UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS HUMANAS MICROBIOLOGÍA LABORATORIO N 1 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

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1 UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS HUMANAS MICROBIOLOGÍA LABORATORIO N 1 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA PRÁCTICAS A DESARROLLAR: 1. BIOSEGURIDAD Y RECONOCIMIENTO DE MATERIALES DE USO COMÚN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. 2. MANEJO DEL MICROSCOPIO, TECNICAS PARA HACER PREPARACIONES MICROSCOPICAS 3. DISTRIBUCION DE MICROORGANISMOS EN AMBIENTES NATURALES. INTRODUCCIÓN El laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se manejan y examinan microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado. Cuando manejamos cualquier tipo de muestra debemos evitar que microorganismos ajenos a nuestros cultivos y presentes en el ambiente se introduzcan en ellos contaminándolos, o que los microorganismos de la muestra nos contaminen a nosotros. Por ello trabajaremos siempre en condiciones de esterilidad. En el laboratorio de microbiología encontramos estas condiciones bien en campanas de seguridad biológica o bien en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas. Todos los procedimientos que se lleven a cabo dentro del laboratorio de microbiología deben estar enmarcados dentro del concepto de bioseguridad. La bioseguridad ha sido definida por el Ministerio de Protección Social como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atentes contra la salud y seguridad de trabajadores de la salud, pacientes, visitantes y el medio ambiente. (Manual de conductas básicas en bioseguridad. Ministerio de Salud. 1997). Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución Por lo anterior es importante cumplir con los siguientes requisitos básicos: Restringir la presencia de los microorganismos a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en pile, cabello, aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras. Por otro lado los seres vivos presentan variedad en tamaño, forma, estructura, función, etc. Con relación al tamaño éste varía, el ojo humano logra identificar objetos hasta de 200 micras, por lo que se hace necesario recurrir a instrumentos ópticos que faciliten la observación de objetos de menor tamaño, este instrumento es el microscopio, que consiste en juegos de lentes que agrandan la imagen. El microscopio se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la "Accademia dei Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia. A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A principios de los años 30 se habia alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo existia un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares ( núcleo, mitochondria... etc.).

2 El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fué el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM). Al principio, el microscopio surgió como una lente que agranda la imagen (lupa), lo que dio origen al microscopio óptico compuesto, que consta de juego de lentes (parte óptica), sostenida por estructuras metálicas (parte mecánica). Para observar los objetos a través del microscopio óptico compuesto, es necesario colocarlos sobre una laminilla de vidrio (Porta objetos) y generalmente se le coloca otra laminilla de vidrio más delgada (Cubre objetos); en esta forma se obtiene la preparación microscópica; la que puede durar poco tiempo (preparación temporal), o puede ser guardada (preparación permanente), lo que nos da la clasificación de preparaciones de acuerdo a su duración. La mayoría de los microorganismos se encentran distribuidos en una gran variedad de hábitats y se encuentran formando poblaciones mixtas con otros microorganismos, los cultivos de estas mezclas se denominan cultivos mixtos. La amplia distribución de los microorganismos puede ser demostrada exponiendo medios de cultivos estériles al contacto con el medio ambiente y diferentes superficies, en estos medios los microorganismos crecen formando colonias. El aspecto de las colonias, el tamaño, su color, etc., permiten diferenciar varios tipos de bacterias, aunque son propiedades muy generales influenciadas por las condiciones en que se realice el cultivo. OBJETIVOS Reconocer los principios básicos de Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología. Identificar todas aquellas acciones que conduzcan a la prevención, control, reducción y eliminación de los factores de riesgo dentro de las actividades programadas. Reconocer y poner en práctica el uso adecuado de los equipos y materiales de uso frecuente en el laboratorio de Microbiología. Identificar las partes ópticas y mecánicas del microscopio. Realizar preparaciones microscópicas temporales. Elaborar adecuadamente sus reportes de laboratorio. Reconocer el uso adecuado de cada una de las partes del microscopio óptico compuesto. Demostrar la presencia de microorganismos en ambientes naturales visualizando su crecimiento en medios de cultivo. METODOLOGÍA 1. Charla de Bioseguridad 2. Reconocimiento de materiales y equipos en el laboratorio de microbiología 3. Se darán los lineamientos generales para el uso del microscopio, así como para hacer preparaciones microscópicas y efectuar el reporte de laboratorio. Se tomarán bacterianas ambientales teniendo en cuentan las indicaciones del docente. 4. Es importante conocer los materiales y equipos que se utilizan con frecuencia en el laboratorio de microbiología. El estudiante debe familiarizarse con su nombre, su importancia en el desarrollo de experimentos, su utilidad y su correcto manejo y funcionamiento. EQUIPOS Y MATERIALES Autoclave Horno Incubadoras Baño serológico Cajas de Petri estériles con Agar Nutritivo Escobillones de algodón estéril (copitos estériles)* Pipetas Nevera Reactivos químicos Porta Objetos y Cubre Objetos Papel impreso (periódico) con letra pequeña* Tijeras y hoja de afeitar nueva* Papel y lápiz* Lápiz de colores* Lana* o algodón de colores* Microscopio Mechero Bunsen Asas bacteriológicas Tubos de ensayo Corcho* Polen de flor * Polvillo de ala de mariposa* Jabón antibacterial* Rollo de papel secante (toallas de papel de cocina)* Alcohol antiséptico* Encendedor* Cinta pegante de papel* El material marcado con asterisco (*) lo aportan los estudiantes

3 1. NORMAS BÁSICAS DE BIOSEGURIDAD EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Hay que trabajar con calma y concentración Es imprescindible en todo momento el uso del equipo de protección personal EPP (batas, guantes, polainas, gorro, tapabocas). Al iniciar y finalizar la práctica, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón El lugar de trabajo siempre debe estar limpio y ordenado Está prohibido comer, beber y fumar en el laboratorio Cualquier material que no se utilice en l realización de la práctica debe estar apartado del lugar de trabajo Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama del mechero No se debe pipetear nunca con la boca Para deshacernos del material contaminado utilizaremos siempre los recipientes adecuados Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio Asegúrese de conocer el procedimiento antes de realizar cualquier experimento, si tiene dudas, no dude en consultar a su instructor Todos los medios de cultivo deben ser transportados en posición vertical y almacenados en igual posición en sus respectivos receptores Todos los materiales usados durante la práctica deben ser retornados a los lugares de donde fueron obtenidos Marque en forma legible los tubos y cajas de Petri que se vayan a usar. 2. MICROSCOPIO PARTES Y FUNCION: Se explicarán las partes ópticas y mecánicas del microscopio PARTE OPTICA. Objetivos, Oculares, Diafragma y condensadores PARTES MECANICAS: El pie, La platina, Carro, uñas o ganchos, el tubo, tornillos macrometrico y micrométricos 2.1. ENFOQUE DEL MICROSCOPIO 1. Baje completamente la platina del microscopio. 2. Haciendo uso del mecanismo del revólver, coloque frente a la preparación el objetivo de menor aumento (seco débil 10 X). 3. Coloque la preparación microscópica sobre la platina sujetándola con las pinzas del carro y centre la preparación haciendo uso de los tornillos del carro. 4. Regule la luz mediante el uso del mecanismo del diafragma. 5. Haciendo uso del tornillo macrométrico suba al máximo la preparación hasta que encuentre tope sin observar por los oculares. 6. Observando a través del ocular, accione el tornillo macrométrico hasta que visualice la imagen en el campo microscópico. 7. Una vez enfocada la imagen, afine el enfoque microscópico, haciendo uso del tornillo micrométrico. 8. Si desea mayor detalle, cambie de aumento rotando el mecanismo del revolver a un objetivo que le proporcione el aumento deseado, corrigiendo el enfoque de imagen moviendo el tornillo micrométrico, y graduando la intensidad de luz con el diafragma. 9. Después de haber realizado la observación, se limpian las lentes con papel limpia lentes, se coloca el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, se baja la platina, se desconecta y se tapa. El microscopio queda listo para la próxima observación.

4 PREPARACIONES MICROSCOPICAS TEMPORALES PREPARACIÓN DE CORCHO: Haga varios cortes delgados de corcho utilizando la hoja de afeitar nueva y escoja el más fino. En un porta objetos coloque una gota de agua destilada y coloque en él el pedazo de corcho seleccionado, y colóquele un cubre objetos, procurando que no lo quede burbujas de aire. Proceda a su observación microscópica. Haga su esquema correspondiente utilizando los objetivos seco débil y seco fuerte LETRA IMPRESA: Busque en el periódico la letra e más pequeña que encuentre, córtela y colóquela en un porta objetos que tenga una gota de agua destilada, cúbrala con el cubre objetos y obsérvela en el microscopio usando el objetivo seco débil y seco fuerte y haga sus esquemas. Haga los dibujos comparativos de la imagen que observa con sus ojos y de la imagen vista a través del microscopio. Qué diferencias encuentra entre la observación microscópica y la observación a simple vista? Cuál es la posición de la letra observada en el microscopio? Una vez terminado este ejercicio, enfoque nuevamente la letra con el objetivo de menor aumento, y observando a través del microscopio, mueva el carro hacia delante. En qué dirección se mueve la letra? Ahora mueva el carro o la lámina portaobjetos hacia atrás Hacia dónde se mueve la imagen? Como es el desplazamiento de la imagen con relación al movimiento de la lámina portaobjetos? 1.3. FIBRA DE LANA O ALGODÓN : Coloca varias fibras de algodón o lana de diferentes colores sobre un portaobjetos. Encontrará en el sitio varias de estas superpuestas, cualquiera puede visualizarse cambiando el nivel del enfoque. Entonces algunas se verán borrosas. Determine los niveles de las fibras coloreadas cambiando el enfoque GRANOS DE POLEN: Coloque granos de polen del androceo de una flor en un portaobjetos, con ayuda de un gotero ponga una gota de agua y observe al microscopio. Es necesario colocar el cubreobjetos. Haga observaciones de polen de diferentes clases de flores. Esquematice sus observaciones. Cuantas veces está aumentada la imagen que observa? 1.5. POLVILLO DE ALA DE MARIPOSA: Espolvoree el ala de la mariposa sobre un portaobjetos con golpes suaves para no maltratar la mariposa, agregue una gota de agua y coloque el cubreobjetos, observe y esquematice. 3. DISTRIBUCION DE MICROORGANISMOS EN AMBIENTES NATURALES Teniendo en cuenta las indicaciones del docente, se inocularán las cajas de Petri con agar nutritivo a partir de las siguientes fuentes: Microorganismos del aire: deje abierta las cajas de Petri por 10 minutos, luego cierre y selle, marcar las cajas, incubar a 37 C por 24 horas invirtiendo las cajas, observar las colonias obtenidas después del tiempo indicado, describir forma de las colonias, color, tamaño, textura y elevación. Microorganismos de la superficie de trabajo: Con un escobillón estéril frotar la superficie de trabajo, luego hacer estrías sobre el agar nutritivo abriendo solo un poco la caja al lado del mechero,

5 luego cierre y selle, marcar las cajas, incubar a 37 C por 24 horas invirtiendo las cajas. Describa igual que para microorganismos del aire. Microorganismos de mucosas y piel: Con un escobillón estéril frotar las superficie corporales (mucosas nasal, pabellón de la oreja, cuello, mucosa oral, cuero cabelludo, piel), luego inocule haciendo estrías sobre el agar nutritivo abriendo solo un poco la caja al lado del mechero, luego cierre y selle, marcar las cajas, incubar a 37 C por 24 horas invirtiendo las cajas. Describa igual que para microorganismos del aire. PREGUNTAS DE CONSULTA 1. Cuáles son los poderes del microscopio y como pudo comprobarlos en su trabajo práctico. 2. Por qué es importante utilizar el microscopio en el estudio de la biología? 3. Qué relación existe entre el poder de aumento de los objetivos y el área del campo visual? 4. Explique porque en la medida en que aumenta el objetivo disminuye el número de alas de mariposa y granos de polen observados 5. Consulte los tipos de microscopios y sus características principales 6. Cuáles pueden ser las causas de daños de los lentes del microscopio? 7. Por qué la imagen aparece invertida en el microscopio compuesto? 8. Cite tres ejemplos de impactos positivos y negativos de los microorganismos 9. Que características les permiten a los microorganismos tener una amplia distribución. ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA 1. Consultar la función de los materiales de laboratorio mencionados en la práctica #1 adiciona aquellos que no fueron colocados en el listado y realiza los esquemas correspondientes. 2. Señala en el siguiente dibujo al menos 10 de los errores que se cometen en este laboratorio y explica cual es el error y qué se deber hacer para corregirlo

6 REFERENCIAS: PRACTICA_1_NORMAS_INSTRUMENTAL.pdf