PCR en Tiempo Real y su aplicación n en la Enfermedad de Carrión. Sofía Romero Mederos
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- María Josefa Muñoz Cárdenas
- hace 8 años
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1 PCR en Tiempo Real y su aplicación n en la Enfermedad de Carrión Sofía Romero Mederos
2 PRUEBAS DE CONFIRMACION DETECCION DE BARTONELLA EN FROTIS. GIEMSA O WRIGHT CULTIVO PCR
3 CULTIVO GOLD STANDARD
4 TRANSMISSION VECTOR: Lutzomyia verrucarum? Solo en regiones endémicas INCUBACION: 2-3 semanas
5 PCR CONVENTIONAL
6 PCR CITRATE SYNTHASE 379 bp
7 La foto de la izquierda es una gota gruesa de un cultivo de Bartonella bacilliformis a los 5 días. La foto de la derecha muestra el extendido del mismo cultivo. Coloración de Giemsa.
8 RESULTADOS DE PCR CONVENCIONAL # de Lutzomyia VOLUMEN DE SANGRE RESULTADO DE PCR 1.2 l NEGATIVO 2.4 l NEGATIVO 3.6 l POSITIVO 4.8 l POSITIVO 5 1. l POSITIVO 1 2. l POSITIVO.2 l NEGATIVO 1. l POSITIVO
9 CORRELACION DE LOS CASOS DE BARTONELOSIS CON LA DISTRIBUCION DE Lutzomyia verrucarum Casos Lutzomyia verrucarum
10 78 ' 9 ' Mapa del área del estudio mostrando los pueblos de Choquechaca, Cullashpampa, Yuracoto and Caraz. La línea roja representa la carretera principal.
11 PCR EN TIEMPO REAL USUHS/AFIP
12 Detección de DNA con SYBR Green I Dye El colorante libre emite muy poca fluorescencia Alinamiento de los primers La fluorescencia aumenta con cada enlace de DNA. Fluorescencia es observada en tiempo real.
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14 Fundamento del Monitoreo de PCR con el Sistema LightCycler Comparación con termocicladores convencionales Ventajas CUANTIFICACION MAS RAPIDO MAS FACIL
15 PRIMERS Los primers se diseñan de la siguiente manera: Se usa un programa para alinear cepas conocidas de preferencia en el Banco de Genes (GeneBanK). El programa ClustalW Multiple Sequence Alignments esta disponible en la web y es fácil de usar. Se debe alinear un promedio de 8-15 cepas y luego compararlas se escoge una que sea lo mas representativa y esa se le compara la variabilidad ante otras especies Los primers luego son diseñados usando el programa TaqMan Probe/Primer Data. Ejm: BBF1 tcgtcttatgggcttcggc BBR1 acgtcttttggacggtactt
16 CONTROLES NEGATIVOS Se uso controles negativos: Sangre humana Flebotominos de otras especies Anopheles Cepas de otras especies: Ejm. B. quintana, B. alsatica, B. clarridgeiae, B. doshiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. henselae, B. peromysci, B. talpae, B. taylorii, B. tribocorum, B. vinsonii, B. vinsonni subsp. Berkhoffi, B. vinsonni subsp. vinsonni
17 POOLES NEGATIVOS Lutzomyia verrucarum Lutzomyia longipalpis Phlebotomus papatasi Anopheles sp.
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19 1bp LADDER HOSP8-29 POOL8 NTC HOSP8-29 ANOPHELES P.PAPATOSI L.LONG. L.V SPIKED.2ul
20 Agilent 21 bioanalyzer Esta plataforma esta basada en análisis de micro fluidos para el estudio de DNA, RNA, proteínas y células. Primer instrumento basado en tecnología de lab-on-a-chip el Agilent 21 bioanalyzer a demostrado ser una excelente alternativa para la técnica de electroforesis; rápida, automatizada, alta calidad digital en vez de subjetiva, asociada con geles.
21 AGILENT (GEL EN UN CHIP)
22 NEW PRIMERS 9-2-3
23 NTC NTC NEGPOOL2 SANDI HOSP8-29 NEGPOOL2 SANDI HOSP8-29 SET1 SET2 SET4 NTC HOSP8-29 SANDI NEGPOOL2 NTC HOSP8-29 SANDI NEGPOOL2 BBF1-R1?
24 OPTIMIZACION DE LOS NUEVOS PRIMERS SET 3 BB511-BB586R
25 NUEVAS SONDAS BB2-23 BB /21/3!!!
26 PROBE OPTIMIZATION
27 PRIMER SET 2 1 ttatatcgat ggagatgaag gaatattact ttaccacgga tattctattg accaattagc 61 tgaaaatgga gattttcttg aaacatgcta ccttttgctt tatggtgagt tgccaaacaa 121 acaacaaaaa atagattttg atcgctgtat tatgcggcat acaatggtgc atgaacaatt 181 tgcacgcttc ttccacggat ttcgtcgcga ttctcatcct atggctgtta tggtcgcttg 241 tcttggtgct atgtctgcat tttatcatga ctctattaat attacagatc ctcaacagag 31 aatgattgcc tctattcgcc ttatctcaaa ggttccaact cttgctgcta tggcatataa 361 atatagtatt gggcaacctt ttgtttatcc acgtaatgac cttaattacg ctacaaattt 421 tcttcatatg tgcttctctg ttccttgtga agaacacaaa attagccctg ttattgctcg 481 agctatggat cgaatcttta ctcttcatgc agatcatgaa caaaatgcat ctacgtcaac 541 agtacgcctt gcaggttcat caggagctaa tccgtatgca tgtattgcag caggtgttgc 61 atgcctttgg ggaccagctc atggtggagc taatgaagca tgtctaaaaa tgctacaaga 661 aataggttct gttaaaaaaa ttcctgaatt tattgcgcgt gcaaaagata aaaatgatcc 721 ttttcgtctt atgggcttcg gccacagagt ctacaaaaat tatgatccac gtgcaaaaat 781 tatgcagaaa acctgccatg aagttttaca agagctcaac attcaagatg acccacttct 841 tgatatagcg atggagcttg aacacatcgc tctgaatgat gaatatttca tcaacaaaaa 91 gctttatcct Primer BB175 acaatt tgcacgcttc ttcca Primer BB249R tggtcgcttg tcttggtgc accagcgaac agaaccacg PROBE BB2 23 6FAMcgt cgc gat tct cat cct atg gct gtttamra 75 bp products
28 DISTINTAS CONCENTRACIONES
29 LOD 3/3 RUN TUBE21 BROKE, TRASFERRED SAMPLE TO NEW TUBE 1fg!
30 USING 1uM BB2-23 PROBE BARTONELLA STRAINS
31 FIELD SAMPLES!!!
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34 UNFED NEGATIVE POOLS
35 GRIECO 2 GRIECO 1 LAWYER 3 LAWYER 2 LAWYER 1 B.vinsonii purif. B.vinsonii SANDI (+) NTC LADDER CONVENTIONAL PCR 781P, 1137N PRIMERS 379 bp
36 SEQUENCE RESULTS FOR GRIECO WITH BHCS PRIMERS Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi gb AC Homo sapiens chromosome 3 clone e-128 gi gb AC Homo sapiens chromosome 3 clone e-128 gi gb AY Bartonella chomelii citrate synt gi gb L BAOGLTA Bartonella henselae citrate s gi gb AF AF Bartonella sp. pb18975nm gi gb AY Zaglossus bruijni recombination gi gb AF Tachyglossus aculeatus recombina gi gb AC Oryza sativa chromosome 3 BAC cl gi emb AL Listeria innocua Clip11262 comp gi dbj AK Oryza sativa (japonica cultivar gi gb AE Leptospira interrogans serovar l gi gb AC Oryza sativa (japonica cultivar gi dbj AK Oryza sativa (japonica cultivar gi dbj AK Oryza sativa (japonica cultivar gi gb AC Homo sapiens BAC clone RP11-395I HUMAN CHROMOSOME 3??
37 EXPECTED RESULTS Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi emb Z721.1 BBCSLA63 B.bacilliformis glta gene e-36 gi emb AJ BSP Bartonella schoenbuchii e-14 gi emb AJ BSC Bartonella schoenbuche e-14 gi emb AJ BSP Bartonella schoenbuchii e-12 gi emb AJ BSC Bartonella schoenbuche e-12 gi emb AJ BSC Bartonella schoenbuche e-12 gi emb AJ BSC Bartonella schoenbuche e-12 gi emb Z722.1 BSCSC1PHY Bartonella sp. glta gene e-9 gi emb Z719.1 BSCSC4PHY Bartonella sp. glta gene e-9 gi emb Z718.1 BSCSC5RAT Bartonella sp. glta gene e-9 gi emb Z711.1 BSCSRPHY2 Bartonella sp. glta gene e-9 gi emb AJ BSP Bartonella schoenbuchii e-9 gi emb AJ BSP Bartonella schoenbuchii e-9 gi emb Z72.1 BSCSC7RAT Bartonella sp. glta gene e-9 gi emb Z79.1 BECSF9251 B.elizabethae glta gene ( e-9 gi gb AF AF17691 Bartonella koehlerae citr e-8 gi emb Z715.1 BVCSBAKER B.vinsonii glta gene (str e-7 gi gb AF AF Bartonella henselae subs e-7 gi emb Z717.1 BDCSR18 B.doshiae glta gene (strain e-7 gi emb Z716.1 BGCSV2 B.grahamii glta gene (strain e-7 gi gb AY Bartonella quintana citrate synt e-5 gi emb Z714.1 BQCSFULLR B.quintana glta gene (str e-5 gi gb AF AF Bartonella vinsonii subsp e-5 gi emb Z71.1 BSCSRPHY1 Bartonella sp. glta gene gi emb Z713.1 BTCSM6 B.taylorii glta gene (strain
38 SENSITIVIDAD : 1% SPECIFICIDAD: 91.11% 4 pooles de Lutzomyias negativas, 2 POS 15 DNA humano, 2 falsos positivos RESULTADO 472 Muestras procesadas Porcentaje de infección 2.75%
39 SEASONAL DISTRIBUTION OF NATURAL INFECTED SAND FLIES # OF POOLS M ay -9 Ju 9 n99 Ju la u 99 gs 99 ep -9 O 9 ct -9 N 9 ov D 99 ec -9 Ja 9 n Fe b M ar - Ap rm ay - Ju n Ju la ug S e p O ct - N ov D ec - 78 Distribución estacional de todos los pooles trabajados en los cuatro pueblos del Perú. El área sombreada representa los pooles positivos al PCR.
40 PCR RESULTS OF HOUSE A 6 # OF POOLS PCR RESULTS OF HOUSE I M ay -9 Ju 9 n9 Ju 9 l- 9 Au 9 gse 9 9 p9 Oc 9 t- 9 N 9 ov D 99 ec -9 Ja 9 n Fe b M ar - A pr - M ay - Ju n Ju l- Au g Se p O ct - N ov De c # OF POOL S 6 PCR RESULTS OF HOUSE G n Ju l l t r r- y - un t Ju Au g S ep O c N o v D ec Ja n Fe b Ma J u A u g Se p O c Ap Ma J M ay -9 Ju 9 n99 Ju l- 9 Au 9 gse 99 p9 O 9 ct -9 N 9 ov D 99 ec -9 Ja 9 n Fe b M ar - Ap r- M ay - Ju n Ju l- Au gse p O ct - N ov D ec - # OF POOLS Distribución estacional de los pooles infectados de las casas positivas. Pooles positivos fueron encontrados en todas las casas en muestras de Marzo 2.
41 Cuadro de Resultados House letter Type of house/place Number of pools tested Positives House A Patient/Choquechaca (2.33%) House B Non-patient/Choquechaca 26 (%) House C Patient/Caraz City 1 (%) House D Non-patient/Caraz City 2 (%) House G Patient/Cullashpampa 39 3 (7.69%) House H Non-patient/Cullashpampa (%) House I Patient/Yuracoto 29 2 (6.89%) House J Non-patient/Yuracoto 15 (%) House K Non-patient/Cullashpampa 8 (%)
42 CONCLUSIONES El Set de Primers 2 tiene muy buena sensitividad y no ha mostrado reacción cruzada con genes de especies de Lutzomyias, pero no es una buena alternativa para el uso con muestras humanas. Un set de primers basados en el gen de rivoflavin deberá ser diseñado para PCR Tiempo Real para confirmar cualquier positivo dudoso. Existe literatura que afirma que este gen no produce reacción cruzada con DNA humano.
43 Taqman 77 PCR Tiempo Real PCR en tiempo real es una de la pruebas mas sensible y específica para el análisis de la expresión de RNA o cuantificación de DNA.
44 PREGUNTAS?
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