 5,00 25,00 50,00 75,00 100,00 Curva 1 94,94 450,51 940, , ,51 Curva 2 94,94 489,84 949, , ,21 Curva 3 95,01 482,11 863, , ,01 Promedio* 94,97 474,15 918, , ,57 *Unidades: Concentración = mg/l; Áreas=mAU*s Con base a los resultados de la tabla 17 se realizó un gráfico de la concentración promedio de epicatequina (mg/l) en la abscisa (X), versus el área promedio (mau*s) en la ordenada (Y), de los tres días. (Gráfico 3) , , , , , ,00 800,00 A = 18,214 [EPC] + 14,105 R² = 0, ,00 400,00 200,00 0, Concentración (mg/l) Gráfico 3 Curva de calibración global de epicatequina. La ecuación lineal para la curva de calibración obtenida en el gráfico 3 muestra un valor de pendiente de 18,214 (mau*s*l/mg), y de 14,105 (mau*s) como ordenada al origen. El coeficiente de correlación lineal R 2 calculado es de 0,9988; lo que indica que existe una alta correlación lineal entre los resultados instrumentales de las áreas, en función de la concentración 40

61 de epicatequina. Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de regresión lineal para la curva de calibración global, cuyos resultados se presentan en la Tabla 18. Tabla 18 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de epicatequina. Donde, Parámetros Globales m= 18,21 L o = 14,11 m mín = 17,05 Lo mín = -56,90 m máx = 19,37 Lo máx = 85,11 S m = 0,24 S Lo = 22,31 t= 3,18 S y,x = 27,66 t calculada = 50,02 LD= 0,04 m, es la media de la curva de calibración global de epicatequina. L o, es el intercepto de la curva de calibración global de epicatequina. S m, es la desviación estándar de la media de la curva de calibración global de epicatequina. S Lo, es la desviación estándar del intercepto de la curva de calibración global de epicatequina. S x,y, es la desviación estándar del área bajo la curva de cada pico cromatográfico. t, valor t de student sacado de las tablas. LD, es el límite de detección de epicatequina. Los resultados de la prueba t de student para el coeficiente de correlación R, permitió verificar que existe una correlación lineal significativa entre el área (A) y la concentración de epicatequina ([EPC]). Observando los resultados se puede establecer que el valor de t calculado (50,02) es superior al valor t teórico (3,18), lo que permitió demostrar que existe una alta correlación lineal entre el área y la concentración. En el análisis de regresión lineal de la curva de calibración promedio global, se puede observar que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor de 18,21 (mau*s*l/mg) y de la ordenada al origen (L 0 ) es de 14,11 (mau*s). Los valores de la desviación estándar de la pendiente (S m ) y la desviación estándar de la ordenada al origen (S Lo ), son 0,24 (mau*s*l/mg) y 22,31 (mau*s) respectivamente. Utilizando los valores de la pendiente, intercepto y desviaciones estándar de cada parámetro, se establecieron los límites de confianza para cada uno de ellos, determinándose que la pendiente puede estar en un rango de 17,05 a 19,37 (mau*s*l/mg), y el intercepto en el rango de -56,90 a 85,11 (mau*s) con un nivel de confianza del 95%. El error típico (S x,y ) de la curva de calibración promedio global tiene un valor de 27,66 (mau*s), que representa una incertidumbre de ±0,06 (mg/g), es decir el grado de dispersión de los resultados con respecto al valor teórico. 41

62 Area (mau*s) Linealidad de procianidina B 1. Los resultados asociados a la curva de calibración promedio de procianidina B 1 se resumen en la Tabla 19. Tabla 19 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de procianidina B 1 Repeticiones Concentración* 5,00 25,00 50,00 75,00 100,00 Curva 1 26,27 138,37 279,03 431,27 573,75 Curva 2 26,64 138,37 288,60 429,16 560,86 Curva 3 26,65 135,98 285,28 434,20 563,77 Promedio* 26,52 137,57 284,31 431,54 566,13 *Unidades: Concentración = mg/l; Áreas=mAU*s Con base a los resultados de la Tabla 19, se realizó un gráfico de la concentración promedio de procianidina B 1 (mg/l) en la abscisa (X), versus el área promedio (mau*s) en la ordenada (Y), de los tres días. (Gráfico 4). 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 A = 5,722 [PB1] - 2,6091 R² = 0, ,00 0, Concentración (mg/l) 42

63 Gráfico 4 Curva de calibración global de procianidina B 1. La ecuación lineal para la curva de calibración obtenida en el gráfico 4 muestra un valor de pendiente de 5,722 (mau*s*l/mg), y de -2,6091 (mau*s) como ordenada al origen. El coeficiente de correlación lineal R 2 calculado es de 0,9998; lo que indica que existe una alta correlación lineal entre los resultados instrumentales de las áreas, en función de la concentración de procianidina B 1. Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de regresión lineal para la curva de calibración global, cuyos resultados se presentan en la Tabla 20. Tabla 20 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de procanidina B 1. Donde, Parámetros Globales m= 5,72 L o = -2,61 m mín = 5,55 Lo mín = -12,68 m máx = 5,89 Lo máx = 7,46 S m = 0,051 S Lo = 3,16 t= 3,18 S y,x = 3,92 t calculada = 110,80 LD= 0,82 m, es la media de la curva de calibración global de procianidina B 1. L o, es el intercepto de la curva de calibración global de procianidina B 1. S m, es la desviación estándar de la media de la curva de calibración global de procianidina B 1. S Lo, es la desviación estándar del intercepto de la curva de calibración global de procianidina B 1. S x,y, es la desviación estándar del área bajo la curva de cada pico cromatográfico. t, es el valor t de student obtenido de tablas. LD, es el límite de detección de procianidina B 1. Los resultados de la prueba t de student para el coeficiente de correlación R, permitió verificar que existe una correlación lineal significativa entre el área (A) y la concentración de procianidina B 1 ([PB1]). Observando los resultados se puede establecer que el valor de t calculado (110,80) es superior al valor t teórico (3,18), lo que permitió demostrar que existe una alta correlación lineal entre el área y la concentración. En el análisis de regresión lineal de la curva de calibración promedio global, se puede observar que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor de 5,72 (mau*s*l/mg) y de la ordenada al origen (L 0 ) es de -2,61 (mau*s). Los valores de la desviación estándar de la pendiente (S m ) y la desviación estándar de la ordenada al origen (S Lo ), son 0,051 (mau*s*l/mg) y 3,16 (mau*s) respectivamente. Utilizando los valores de la pendiente, intercepto y desviaciones estándar de cada parámetro, se establecieron los límites de confianza para cada uno de ellos, determinándose 43

64 Area (mau*s) que la pendiente puede estar en un rango de 5,55 a 5,89 (mau*s*l/mg), y el intercepto en el rango de -12,61 a 7,46 (mau*s) con un nivel de confianza del 95%. El error típico (S x,y ) de la curva de calibración promedio global tiene un valor de 3,92 (mau*s), que representa una incertidumbre de ±0,10 (mg/g), es decir el grado de dispersión de los resultados con respecto al valor teórico Linealidad de procianidina B 2. Los resultados asociados a la curva de calibración promedio de procianidina B 2 se resumen en la Tabla 21. Tabla 21 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de procianidina B 2 Concentración* Repeticiones 5,00 25,00 50,00 75,00 100,00 Curva 1 37,59 161,52 435,99 728,96 781,61 Curva 2 34,59 161,52 407,36 650,26 775,26 Curva 3 36,15 180,25 419,34 637,56 744,19 Promedio* 36,11 167,76 420,90 672,26 767,02 *Unidades: Concentración = mg/l; Áreas=mAU*s Con base a los resultados de la Tabla 21, se realizó un gráfico de la concentración promedio de procianidina B 2 (mg/l) en la abscisa (X), versus el área promedio (mau*s) en la ordenada (Y), de los tres días. (Gráfico 5). 900,00 800,00 700,00 600,00 500,00 400,00 300,00 A = 8,1931 [PB2] - 5,0403 R² = 0, ,00 100,00 0, Concentración (mg/l) Gráfico 5 Curva de calibración global de procianidina B 2. 44

65 La ecuación lineal para la curva de calibración obtenida en el gráfico 5 muestra un valor de pendiente de 8,193 (mau*s*l/mg), y de -5,04 (mau*s) como ordenada al origen. El coeficiente de correlación lineal R 2 calculado es de 0,9811; lo que indica que existe una alta correlación lineal entre los resultados instrumentales de las áreas, en función de la concentración de catequina. Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de regresión lineal para la curva de calibración global, cuyos resultados se presentan en la Tabla 22. Tabla 22 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de procianidina B 2. Donde, Parámetros Globales m= 8,19 L o = -5,04 m mín = 6,10 Lo mín = -133,14 m máx = 10,28 Lo máx = 123,06 S m = 0,66 S Lo = 40,25 t= 3,18 S y,x = 49,47 t calculada = 12,47 LD= 2,83 m, es la media de la curva de calibración global de procianidina B 2. L o, es el intercepto de la curva de calibración global de procianidina B 2. S m, es la desviación estándar de la media de la curva de calibración global de procianidina B 2. S Lo, es la desviación estándar del intercepto de la curva de calibración global de procianidina B 2. S x,y, es la desviación estándar del área bajo la curva de cada pico cromatográfico. t, es el valor t de student obtenido de tablas. LD, es el límite de detección de procianidina B 2. Los resultados de la prueba t de student para el coeficiente de correlación R, permitió verificar que existe una correlación lineal significativa entre el área (A) y la concentración de procianidina B 2 ([PB2]). Observando los resultados se puede establecer que el valor de t calculado (12,47) es superior al valor t teórico (3,18), lo que permitió demostrar que existe una alta correlación lineal entre el área y la concentración. En el análisis de regresión lineal de la curva de calibración promedio global, se puede observar que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor de 8,19 (mau*s*l/mg) y de la ordenada al origen (L 0 ) es de -5,04 (mau*s). Los valores de la desviación estándar de la pendiente (S m ) y la desviación estándar de la ordenada al origen (S Lo ), son 0,66 (mau*s*l/mg) y 40,25 (mau*s) respectivamente. Utilizando los valores de la pendiente, intercepto y desviaciones estándar de cada parámetro, se establecieron los límites de confianza para cada uno de ellos, determinándose que la pendiente puede estar en un rango de 6,10 a 10,28 (mau*s*l/mg), y el intercepto en el rango de -133,14 a 123,06 (mau*s) con un nivel de confianza del 95%. El error típico (S x,y ) de 45

66 Area (mau*s) la curva de calibración promedio global tiene un valor de 49,47 (mau*s), que representa una incertidumbre de ±0,55 (mg/g), es decir el grado de dispersión de los resultados con respecto al valor teórico Linealidad de procianidina C 1. Los resultados asociados a la curva de calibración promedio de procianidina C 1 se resumen en la Tabla 23. Tabla 23 Resultados de señal instrumental para el análisis de regresión lineal de procianidina C 1 Concentración* Repeticiones 5,00 25,00 50,00 75,00 100,00 Curva 1 33,18 159,75 370,20 601,98 788,50 Curva 2 30,45 169,83 365,90 647,88 885,76 Curva 3 32,09 167,24 375,90 575,21 832,24 Promedio* 31,90 165,60 370,67 608,36 835,50 *Unidades: Concentración = mg/l; Áreas=mAU*s Con base a los resultados de la tabla 23, se realizó un gráfico de la concentración promedio de procianidina C 1 (mg/l) en la abscisa (X), versus el área promedio (mau*s) en la ordenada (Y), de los tres días. (Gráfico 6). 900,00 800,00 700,00 600,00 500,00 400,00 300,00 A = 8,5608 [PC1] - 34,196 R² = 0, ,00 100,00 0, Concentración (mg/l) Gráfico 6 Curva de calibración global de procianidina C 1. 46

67 La ecuación lineal para la curva de calibración obtenida en el gráfico 6 muestra un valor de pendiente de 8,56 (mau*s*l/mg), y de -34,196 (mau*s) cómo ordenada al origen. El coeficiente de correlación lineal R 2 calculado es de 0,9965; lo que indica que existe una alta correlación lineal entre los resultados instrumentales de las áreas, en función de la concentración de catequina. Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de regresión lineal para la curva de calibración global, cuyos resultados se presentan en la Tabla 24. Tabla 24 Resultados del análisis de regresión lineal para la curva de calibración global de procianidina C 1. Parámetros Globales m= 8,56 L o = -34,19 m mín = 7,63 Lo mín = -90,97 m máx = 9,49 Lo máx = 22,59 S m = 0,29 S Lo = 17,84 t= 3,18 S y,x = 22,12 t calculada = 29,40 LD= 4,90 Donde, m, es la media de la curva de calibración global de procianidina C 1. L o, es el intercepto de la curva de calibración global de procianidina C 1. S m, es la desviación estándar de la media de la curva de calibración global de procianidina C 1. S Lo, es la desviación estándar del intercepto de la curva de calibración global de procianidina C 1. S x,y, es la desviación estándar del área bajo la curva de cada pico cromatográfico. t, es el valor t de student obtenido de tablas. LD, es el límite de detección de procianidina C 1. Los resultados de la prueba t de student para el coeficiente de correlación R, permitió verificar que existe una correlación lineal significativa entre el área (A) y la concentración de procianidina C 1 ([PC1]). Observando los resultados se puede establecer que el valor de t calculado (29,40) es superior al valor t teórico (3,18), lo que permitió demostrar que existe una alta correlación lineal entre el área y la concentración. En el análisis de regresión lineal de la curva de calibración promedio global, se puede observar que las magnitudes de la pendiente (m) toma un valor de 8,56 (mau*s*l/mg) y de la ordenada al origen (L 0 ) es de -34,19 (mau*s). Los valores de la desviación estándar de la pendiente (S m ) y la desviación estándar de la ordenada al origen (S Lo ), son 0,29 (mau*s*l/mg) y 17,84 (mau*s) respectivamente. Utilizando los valores de la pendiente, intercepto y desviaciones estándar de cada parámetro, se establecieron los límites de confianza para cada uno de ellos, determinándose que la pendiente puede estar en un rango de 7,63 a 9,49 (mau*s*l/mg), y el intercepto en el 47

68 rango de -90,97 a 22,59 (mau*s) con un nivel de confianza del 95%. El error típico (S x,y ) de la curva de calibración promedio global tiene un valor de 22,12 (mau*s), que representa una incertidumbre ±0,54 (mg/g), es decir el grado de dispersión de los resultados con respecto al valor teórico Límite de detección y límite de cuantificación. La estimación del límite de detección y cuantificación se realizó remplazando en las ecuaciones 9 y 10 respectivamente, la magnitud del error típico y de la pendiente obtenidos del estudio de regresión lineal del método de cada uno de los estándares, realizado previamente. Los resultados de los análisis en las muestras de cacao son representados como miligramos de polifenol por gramo de muestra (mg/g), por lo que a continuación, se calculó estos parámetros en muestra, para ello se utilizó los datos del volumen de aforo (25 ml) y el peso de muestra (0,3 g) descritas en la metodología, los resultados se presentan en la Tabla 25. Catequina Tabla 25 Resultados del Límite de Detección y Cuantificación. Epicatequina Procianidina B 1 Procianidina B 2 Procianidina C Precisión. Límite de Detección Límite de Cuantificación Curva 0,05 mg/l 0,48 mg/l Muestra 0,0045 mg/g 0,04 mg/g Curva 0,04 mg/l 0,60 mg/l Muestra 0,0033 mg/g 0,05 mg/g Curva 0,82 mg/l 1,65 mg/l Muestra 0,07 mg/g 0,14 mg/g Curva 2,83 mg/l 7,99 mg/l Muestra 0,23 mg/g 0,67 mg/g Curva 4,90 mg/l 7,01 mg/l Muestra 0,41 mg/g 0,58 mg/g Para establecer la precisión del método se realizó el análisis cromatográfíco en cinco repeticiones de una muestra de cacao CCN-51 escogida aleatoriamente durante un día de trabajo; los resultados de esta prueba se presentan en la Tabla 26. Tabla 26 Resultados de concentración de polifenoles para análisis de precisión del método. REPETICIÓN Procianidina B 1 Catequina Procianidina B 2 Epicatequina Procianidina C 1 (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) R 1 0,99 2,74 4,74 6,15 2,16 R 2 1,07 2,69 4,90 6,57 2,19 R 3 0,95 2,78 4,77 6,22 2,21 R 4 1,00 2,54 4,73 6,13 2,12 48

69 Concentración (mg/g) R 5 1,03 2,73 4,83 6,44 2,22 Promedio 1,01 2,70 4,79 6,30 2,18 Con base a los resultados de la tabla 25, se evaluó la media y la desviación estándar para establecer la precisión de análisis para cada analito (epicatequina, catequina, procianidina B 1, procianidina B 2 y procianidina C 1 ). Los resultados se presentan en el Figura 8. 7,00 6,00 σ= 0,20 5,00 σ= 0,07 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 σ= 0,09 2,70 6,30 1,01 4,79 2,18 CATEQUINA EPICATEQUINA PROCIANIDINA B1 PROCIANIDINA B2 PROCIANIDINA C1 Figura 8 Evaluación gráfica de la precisión del método para el análisis de los polifenoles en muestra de cacao CCN-51. Utilizando los resultados de la figura 8, se calculó el coeficiente de variación (C. V.) para cada polifenol utilizando la Ecuación 14 los resultados se resumen en la Tabla 27. Tabla 27 Cálculo del coeficiente de variación (C. V.) de cada estándar de polifenol. Polifenoles Media (mg/g) Desviación estándar (mg/g) 49 σ= 0,04 Polifenoles analizados C.V. Catequina 2,69 0,09 3,48 Epicatequina 6,30 0,20 3,10 Procianidina B 1 1,01 0,04 4,43 Procianidina B 2 4,79 0,07 1,46 Procianidina C 1 2,18 0,04 1,84 Elaborado por: José Luis Yépez Rivadeneira σ= 0,04 Los resultados de C.V. se compararon con el valor referencial del coeficiente de variación obtenido de la gráfica de la trompeta de Horwitz para el nivel de concentración de mg/g,

70 CONCENTRACIÓN 0,55 0,12 0,02 0,00 0,69 0,13 0,02 0,01 0,25 0,05 0,03 0,34 0,04 0,02 0,77 0,15 0,03 0,01 1,35 2,09 2,73 3,16 3,54 6,32 (mg 10,18 correspondiente a 5,6. Analizando los resultados se determinó que C.V. Horwitz > C.V. Polifenoles en todos los casos, por lo cual se demostró que el método presenta una precisión adecuada para la dimensión de concentración de los resultados Recuperabilidad. Para calcular la recuperabilidad del método, se determinó el número de ciclos de extracción necesarios para obtener el mayor porcentaje de recuperación de los polifenoles de las muestras. Para ello se utilizó una muestra aleatoria de cacao CCN-51 y se realizó cinco ciclos de extracción siguiendo el proceso descrito en la metodología, en cada extracto obtenido se cuantificó el contenido de los polifenoles por HPLC/DAD. Los resultados de este análisis se presentan en la figura 9: 14,00 12,00 10,00 8,00 Extracción 1 Extracción 2 Extracción 3 Extracción 4 Extracción 5 6,00 4,00 2,00 0,00 Procianidina B1 Catequina Procianidina B2 Epicatequina Procianidina C1 Figura 9 Evaluación del nivel de extracción de cada componente durante cada ciclo. Con los resultados de la figura 9, se calculó el contenido total de polifenoles mediante la suma de la concentración obtenida para cada uno (catequina + epicatequina + procianidina B 1 + procianidina B 2 + procianidina C 1 ). Posteriormente se determinó el porcentaje de recuperación en cada extracto relacionando la concentración de polifenoles en cada ciclo de extracción para el contenido total por 100, los resultados se presentan en la tabla 28. Tabla 28 Recuperabilidad del método en función del porcentaje de extracción. Σ(polifenol) (mg/g) 50 Recuperación (%) Acumulado (%) Extracción 1 25,93 79,54 79,54 Extracción 2 5,45 16,70 96,25 Extracción 3 1,00 3,06 99,31

71 Catequina Epicatequina Extracción 4 0,16 0,48 99,78 Extracción 5 0,07 0,22 100,00 TOTAL 32, Con base a estos resultados se estableció que se necesita realizar cuatro ciclos de extracción de 3 minutos de agitación por vórtex y 10 minutos de ultrasonido, para obtener un porcentaje de recuperación del 99,78% de los analitos extraíbles ETAPA II. Caracterización del contenido de polifenoles en cacao CCN-51 de las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos En el presente trabajo de investigación se analizaron por duplicado un total de 27 muestras de cacao CCN-51 (fermentadas y secas) pertenecientes a las provincias de Los Ríos, Manabí y Guayas, utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) de acuerdo al método vigente en el Manual para el análisis de parámetros químicos asociados a la calidad del cacao publicado por el INIAP (Anexo 3). En la figura 10 se presenta el cromatograma de una muestra de cacao, en la cual se identificó cada pico cromatográfíco comparando el tiempo de retención (t R ) con los resultados promedio de la tabla 13. En el pico de tiempo de retención de 17,48 (min) corresponde a procianidina B 1 (17,01 a 18,05 min), el segundo pico identificado de t R =19,89 (min) corresponde a catequina, el tercer pico identificado (t R =21,32) corresponde a procianidina B 2, el cuarto pico identificado de t R =23,12 corresponde al epicatequina, el quinto polifenol identificado tiene un t R =24,38, y corresponde a procianidina C 1. mau DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,20 (C:\DOCUMEN...ACAO CCN-51 5MJ \ D) 200 t R =23, t R =17,48 Procianidina B 1 t R =19,89 t R =21,32 Procianidina B 2 t R =24,38 Procianidina C Figura 10 Cromatograma típico de una muestra de cacao CCN min

72 4.2.1 Análisis de catequina. Los resultados de concentración promedio por cantón del análisis cromatográfico de catequina se resumen en la tabla 29. Tabla 29. Contenido promedio de catequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas. PROVINCIA Los Ríos Guayas Manabí CANTÓN *CATEQUINA (mg/g) DESVIACIÓN ESTÁNDAR Ventanas 3,18 ±0,29 Quinsaloma 2,92 ±0,26 Mocache 2,77 ±0,27 Milagro 2,45 ±0,22 Naranjal 3,03 ±0,21 Yaguachi 2,63 ±0,29 Santa Ana 2,59 ±0,14 Chone 2,42 ±0,43 Portoviejo 2,46 ±0,28 *Resultado promedio de 3 repeticiones El contenido de catequina en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí varía en un rango de 2,42 a 3,18 mg/g. Con base a los resultados se comparó los promedios de cada cantón en estudio. En la figura 11, se puede observar que los cantones Ventanas, Naranjal y Quinsaloma presentan mayor contenido de este polifenol, mientras que los cantones Milagro, Portoviejo y Chone presentan menores contenidos del mismo. 52

73 Figura 11 Contenido promedio de catequina (mg epicatequina/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón. En la figura 12, se presenta los contenidos promedio de catequina por provincia, verificándose que la provincia de Los Ríos presenta el mayor contenido promedio de catequina con un valor de 2,96 mg/g, seguido por la provincia de Guayas con 2,70 mg/g. La provincia de Manabí presentó el menor contenido promedio de este polifenol (2,49 mg/g). 53

74 Figura 12 Contenido promedio de catequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia. En la figura 13, se presenta el histograma de frecuencias del contenido de catequina de 54 muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí demostrando que el 85,2% (46 datos) de las muestras se encuentra en un rango de 2,4 a 3,4 mg/g. De igual manera se pudo demostrar que la mayor frecuencia de observaciones (16 datos) se encuentra entre el rango de 2,4 a 2,6 mg/g. Cabe destacar que el 48,15% (26 datos) de las muestras están en el rango de 2,4 a 2,8 mg/g, el 30,04% (20 datos) recaen al rango de 2,8 a 3,4 mg/g, mientras que el 14,81% (9 datos) están en el rango de las concentraciones bajas de 1,6 a 2,2 mg/g. 54

75 Figura 13 Histograma de frecuencia para el contenido de catequina (mg /g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Influencia del medio ambiente en la concentración de catequina en muestras de cacao. Con la finalidad de evaluar el efecto del origen del cacao sobre el contenido de catequina se realizó un análisis de varianza ANOVA ( =0,05) para las tres provincias en estudio, los resultados se muestran en la Tabla 30. Tabla 30. Análisis de varianza del contenido de catequina en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Efecto SC G. de Libertad MC F P Ord. Origen 398, , ,726 0, Provincia 1, ,9863 9,914 0, Error 5, ,0995 Con base a los resultados se establece que existe diferencia estadística significativa (p< 0,05) en el contenido de catequina en las muestras de cacao CCN-51 fermentadas durante 4 días en las 55

76 tres provincias de mayor producción del litoral ecuatoriano con un nivel de confianza del 95%, éste análisis permite establecer que existe un efecto del ambiente sobre el contenido de catequina. Con estos resultados se realizó el análisis de comparación de medias mediante la prueba de significación de Tukey (95% confianza) (Tabla 31), donde se pudo establecer que no existe diferencia significativa entre las medias del contenido de catequina de las provincias de Los Ríos y Guayas; y entre Guayas y Manabí. Tabla 31 Representación de la prueba de significancia de Tukey para catequina. Provincias Valor medio Significancia Los Ríos 2,81 B Guayas 2,57 A, B Manabí 2,37 A Análisis de epicatequina. Los resultados de concentración promedio por cantón del análisis cromatográfico de epicatequina se resumen en la Tabla 32. Tabla 32. Contenido promedio de epicatequina (mg/g) en cacao CCN-51 proveniente de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas. PROVINCIA Los Ríos Guayas Manabí CANTÓN *EPICATEQUINA (mg/g) 56 DESVIACIÓN ESTÁNDAR Ventanas 4,21 ±1,55 Quinsaloma 2,68 ±0,56 Mocache 2,57 ±1,25 Milagro 15,17 ±1,35 Naranjal 14,15 ±1,05 Yaguachi 12,57 ±2,90 Santa Ana 8,66 ±2,04 Chone 6,50 ±1,62 Portoviejo 6,93 ±1,84 *Contenido promedio de tres repeticiones El contenido de epicatequina en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí varía ampliamente en un rango de 2,57 a 15,17 mg/g. Con base a estos

77 resultados se comparó los promedios de cada cantón en estudio. En la figura 14, se puede observar que los cantones Milagro, Naranjal y Yaguachi presentan mayor contenido de este polifenol, mientras que los cantones Mocache, Quinsaloma y Ventanas presentan menores contenidos del mismo. Figura 14 Contenido promedio de epicatequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón. De la misma manera en la figura 15, se presenta los contenidos promedio de epicatequina por provincia, verificándose que la provincia de Guayas presenta el mayor contenido de epicatequina 57

78 con un valor de 13,96 mg/g, seguido por la provincia de Manabí con 7,36 mg/g. La provincia de Los Ríos presentó el menor contenido de este polifenol (3,16 mg/g). Figura 15 Contenido promedio de epicatequina (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia. En la figura 16, se presenta el histograma de frecuencias del contenido de epicatequina de 54 muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí, demostrando que el 92,6% de las muestras se encuentra en un rango de 2 a 16 mg/g; la mayor frecuencia de observaciones (13 datos) se encuentra entre los 2 a 4 mg/g. Cabe destacar que el 51,9% (28 58

79 datos) de las muestras están en el rango de 2 a 8 mg/g, mientras que el 37,03% (20 datos) recaen al rango de concentraciones de 10 a 16 mg/g. Figura 16 Histograma de frecuencia para el contenido de epicatequina (mg /g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Influencia del medio ambiente en la concentración de epicatequina en muestras de cacao. Con la finalidad de evaluar el efecto del origen del cacao sobre el contenido de epicatequina se realizó un análisis de varianza ANOVA ( =0,05) para las tres provincias en estudio, los resultados se muestran en la tabla 33. Tabla 33 Análisis de varianza del contenido de epicatequina en cacao CCN-51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Efecto SC G. de Libertad MC F P Ord. Origen 3595, , ,046 0,000 Provincia 1067, , ,254 0,000 Error 175, ,437 59

80 Con base a los resultados se establece que existe diferencia estadística significativa (p< 0,05) en el contenido de epicatequina en las muestras de cacao CCN-51 fermentadas durante 4 días en las tres provincias de mayor producción del litoral ecuatoriano con un nivel de confianza del 95%, éste análisis permite establecer de igual manera que existe un efecto del ambiente sobre el contenido de epicatequina. Con estos resultados se realizó el análisis de comparación de medias mediante la prueba de significación de Tukey (95% confianza) (tabla 34), donde se pudo demostrar que las medias del contenido de epicatequina en cacao CCN-51 son diferentes en las tres provincias en estudio confirmando que existe un efecto del ambiente sobre el contenido de este polifenol. Tabla 34 Representación de la prueba de significancia de Tukey para epicatequina. Provincias Valor medio Significancia Guayas 13,58 A Manabí 7,20 B Los Ríos 3,13 C Análisis de procianidinas B 1. Los resultados de la concentración promedio por cantón del análisis cromatográfico de procianidina B 1 se resumen en la Tabla 35. Tabla 35 Contenido promedio de procianidina B 1 (mg/g) en cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas. PROVINCIA CANTÓN PROCIANIDINA B 1 DESVIACIÓN (mg/g) ESTÁNDAR Ventanas 1,80 ±0,39 Los Ríos Quinsaloma 1,69 ±0,20 Mocache 1,76 ±0,10 Milagro 2,90 ±0,21 Guayas Naranjal 2,88 ±0,32 Yaguachi 2,85 ±0,60 Santa Ana 2,83 ±0,35 Manabí Chone 2,61 ±0,25 Portoviejo 2,87 ±0,15 *Resultados promedio de 3 repeticiones El contenido de procianidina B 1 en las muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí varía en un rango de 1,69 a 2,90 mg/g. Con base a los resultados se comparó los promedios de cada cantón en estudio. En la figura 17, se puede observar que los cantones 60

81 Milagro, Naranjal, Yaguachi, Santa Rosa y Portoviejo presentan mayor contenido de este polifenol, mientras que los cantones Ventanas, Quinsaloma y Mocache presentan los menores contenidos del mismo. Figura 17 Contenido promedio de procianidina B 1 (mg/g) en cacao CCN-51 agrupadas por cantón. 61

82 En la figura 18, se presenta los contenidos promedio de procianidina B 1 por provincia, verificándose que la provincia de Guayas presenta el mayor contenido de procianidina B 1 con un valor de 2,88 mg/g, seguido por la provincia de Manabí con 2,77 mg/g. La provincia de Los Ríos presenta el menor contenido promedio de este polifenol (1,75 mg/g). Figura 18 Contenido promedio de procianidina B 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia. En la figura 19, se presenta el histograma de frecuencias del contenido de procianidina B 1 de 54 muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí demostrando que el 62

83 92,59% de las muestras se encuentra en un rango de 1,4 a 3,2 mg/g. De igual manera se pudo demostrar que la mayor frecuencia de observaciones (11 datos) se encuentra entre los 3,0 a 3,2 mg/g. Cabe destacar que el 48,15% (26 datos) de las muestras están en el rango de 2,6 a 3,2 mg/g, mientras que el 29,63% (16 datos) recaen al rango de las concentraciones de 1,4 a 2,0 mg/g. Figura 19 Histograma de frecuencia para el contenido de procianidina B 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Influencia del medio ambiente en la concentración de procianidina B 1 en muestras de cacao. Con la finalidad de evaluar el efecto del origen del cacao sobre el contenido de procianidina B 1 se realizó un análisis de varianza ANOVA ( =0,05) para las tres provincias en estudio, los resultados se muestran en la tabla 36. Tabla 36 Análisis de varianza del contenido de procianidina B1 en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Efecto SC G. de Libertad MC F p Ord. Origen 328, , ,302 0,

84 Provincia 13, , ,596 0, Error 4, ,0944 Con base a los resultados se establece que existe diferencia estadística significativa (p< 0,05) en el contenido de procianidina B 1 en las muestras de cacao CCN-51 fermentadas durante 4 días en las tres provincias de mayor producción del litoral ecuatoriano con un nivel de confianza del 95%, éste análisis permite establecer que existe un efecto del ambiente sobre el contenido de procianidina B 1. Con estos resultados se realizó el análisis de comparación de medias mediante la prueba de significación de Tukey (95% confianza) (Tabla 37), donde se pudo demostrar que no existe diferencia estadística entre las medias del contenido de procianidina B 1 en cacao CCN-51 de las provincias de Guayas y Manabí. El contenido promedio de procianidina B 1 en la provincia de los Ríos es menor por lo cual presenta diferencia estadística con respecto a las otras provincias. Tabla 37 Representación de la prueba de significancia de Tukey para procianidinas B 1. Provincias Valor medio Significancia Guayas 0,88 A Manabí 0,85 B Los Ríos 0,54 B Análisis de procianidinas B 2. Los resultados de concentración promedio por cantón del análisis cromatográfico de procianidinas B 2 se resumen en la tabla 38. Tabla 38 Contenido promedio de procianidina B 2 (mg/g) en cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas. PROVINCIA Los Ríos Guayas Manabí CANTÓN PROCIANIDINA B 2 * (mg/g) 64 DESVIACIÓN ESTÁNDAR Ventanas 0,87 ±0,33 Quinsaloma 1,18 ±0,88 Mocache 1,62 ±0,96 Milagro 15,94 ±0,56 Naranjal 14,64 ±0,93 Yaguachi 13,83 ±2, 03 Santa Ana 12,09 ±1,80 Chone 9,21 ±2,06 Portoviejo 10,84 ±1,31 *Promedio de 3 repeticiones

85 El contenido de procianidina B 2 en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí varía en un rango de 0,87 a 15,94 mg/g. Con base a los resultados se comparó los promedios de cada cantón en estudio. En la figura 20, se puede observar que los cantones Milagro, Yaguachi y Naranjal presentan mayores contenidos de este polifenol, mientras que los cantones Ventanas, Quinsaloma y Mocache presentan los menores contenidos del mismo. 65

86 Figura 20 Contenido promedio de procianidina B 2 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón. En la figura 21, se presenta los contenidos promedio de procianidina B 2 por provincia, verificándose que la provincia de Guayas tiene mayor contenido de procianidina B 2 con un valor de 14,80 mg/g, seguido por la provincia de Manabí con 10,72 mg/g. La provincia de Los Ríos presentó el menor contenido de este polifenol (1,22 mg/g). 66

87 Figura 21 Contenido promedio de procianidina B 2 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia. En la figura 22, se presenta el histograma de frecuencias del contenido de procianidina B 2 de 54 muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí demostrando que el 94,34% de las muestras se encuentra en un rango de 0 a 16 mg/g; es recalcable que las mayores frecuencias observadas (15 y 14 datos) se encuentran en los extremos de la gráfica, en los rangos 67

88 de 0 a 2 y 14 a 16 mg/g respectivamente. Cabe destacar que el 57,41% (31 datos) de las muestras están en el rango de 8 a 16 mg/g, mientras que el 33,33% (18 datos) recae al rango de 0 a 4 mg/g. Figura 22 Histograma de frecuencia para el contenido de procianidina B 2 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Influencia del medio ambiente en la concentración de procianidina B 2 en muestras de cacao. Con la finalidad de evaluar el efecto del origen del cacao sobre el contenido de procianidina B 2 se realizó un análisis de varianza ANOVA ( =0,05) para las tres provincias en estudio, los resultados se muestran en la Tabla 39. Tabla 39 Análisis de varianza del contenido de procianidina B 2 en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos) Efecto SC G. de Libertad MC F p Ord. Origen 4290, , ,383 0,00 Provincia 1747, , ,367 0,00 Error 121, ,384 68

89 Con base a los resultados se establece que existe diferencia estadística significativa (p< 0,05) en el contenido de procianidina B 2 en las muestras de cacao CCN-51 fermentadas durante 4 días en las tres provincias de mayor producción del litoral ecuatoriano con un nivel de confianza del 95%, éste análisis permite establecer que existe un efecto del ambiente sobre el contenido de procianidina B 2. Con estos resultados se realizó el análisis de comparación de medias mediante la prueba de significación de Tukey (95% confianza) (Tabla 40), donde se pudo demostrar que existe diferencia estadística entre las medias del contenido de procianidina B 2 en cacao CCN-51 de las provincias de Guayas, Manabí y Los Ríos. Tabla 40 Representación de la prueba de significancia de Tukey para procianidinas B 2. Provincias Valor medio Significancia Guayas 6,42 A Manabí 4,65 B Los Ríos 0,54 C Análisis de procianidinas C 1. Los resultados de concentración promedio por cantón del análisis cromatográfico de procianidinas C 1 se presentan en Tabla 41. Tabla 41 Contenido promedio de procianidina C 1 (mg/g) en cacao CCN-51 provenientes de las provincias de Los Rios, Manabí y Guayas. PROVINCIA CANTÓN PROCIANIDINA C 1 DESVIACIÓN ESTÁNDAR VENTANAS 2,89 ±0,65 LOS RÍOS QUINSALOMA 2,27 ±0,39 MOCACHE 2,23 ±0,63 MILAGRO 10,15 ±0,57 GUAYAS NARANJAL 9,25 ±0,71 YAGUACHI 8,98 ±1,93 SANTA ANA 6,20 ±1,55 MANABÍ CHONE 5,00 ±0,80 PORTOVIEJO 5,02 ±1,23 *Resultado promedio de 3 repeticiones 69

90 El contenido de procianidina C 1 en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí varía en un rango de 2,23 a 10,15 mg/g. Con base a los resultados se comparó los promedios de cada cantón en estudio. En la figura 23, se puede observar que los cantones Milagro, Yaguachi y Naranjal presentan mayor contenido de este polifenol, mientras que en los cantones Ventanas, Quinsaloma y Mocache se encuentran los menores contenidos del mismo. Figura 23 Contenido promedio de procianidina C 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por cantón. En la figura 24, se compara los contenidos promedio de procianidina C 1 por provincia, verificándose que la provincia de Guayas presenta mayor contenido de procianidina C 1 con un valor de 9,46 mg/g, seguido por la provincia Manabí con 5,41 mg/g. La provincia de Los Ríos presenta el menor contenido de este polifenol (2,46 mg/g). 70

91 Figura 24 Contenido promedio de procianidina C 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 agrupadas por provincia. En la figura 25, se presenta el histograma de frecuencias del contenido de procianidina C 1 de 54 muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí demostrando que el 90,74% de las muestras se encuentra en un rango de 2,0 a 11,00 mg/g, encontrándose que la mayor frecuencia de observaciones el 22,22 %(12 datos para cada una) se encuentra en el rango de concentraciones de 2,0 a 3,0 mg/g. Cabe destacar que el 70.37% (38 datos) de las muestras están en el rango de 3,0 a 11,0 mg/g. 71

92 Figura 25 Histograma de frecuencia para el contenido de procianidina C 1 (mg/g) en muestras de cacao CCN-51 de las provincias de Los Riós, Guayas y Manabí Influencia del medio ambiente en la concentración de catequina en muestras de cacao. Con la finalidad de evaluar el efecto del origen del cacao sobre el contenido de procianidina C 1 se realizó un análisis de varianza ANOVA ( =0,05) para las tres provincias en estudio, los resultados se muestran en la Tabla 42. Tabla 42. Análisis de varianza del contenido de procianidina C1 en cacao CCN 51 de tres provincias del Litoral Ecuatoriano (Guayas, Manabí y Los Ríos). Efecto SC G. de Libertad MC F p Ord. Origen 1802, , ,916 0,00 Provincia 443, , ,778 0,00 Error 62, ,221 72

93 Con base a los resultados se establece que existe diferencia estadística significativa (p < 0,05) en el contenido de procianidina C 1 en las muestras de cacao CCN-51 fermentadas durante 4 días en las tres provincias de mayor producción del litoral ecuatoriano con un nivel de confianza del 95%, éste análisis permite establecer que existe un efecto del ambiente sobre el contenido de procianidina C 1. Con estos resultados se realizó el análisis de comparación de medias mediante la prueba de significación de Tukey (95% confianza) (tabla 43), donde se pudo establecer que existe diferencia significativa entre las medias del contenido de procianidina C 1 de las provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí. Tabla 43 Representación de la prueba de significancia de Tukey para procianidina C 1. Provincias Valor medio Significancia Guayas 4,16 A Manabí 2,32 B Los Ríos 0,98 C 4.3 ETAPA III: Evaluación correlacional multivariado de las muestras de cacao CCN Análisis de componentes principales (ACP). Con los resultados promedio de 54 muestras de diferentes zonas de origen de cacao CCN-51 se realizó el análisis de componentes principales para establecer la correlación entre las muestras en función del perfil de polifenoles obtenido mediante la proyección en un plano X, Y. En la figura 26, se presenta la correlación entre las variables estudiadas, donde se puede observar que en el análisis ACP, la componente P1 y Componente P2 correspondientes respectivamente a la abscisa (72,03%) y la ordenada (21,64%) del plano factorial explica el 93,67% de la varianza total de los datos, donde se demostró que los vectores representan a las variables epicatequina, procianidinas B 1, procianidinas B 2 y procianidinas C 1 están muy próximos lo que indica que los contenidos de estos polifenoles están fuertemente correlacionados. El vector que corresponde a la variable catequina presenta una correlación diferente a las demás variables estudiadas, por lo cual se establece que los contenidos de catequina en el cacao CCN- 51 son diferentes en función del origen de las muestras estudiadas. 73

94 Figura 26 Distribución en el plano factorial de las variables del perfil de polifenoles en cacao CCN 51 de tres provincias productoras de la región Litoral Ecuatoriana. En la figura 27, se presenta la representación de todos los individuos analizados (muestras de cacao CCN-51) en el plano factorial 1:2 (P1 y P2). Grupo 2 Grupo 1 Grupo 4 Grupo 6 Grupo 3 Grupo 5 Figura 27 Proyección en el plano factorial 1x2 de todos los individuos analizados en relación a el contenido de polifenoles. 74

95 En función de la correlación entre las muestras se pudo observar la formación de 6 grupos, el grupo 1 está constituido por todas las muestras de la provincia de Los Ríos (18 datos), mismas que presentan alta correlación debido a que contienen las mayores concentraciones de catequinas entre 2,41 y 3,20 mg/g; mientras que para los contenidos de epicatequina varían entre 1,03 y 6,13 mg/g; procianidinas B 1 entre 0,43 y 0,71 mg/g; procianidinas B 2 entre 0,19 y 1,24 mg/g y procianidinas C 1 entre 0,49 y 1,55 mg/g. El grupo 2 está formado por las muestras de las provincias de Guayas (14 datos), que presentaron contenidos de catequinas entre 2,26 y 3,16 mg/g; epicatequinas entre 12,57 y 17,19 mg/g; procianidinas B 1 entre 0,69 y 0,97 mg/g; procianidinas B 2 entre 5,87 y 7,21 mg/g y procianidinas C 1 entre 3,74 y 4,94 mg/g. El grupo 3 está formado por las muestras de las provincias de Manabí (10 datos), que presentaron contenidos de catequinas entre 2,26 y 2,63 mg/g; epicatequinas entre 5,03 y 8,07 mg/g; procianidinas B 1 entre 0,71 y 0,93 mg/g; procianidinas B 2 entre 3,03 y 4,95 mg/g y procianidinas C 1 entre 1,58 y 2,47 mg/g. El grupo 4 se conformó con las muestras de las provincias de Manabí (5 datos) y Guayas (1 dato), que presentaron contenidos de catequinas entre 2,33 y 2,72 mg/g; epicatequinas entre 9,23 y 10,52 mg/g; procianidinas B 1 entre 0,75 y 1,08 mg/g; procianidinas B 2 entre 5,25 y 6,10 mg/g y procianidinas C 1 entre 2,80 y 3,36 mg/g. El grupo 5 está formado por las muestras de las provincias de Manabí (3 datos) y Guayas (1 dato), que presentaron contenidos de catequinas entre 1,76 y 2,05 mg/g; epicatequinas entre 5,06 y 7,51 mg/g; procianidinas B 1 entre 0,78 y 1,11 mg/g; procianidinas B 2 entre 3,84 y 5,27 mg/g y procianidinas C 1 entre 1,96 y 2,69 mg/g. El grupo 6 está formado por las muestras de las provincias de Guayas (2 datos), que presentaron contenidos de catequinas entre 2,03 y 0,97 mg/g; epicatequinas entre 14,92 y 17,19 mg/g; procianidinas B 1 entre 0,96y 0,97 mg/g; procianidinas B 2 entre 6,88 y 7,21 mg/g y procianidinas C 1 entre 4,38 y 4,94 mg/g. 75

96 CAPÍTULO V 5. Conclusiones y recomendaciones 5.1 Conclusiones 1. La metodología analítica implementada permitió identificar los polifenoles tipo flavan-3- ol; catequina, epicatequina, procianidina B 1, procianidina B 2 y procianidina C 1 utilizando Cromatografía Liquida de Alta Resolución acoplada a detector de arreglo de Diodos DAD. 2. El límite de detección del método analítico es de 0,05 mg/l para la catequina; 0,04 mg/l para epicatequina; 0,82 mg/l para la procianidina B 1 ; 2,83 mg/l para la procianidina B 2 y 4,91 mg/l en las muestras de cacao CCN-51, demostrando que este método es capaz de detectar cantidades muy pequeñas de los polifenoles. 3. El límite de cuantificación del método analítico es de 0,48 mg/l para catequina, 0,60 mg/l para epicatequina; 1,65 mg/l para procianidina B 1 ; 7,99 mg/l para procianidina B 2 y 7,01 mg/l para procianidina C 1, en muestras de cacao CCN-51, lo que expresa que la metodología utilizada puede medir concentraciones de polifenoles a partir de este valor. 4. La concentración mínima cuantificable de polifgenoles en las muestras de polvo de cacao fue de 0,04 mg/g para catequina, 0,05 mg/g para epicatequina; 0,14 mg/g para procianidina B 1 ; 0,67 mg/g para procianidina B 2 y 0,58 mg/g para procianidina C 1, en muestras de cacao CCN El coeficiente de correlación (R 2 ) para las ecuaciones de las curvas de calibración de catequina, epicatequina, procianidina B 1, procianidina B 2 y procianidina C 1 toman un valor de 0,9994, 0,9988, 0,9998, 0,9811 y 0,9965 respectivamente, lo que indica que el método utilizado presenta una alta correlación entre el área de la señal instrumental (mau*s) en función de la concentración de los estándares de polifenoles (mg/g). 6. El método desarrollado es preciso para el rango de concentraciones medidas (mg/g), debido a que los coeficientes de variación obtenidos en el ensayo de repetibilidad fueron inferiores a los valores referenciales presentados en la gráfica dela trompeta de Horwitz. 7. El método analítico necesita de 4 ciclos de extracción de 3 minutos de agitación y 10 minutos en el ultrasonido para recuperar el 99,78% de los polifenoles extraíbles, para la cuantificación de polifenoles en cacao CCN-51 por Cromatografía Líquida de Alta Resolución. 8. El polifenol más abundante presente en las muestras de cacao CCN-51, independientemente del origen, es la epicatequina cuya concentración promedio para las muestras analizadas es de 7,97 mg/g. 9. Las muestras de cacao CCN-51de la provincia de Guayas presentaron la mayor concentración de procianidina B 1 (0,88 mg/g), procianidina B 2 (6,42 mg/g), procianidina C 1 (4,16 mg/g) y epicatequina (13,58 mg/g), mientras que la provincia de Los Ríos presentó mayor concentración de catequina (2,81 mg/g). 10. La concentración promedio de polifenoles tipo flavan-3-ol (catequina, epicatequina, procianidina B 1, procianidina B 2 y procianidinas C 1 ) en cacao CCN-51 de las diferentes 76

97 provincias en estudio, presentan diferencias estadísticas significativas (α= 0,05), por lo cual se demostró que existe un efecto de la zona de origen (ambiente) sobre el contenido de estos componentes no volátiles, y se aprueba la hipótesis de trabajo (H 1 ). 5.2 Recomendaciones: 1. Se recomienda incrementar las zonas de muestreo para generar una mayor cantidad de información, de manera que se pueda realizar un mapeo más amplio acerca del contenido de polifenoles en función de las zonas de origen. 2. Se recomienda generar información comparable de otras variedades de cacao, para contrastar y verificar el contenido de estos metabolitos secundarios y establecer una base de datos completa para el uso de industriales, académicos y productores. 3. Se recomienda utilizar más estándares de polifenoles para caracterizar una cantidad mayor de picos en los cromatogramas de cacao, debido a que presentan áreas significativas de picos definidos no identificados en este trabajo. 4. Se recomienda hacer un estudio de la capacidad antioxidante de los polifenoles del cacao de las diferentes variables y zonas de producción como estudio complementario a este trabajo investigativo. 5. Se recomienda seguir todos los pasos del proceso de la metodología para la extracción y análisis de los polifenoles en cacao para asegurar una resolución y certeza de los resultados cromatográficos. 77

98 BIBLIOGRAFÍA Achmad Subagio, P. S. (2010). Osaka: Phytochemical Analysis. Ana Belšcak, D. K. (2009). Comparative study of commercially available cocoa products in terms of their bioactive composition. Food Research International, ANECACAO. (2016). Exportación Ecuatoriana de cacao Boletín mensual de ANECACAO, ANECACAO, Quito. Obtenido de C.L. Hii, C. L. (Agust de 2009). Polyphenols in cocoa (Theobroma cacao L.). Asian Journal of Food and Agro-Industry, Recuperado el 05 de September de 2016 Cacao Silvestre Boliviano. (s.f.). Cacao silvestre boliviano. Obtenido de Su portal para concer e cacao Bolviano.: Camino, C. E., & Carpio, C. (2013). Estudio del contenido de grasa, alcaloides y polifenoles totales en almendras de cacao nacional fino de aroma en zonas del litoral ecuatoriano para comparar su calidad y facilitar su comercialización. Ambato: Universidad Técnica de Ambato. César, B. (2006). Metodología de la investigación: para administración, economía, humanidades y ciencias sociales (2 ed.). México: Pearson Educación. Chiaki Sanbongi, N. O. (1998). Antioxidative Polyphenols Isolated from Theobroma cacao. Journal of Agricultural and Food Chemistry, ICCO; International Cocoa Administration. (29 de Junio de 2016). ICCO Monthly Averages of Daily Prices. Obtenido de International Cocoa Administration: &show=graph&option=com_statistics&view=statistics&Itemid=114&mode=custom &type=1 Rivadeneira, M. (2013). Propuesta para el mejoramiento del manejo poscosecha del cultivo de cacao (Theobroma cacao) de la variedad CCN-51 en el cantón Quinsaloma - Los Rios. Universidad Central del Ecuador. Quito: Universidad Central del Ecuador. Recuperado el 20 de Julio de 2016, de pdf 78

99 Rodrígez, M. M. (2010). Manejo técnico del cultivo de cacao en Manabí. Ecuador.. Portoviejo: Instituto Nacional Autónomo de Investigación Agropecuaria. Estación Experimental Portoviejo. Samaniego, I. (2012). Caracterización de la evolución de los polifenoles durante la fermentación del cacao: Un estudio de Espectroscopía de Infrarrojo Cercano NIRS y HPLC. Tesis de M.Sc. Montpellier, Francia.: CIRAD. University Kwazulu-Natal. (2009). Estimation of sampling errors. Obtenido de Doing an analysis for the first time: sflb.ashx Yanzapanta, L. A. (2013). Estudio de la variación de los contenidos de polifenoles totales, alcaloides y grasa en almendras de cacao fino de aroma en tres diferentes zonas de producción de la amazonía ecuatoriana. Ambato: Uiversidad Técnica de Ambato. 79

100 ANEXOS Anexo 1 Matriz de recolección de datos experimentales. # Masa *PB1 *CAT *PB2 *EPC *PC1 (g) (mau*s) (mau*s) (mau*s) (mau*s) (mau*s) *R 1 *R 2 *R 1 *R 2 *R 1 *R 2 *R 1 *R 2 *R 1 *R 2 *R 1 *R 2 1 0,3000 0, ,9 151,6 711,1 717,4 124,4 116,7 1374,8 1321,3 359,4 337,9 2 0,2998 0, ,0 154,3 718,8 711,4 124,0 122,0 1386,0 1382,1 347,7 347,0 3 0,2997 0, ,1 94,8 718,1 721,8 62,0 61,5 680,6 678,0 213,1 212,9 4 0,3000 0, ,3 94,1 717,4 714,8 53,5 52,7 621,8 619,9 210,2 213,9 5 0,3003 0, ,8 115,1 568,4 567,3 63,5 62,9 771,3 751,6 229,3 215,9 6 0,3000 0, ,1 116,3 644,8 648,0 58,1 65,8 826,3 824,3 237,3 229,9 7 0,3000 0, ,1 112,8 640,6 638,8 72,1 68,1 704,5 707,5 248,7 239,0 8 0,3006 0, ,4 107,1 648,2 648,4 39,9 41,8 606,6 618,5 212,1 217,2 9 0,2997 0, ,7 103,4 677,7 677,9 50,8 51,5 684,2 680,9 208,1 207,9 10 0,3007 0, ,2 102,3 672,8 680,8 59,1 60,1 710,9 707,4 225,7 234,6 11 0,3005 0, ,1 131,7 550,2 558,5 221,3 232,9 443,8 444,9 146,0 146,8 12 0,3001 0, ,3 132,1 552,6 561,2 221,1 216,3 465,2 452,9 153,7 155,1 13 0,2999 0, ,8 117,7 662,6 670,4 97,0 99,0 669,9 695,9 218,5 227,4 14 0,3000 0, ,1 103,7 660,3 662,1 92,0 93,3 687,3 685,1 227,4 227,8 15 0,3006 0, ,4 126,8 541,7 546,0 98,6 98,5 802,3 803,5 242,2 249,4 16 0,3004 0, ,1 123,1 581,4 590,0 84,4 84,5 825,2 829,8 248,6 249,1 17 0,2997 0, ,5 122,8 544,0 549,6 279,2 277,3 220,0 238,6 112,5 119,5 18 0,3004 0, ,1 115,1 543,6 564,7 278,8 267,9 233,9 244,3 107,7 109,7 19 0,3007 0, ,7 159,1 598,4 601,1 1443,0 1451,2 3065,1 3023,0 992,7 980,4 20 0,3005 0, ,3 158,1 639,1 630,6 1516,8 1493,5 3279,9 3320,3 1017,8 1032,1 21 0,3009 0, ,3 188,3 589,4 581,9 1437,8 1439,5 3127,0 3052,2 1006,2 962,6 22 0,3005 0, ,9 184,5 582,7 563,7 1475,5 1487,6 3160,3 3136,0 1055,0 1026,0 23 0,3000 0, ,8 202,5 593,7 602,9 1619,4 1621,2 3160,0 3183,7 1013,3 981,9 24 0,3007 0, ,2 189,8 558,9 534,2 1584,9 1537,1 3286,2 3247,0 1006,1 1006,2 25 0,3010 0, ,8 180,3 512,0 506,3 1543,5 1529,0 3298,5 3288,8 1019,5 1013,6 26 0,3000 0, ,3 192,6 512,3 552,5 1458,8 1504,3 3024,5 3040,6 927,6 943,6 27 0,3003 0, ,4 218,9 453,8 458,4 1573,8 1537,2 3371,2 3381,2 993,7 984,4 28 0,3006 0, ,9 214,9 511,5 511,7 1627,5 1631,8 3902,8 3881,0 1118,0 1113,2 29 0,3001 0, ,8 207,9 706,1 719,6 1595,2 1552,5 3365,4 3428,7 1020,2 1022,5 30 0,3001 0, ,4 157,7 643,2 637,2 1508,0 1469,0 3177,8 3165,4 980,1 962,4 31 0,2999 0, ,9 182,9 582,9 571,2 1345,8 1389,7 2908,8 2907,3 865,6 835,0 32 0,2999 0, ,6 211,2 667,1 658,1 1329,0 1321,2 2833,1 2847,8 838,4 847,7 33 0,2999 0, ,9 202,0 640,3 622,8 1370,4 1412,7 3019,5 3001,0 869,4 863,5 34 0,3006 0, ,7 219,4 661,7 670,1 1476,8 1458,8 3338,7 3364,8 931,4 959,9 35 0,2999 0, ,9 240,9 545,1 504,5 1279,6 1279,4 2380,5 2372,1 766,9 747,5 36 0,3005 0, ,8 244,1 468,1 456,4 985,4 980,1 1681,4 1612,8 549,6 534,7 80

101 37 0,3005 0, ,5 201,6 588,9 554,1 1242,5 1335,2 2254,3 2266,8 733,0 723,1 38 0,3002 0, ,6 227,0 543,8 538,2 1300,0 1344,5 2106,0 2315,1 695,3 745,2 39 0,3000 0, ,5 159,0 570,0 583,2 1121,4 1111,9 1802,4 1845,8 569,0 542,6 40 0,3006 0, ,4 171,3 584,5 596,8 1376,0 1379,9 2371,2 2287,5 775,2 740,1 41 0,3002 0, ,6 210,8 533,6 516,3 1052,3 1146,1 1631,2 1724,6 505,1 508,8 42 0,3009 0, ,1 204,8 514,8 529,8 911,8 902,9 1198,7 1138,3 369,2 341,6 43 0,3005 0, ,6 208,4 548,7 530,5 934,3 985,2 1224,1 1231,3 369,0 362,5 44 0,3001 0, ,1 208,3 530,9 566,3 999,5 1000,6 1281,6 1304,3 382,0 397,5 45 0,3008 0, ,1 189,1 514,2 505,9 957,4 999,1 1198,9 1267,3 372,4 392,9 46 0,3005 0, ,6 185,0 519,6 533,1 963,2 1007,4 1412,8 1538,6 481,5 497,7 47 0,3009 0, ,4 198,8 439,4 416,0 1213,5 1171,1 1694,6 1704,2 606,7 607,1 48 0,3005 0, ,0 193,7 608,0 617,7 1238,9 1282,1 2286,9 2253,2 677,1 646,2 49 0,3001 0, ,3 199,4 610,1 601,4 1166,5 1209,5 2065,0 2111,1 629,6 631,3 50 0,3010 0, ,1 207,0 407,6 417,8 1107,2 1067,7 1558,6 1577,7 526,3 497,2 51 0,3003 0, ,5 177,3 381,0 411,3 882,9 851,5 1145,5 1144,0 447,0 434,7 52 0,3007 0, ,2 165,5 547,4 541,3 896,7 874,5 1161,3 1111,5 404,9 397,3 53 0,2996 0, ,0 175,3 566,1 552,7 684,9 678,3 1310,8 1365,6 460,5 450,2 54 0,3000 0, ,4 160,7 575,0 608,1 700,2 703,4 1375,1 1348,5 435,1 442,3 *Abreviaciones: CAT= catequina; EPCT= epicatequina; PB 1=procianidina B1; PB 2= Procianidina B 2; PC 1= procianidina C 1; R 1= repetición uno; R 2= repetición dos. Elaborado por: José Luis Yépez Rivadeneira Anexo 2 Factores en estudio para la caracterización de cacao CCN-51 de las principales zonas productoras del país. # PROVINCIA CANTÓN FINCA PB1 CAT PB2 EPC PC1 (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) 1 LOS RÍOS VENTANAS ZAPOTAL 2,24 3,34 1,28 6,09 3,72 2 LOS RÍOS VENTANAS ZAPOTAL 2,3 3,35 1,3 6,26 3,72 3 LOS RÍOS VENTANAS CHACARITA 1,41 3,37 0,68 3,04 2,41 4 LOS RÍOS VENTANAS CHACARITA 1,41 3,35 0,59 2,77 2,4 5 LOS RÍOS VENTANAS PASAJE 1,73 2,65 0,69 3,41 2,5 6 LOS RÍOS VENTANAS PASAJE 1,73 3,02 0,68 3,71 2,61 7 LOS RÍOS QUINSALOMA RÍO UMBE 1,65 2,99 0,76 3,16 2,71 8 LOS RÍOS QUINSALOMA RÍO UMBE 1,58 3,02 0,47 2,73 2,42 9 LOS RÍOS QUINSALOMA LAS TOLAS 1,52 3,17 0,57 3,06 2,36 10 LOS RÍOS QUINSALOMA LAS TOLAS 1,5 3,16 0,66 3,17 2,57 11 LOS RÍOS QUINSALOMA ESTERO DE PIEDRA 1,94 2,59 2,36 1,96 1,76 12 LOS RÍOS QUINSALOMA ESTERO DE PIEDRA 1,94 2,6 2,27 2,03 1,83 13 LOS RÍOS MOCACHE SAN FELIPE 1,77 3,12 1,05 3,06 2,5 14 LOS RÍOS MOCACHE SAN FELIPE 1,59 3,09 0,99 3,07 2,55 15 LOS RÍOS MOCACHE RECIENTO PECHICHE 1,85 2,53 1,05 3,6 2,72 81

102 16 LOS RÍOS MOCACHE RECIENTO PECHICHE 1,83 2,73 0,91 3,71 2,75 17 LOS RÍOS MOCACHE RECINTO GUABITO 1,83 2,55 2,88 0,98 1,46 18 LOS RÍOS MOCACHE RECINTO GUABITO 1,72 2,58 2,82 1,02 1,39 19 GUAYAS MILAGRO ROBERTO ASTUDILLO 2,92 2,79 16,52 14,41 10,04 20 GUAYAS MILAGRO ROBERTO ASTUDILLO 2,8 2,55 15,88 14,81 10,1 21 GUAYAS MILAGRO ROBERTO ASTUDILLO 2,62 2,37 15,65 14,95 10,21 22 GUAYAS MILAGRO ROBERTO ASTUDILLO 2,8 2,48 15,1 13,77 9,43 23 GUAYAS MILAGRO 3,16 2,13 15,86 15,35 9,95 24 GUAYAS MILAGRO 3,12 2,39 16,61 17,7 11,18 25 GUAYAS NARANJAL SAN CARLOS 3,12 3,33 16,05 15,44 10,27 26 GUAYAS NARANJAL SAN CARLOS 2,36 2,99 15,18 14,41 9,78 27 GUAYAS NARANJAL JESÚS MARÍA 2,61 2,69 13,95 13,21 8,6 28 GUAYAS NARANJAL JESÚS MARÍA 3,05 3,1 13,53 12,91 8,54 29 GUAYAS NARANJAL NARANJAL 3,08 2,95 14,2 13,68 8,76 30 GUAYAS NARANJAL NARANJAL 3,07 3,11 14,95 15,22 9,52 31 GUAYAS YAGUACHI PJ MONTERO 2,29 2,8 14,76 13,83 9,93 32 GUAYAS YAGUACHI PJ MONTERO 2,26 2,97 15, ,3 33 GUAYAS YAGUACHI PJ MONTERO 2,71 2,73 14,65 14,02 9,9 34 GUAYAS YAGUACHI PJ MONTERO 2,68 2,67 15,1 14,3 10,45 35 GUAYAS YAGUACHI FÁTIMA 3,53 2,45 13,07 10,79 7,7 36 GUAYAS YAGUACHI FÁTIMA 3,62 2,15 10,03 7,44 5,6 37 MANABÍ SANTA ANA LODANA 2,97 2,67 13,14 10,25 7,41 38 MANABÍ SANTA ANA LODANA 3,18 2,52 13,48 10,02 7,34 39 MANABÍ SANTA ANA LA UNIÓN 2,32 2,69 11,41 8,27 5,74 40 MANABÍ SANTA ANA LA UNIÓN 2,46 2,76 14,05 10,56 7,7 41 MANABÍ SANTA ANA SANTA ANA 3,03 2,45 11,2 7,58 5,26 42 MANABÍ SANTA ANA SANTA ANA 3 2,43 9,26 5,26 3,78 43 MANABÍ PORTOVIEJO COLÓN 3,03 2,51 9,79 5,53 3,88 44 MANABÍ PORTOVIEJO COLÓN 3,04 2,56 10,22 5,84 4,13 45 MANABÍ PORTOVIEJO CALDERÓN 2,77 2,38 9,98 5,56 4,05 46 MANABÍ PORTOVIEJO CALDERÓN 2,66 2,45 10,06 6,67 5,09 47 MANABÍ PORTOVIEJO MILAGRO DE RÍO CHICO 2,89 1,99 12,16 7,69 6,23 48 MANABÍ PORTOVIEJO MILAGRO DE RÍO CHICO 2,85 2,86 12,85 10,29 6,76 49 MANABÍ CHONE SAN ANTONIO 2,8 2,83 12,11 9,46 6,46 50 MANABÍ CHONE SAN ANTONIO 2,99 1,92 11,09 7,08 5,3 51 MANABÍ CHONE RICAURTE 2,53 1,84 8,86 5,16 4,62 52 MANABÍ CHONE RICAURTE 2,34 2,54 9,05 5,12 4,23 53 MANABÍ CHONE RICAURTE 2,64 2,61 6,99 6,05 4,77 54 MANABÍ CHONE RICAURTE 2,37 2,76 7,19 6,15 4,6 *Abreviaciones: CAT= catequina; EPCT= epicatequina; PB 1=procianidina B1; PB 2= Procianidina B 2; PC 1= procianidina C 1. Elaborado por: José Luis Yépez Rivadeneira 82

103 Anexo 3 SECCIÓN 6.9 DEL MANUAL PARA EL ANÁLISIS DE PARÁMETROS QUÍMICOS ASOCIADOS A LA CALIDAD DEL CACAO. CATEQUINA, EPICATEQUINA Y PROCIANIDINAS B1, B2, C1 1. INTRODUCCIÓN Los polifenoles están presentes en una cantidad significativa en las almendras de cacao (hasta un 20% en masa). En el cacao, los flavan-3-ols son los polifenoles mayoritarios (37%), siendo la epicatequina el polifenol más abundante con un 35% del total de polifenoles del cacao; de igual manera en las almendras del cacao existen polifenoles oligomeros, que son polímeros formados por la unión de varios monómeros de (+)-epicatequina y (-)-epicatequina conocidos como procianidinas, ellos representan el 58% de los polifenoles del cacao (Wollgast, 2000). Para la identificación y cuantificación de los flavan-3-ols del cacao se ha adaptado una metodología analítica, tomando como referencia el método de análisis de polifenoles en frutas y vegetales del Laboratorio de Investigación de la Calidad Nutricional y Funcional de los Alimentos del CIRAD-UMRQUALISUD de Francia, utilizando Cromatografía Liquida de Alta Resolución HPLC, acoplado a un Detector de Arreglo de Diodos DAD, (Samaniego, 2012). 2. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los polifenoles del polvo de cacao son extraídos con una solución de acetona/agua/ácido fórmico al 70/30/0.1 v/v/v, mediante agitación continua durante 3 minutos en un vórtex, 10 minutos en el ultrasonido y 10 minutos en la centrífuga. El extracto obtenido se lo lleva a un balón de 25mL, se repite la extracción por 4 veces, finalmente se purifica el extracto con una membrana de 0.22μm y se realiza la identificación y cuantificación utilizando Cromatografía Liquida de Alta Resolución, acoplado a detector de Arreglo de Diodos. 3. CAMPO DE APLICACIÓN Este método se aplica a las almendras de cacao secas fermentadas, no fermentadas en el polvo y el licor de cacao. 4. REACTIVOS Acetona grado p.a. Ácido fórmico, grado p.a % Acetonitrilo grado HPLC Agua ultra pura o bidestilada 83

104 Metanol grado HPLC 4.1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución acetona/agua/ácido fórmico (70/30/0.1): Transferir cuantitativamente 70mL de acetona grado p.a. en un balón volumétrico de 100mL, aforar con agua bidestilada y adicionar 0.1mL de ácido fórmico p.a. Fase móvil: agua/ acetonitrilo/ácido fórmico (99/0.8/0.2): Transferir cuantitativamente 8mL de acetonitrilo grado HPLC y 2mL de ácido fórmico grado p.a., en un balón aforado de 1000mL, aforar con agua bidestilada y filtrar al vacío utilizando membrana MIllipore HV de 0.45µm. Solución estándar: Pesar 0.01g de estándar de Catequina, Epicatequina, Procianidinas B1 B2 y C1 en un balón de 100mL y aforar con metanol. 5. EQUIPOS Y MATERIALES Membranas de 0.45µm y 0,22 µm de poro Jeringas plásticas de 10mL Balones volumétricos ámbar de 25mL Balanza analítica de precisión 0.1mg Tubos de centrífuga con capacidad de 10mL Pipetas volumétricas de 5 y 10mL Baño ultrasonido Agitador de tubos Centrífuga Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC) Viales ámbar capacidad 2mL 6. PROCEDIMIENTO a) Pesar aproximadamente 0.3g de muestra de polvo de cacao desengrasado en un tubo de centrífuga de capacidad 10mL. b) Adicionar 3mL de la solución acetona/agua/ácido fórmico (70/30/0.1) v/v/v. c) Tapar el tubo de centrífuga, agitar durante 3 minutos en un vórtex, posteriormente agitar en un baño ultrasonido por 10 minutos y centrifugar por 10 minutos a 5700 rpm. 84

105 d) Pasar la solución sobrenadante a un balón volumétrico ámbar de 25mL. e) Repetir el procedimiento de extracción (b y c) por 4 ocasiones y aforar a 25mL con la solución de acetona/agua/ácido fórmico (70/30/0.1) v/v/v. f) Filtrar la solución por membrana de 0.22μm y colocar en viales ámbar (aproximadamente 1.5mL). g) Inyectar en el HPLC, utilizando las siguientes condiciones cromatográficas: Columna: AGILENT Eclipse XDB-C18 4,6 x 250mm, tamaño de partícula de 5µm Temperatura de columna: 35 C Flujo: 0.8mL/min Volumen de Inyección: 20μL Detector: DAD. Longitud de onda 280nm Fase móvil: A: agua / acetonitrilo / ácido fórmico (99/0.8/0.2) v/v/v. B: Acetonitrilo Bomba binaria, gradiente de elución: 5% de B a 100% de B en 67 minutos 7. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS La cuantificación se realiza utilizando una curva de calibración preparada previamente en el equipo, el cálculo de la concentración de cada polifenol se realiza mediante la siguiente fórmula: mg g Polifenoles = C V t F d p C V t F d p = Concentración en mg/l obtenida a partir de la curva de calibración. = Volumen total de extracto (0.025L) = Factor de dilución = peso de la muestra (g) 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Samaniego, I Caracterización de la evolución de los polifenoles durante la fermentación del cacao: Un estudio de Espectroscopía de Infrarrojo Cercano NIRS y HPLC. Tesis de M.Sc. Montpellier, Francia. Universidad de Montpellier, p Wollgast, J.; Elke, A Review on polyphenols in Theobroma cacao: changes in composition during the manufacture of chocolate and methodology for identification and quantification. Journal of Food Research International, 33:

106 Anexo 4 Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC) AGILENT 1100 SERIES, detector de arreglo de diodos 1260 DAD VL serie G1315D. Anexo 5 Baño de ultrasonido COLE PARMER 8892-MTH 86

107 Anexo 6 Balanza analitica de precisión g Shimadzu, Modelo AUX 220 Anexo 7 Centrífuga vorn J. E. GERBER & CO. type M56A No

108 Anexo 8 Agitador de tubos MISTRAL MULTI-MIXER 4600 Anexo 9 Proceso de extracción de lixiviados de una muestra aleatoria de cacao CCN-51 para determinar la precición de la metodología analítica. 88

109 Anexo 10 Recopilación en viales de los extractos de polifenoles de muestras de cacao CCN- 51 para evaluar la exactuitud y presición de la metodología analítica. Anexo 11 Evaluación de la exactitud del método analítico, haciendo uso de cinco ciclos de extracción en una muestra de cacao CCN-51, manifestando diferente intensidad en función de la concentración de analitos. 89

110 Anexo 12 Metanol de pureza grado para cromatografía líquida utilizado para la extracción de polifenoles en las muestras de cacao CCN-51. Anexo 13 Estándares certificados de epicatequina, catequina, procianidina C1, procianidina B 2 y procianidina B 1. 90

111 Anexo 14 Preparación de la solución madre del estándar de procianidina B 1. mau 45 Anexo 15 Cromatograma del análisis del estándar de 100 mg/l de procianidina B 1. DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,20 (C:\DOCUMEN...AO CCN-51 CURVA \ D) t R =17, Procianidina B min 91