UNIVERSIDAD DE COSTA RICA. B-233 Laboratorio de Botánica General

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE COSTA RICA B-233 Laboratorio de Botánica General PRÁCTICA 1 USO DEL MICROSCOPIO DE LUZ Y PREPARACIÓN DE CORTES DE TEJIDOS El microscopio de luz es una herramienta muy importante para el trabajo del laboratorio de Botánica. Varias prácticas del presente curso, entre ellas la observación de estructuras anatómicas, tejidos vegetales y componentes de las células de las plantas, requieren un manejo apropiado del microscopio por parte del estudiante. Por otro lado, el microscopio es un equipo óptico sensible y costoso, por lo que es necesario conocerlo y utilizarlo apropiadamente para evitar accidentes o manejos inadecuados que lo deterioren o dañen. Aparte del buen manejo del microscopio, es importante desarrollar habilidades en la preparación del material para la observación correcta de las estructuras de interés. Los cortes de tejidos o estructuras de plantas para la observación en el microscopio deben ser lo más delgadas posible, de tal forma que permita el paso de la luz para poder visualizar los detalles. En algunos casos, la utilización de tinciones particulares es útil para contrastar y hacer visibles algunas estructuras. Es importante la aplicación correcta de las tinciones en la preparación para evitar excesos que dificulten la observación o el derrame sobre el equipo. OBJETIVOS Al finalizar el laboratorio el estudiante será capaz de: 1. Identificar correctamente las partes que componen el microscopio de luz y su uso apropiado. 2. Enfocar adecuadamente las preparaciones utilizando el macro- y micrométrico. 3. Poner en práctica algunas técnicas básicas para realizar cortes de preparaciones. 4. Dejar el equipo en posición de descanso. MATERIALES Y REACTIVOS Muestras de: Peciolos de platanilla (Heliconia sp.), mantenerlas en agua. Tallos frescos de begonia (Begonia sp.) o china (Impatiens sp.), mantenerlas en agua. Materiales: Cajas de Petri Trozos de estereofón Papel absorbente Navajillas de afeitar afiladas 1

2 Reactivos: Etanol 50% Solución 1:1 glicerina y agua destilada (50 ml) Toluidina azul 0,5% (250 ml) PROCEDIMIENTO EL MICROSCOPIO A. Familiaricese con el microscopio Repase los nombres y función de las principales partes del microscopio utilizando como guía el siguiente diagrama. En el equipo a su disposición, identifique las partes correspondientes. Si desconoce la función exacta de alguna parte consulte a algunos de los asistentes del laboratorio. B. Ajustes Visuales iniciales Al comenzar a utilizar el microscopio es necesario realizar dos ajustes básicos relacionados con la visión particular del usuario: 1. La distancia interpupilar y 2. La diferencia de visión entre ojos (ambliopía). 2

3 Ajuste los oculares a su distancia interpupilar personal hasta observar un campo de luz nítido, sin sombras o traslape de los lentes y que permitan una visión confortable. Recuerde que no es necesario pegar completamente los ojos a los oculares, la observación se debe hacer a una distancia de aprox. 1-2 cm del ocular. Incorrecto Incorrecto Correcto Para realizar la prueba de enfoque, corte un pedacito de papel (1 x 1 cm) y escriba una letra A con lápiz sobre el mismo, colóquelo sobre un porta-objetos y cúbralo. Colóquelo en la platina. Enfoque la muestra inicialmente con el objetivo de menor potencia (4X). Si no logra una imagen nítida es porque probablemente requiere ajuste por diferencias de visión entre su ojo derecho y el izquierdo (ambliopía). Ajuste por Ambliopía: busque el ocular que posee el anillo de ajuste. Para realizar la corrección, mantenga cerrado el ojo que corresponde al ocular con el anillo de ajuste y observe a través del otro ocular. Ahora, ajuste la nitidez de la imagen con el macrométrico. Repita lo anterior, pero ahora observando sólo a través del ocular ajustable y moviendo únicamente el anillo en una u otra dirección hasta que la imagen sea nítida (mantenga el otro ojo cerrado). Ahora, observe con ambos ojos y la imagen deberá aparecer enfocada. De lo contrario, repita el procedimiento. C. Uso del micrométrico (observación de planos diferentes o profundidad de la preparación) Utilizando la preparación anterior, cambie al objetivo 10X y enfoque un área particular en el centro del campo visual utilizando el tornillo micrométrico. Note que hay partes alrededor del área seleccionada de la preparación que quedan enfocadas mientras otras no, esto se debe a que están en diferentes planos (unas más arriba o más abajo que otras). Gire lentamente el micrométrico hacia atrás (en dirección hacia usted) hasta que toda la imagen quede fuera de foco. Ahora, comience a girar despacio el micrométrico hacia el lado contrario y observe cómo ciertas áreas de la preparación van enfocándose, y conforme se sigue rotando el micrométrico estas áreas quedan fuera de foco y otras se tornan nítidas. Al mover el micrométrico se van visualizando diferentes planos (tridimensionalidad) de la preparación. Repita lo anterior con el objetivo 40X 3

4 D. La magnificación total Es el número de veces en que se ha aumentado la imagen original. Se calcula multiplicando la magnificación del objetivo (e.g., 4x, 10x, 40x) por la magnificación del ocular (usualmente 10X). Es importante tomar nota de la magnificación al realizar los dibujos de las preparaciones para tener una idea del tamaño relativo de las estructuras que se observaron. Determine la magnificación visual mínima y máxima de su microscopio. PREPARACIÓN DE CORTES A MANO Y TINCIÓN A. Corte transversal Tome un trocito (2 cm) del tallo de begonia o china y sujételo de la forma indicada en el diagrama 1. Si la muestra es muy pequeña, utilice un sujetador de estereofón duro para evitar cortarse los dedos con la navaja (DIAGRAMA 1). Sujete la muestra firmemente y haga un primer corte en ángulo recto para producir una superficie plana y limpia. Remoje la navaja en agua o etanol antes de realizar el corte. Mueva la navaja hacia usted suavemente. Es preferible que la muestra esté humedecida para facilitar el corte. muestra DIAGRAMA 1: modo de sujetar una muestra para un corte transversal (izq.) o longitudinal (der.) Realice varios cortes (5 a 10) lo más delgado posible y colóquelos (utilizando un par de pinzas finas) sin romperlos en una caja de Petri o porta-objetos con varias gotas de Etanol 50%. Deje remojar los cortes en Etanol por 3-4 minutos. 4

5 Transfiera tres de los mejores cortes a una nueva caja de Petri o sobre un porta-objetos conteniendo unas 3-4 gotas de solución de tinción de Toluidina azul 0,5%. Deje reposar por 5 minutos. Mientras se tiñen los cortes anteriores, utilice uno de los cortes restantes que están en Etanol y móntelo sobre un porta objetos, agréguele 1 gota de 1:1 glicerina:agua destilada y cúbralo cuidadosamente con un cubreobjetos. Trabaje sobre un pedazo de papel absorbente sobre la mesa y limpie el exceso de tinción que se sale de los bordes del portaobjetos. Observe al microscopio la preparación y note los detalles de las células en un tejido que no está teñido. Luego, extraiga cuidadosamente los cortes de la tinción utilizando la punta de la aguja o las puntas de las pinzas y póngalos a remojar en agua por 1-2 min para eliminar el exceso de tinción (esto lo puede hacer sobre un porta-objetos con algunas gotas de agua) Coloque el corte sobre un portaobjetos y observe al microscopio sin cubrirlo con el objetivo 4X y luego con el objetivo 10X (únicamente). La Toluidina azul tiñe las paredes celulares de color azul-verdoso o verde. Compare con las muestras no teñidas del punto 6. Con el micrométrico observe los detalles tridimensionales de la preparación. Ahora quite la muestra del microscopio y sobre un pedazo de papel absorbente en la mesa de trabajo, agréguele una gota de 1:1 glicerina-agua destilada. Ponga un cubre-objetos, limpie los excesos y obsérvela de nuevo en el microscopio. Note las diferencias con las preparaciones anteriores. Repita todo el procedimiento anterior con cortes de peciolo de platanilla. PRECAUCIÓN: Si el líquido de la tinción se sale fuera del cubre-objetos séquelo con papel absorbente. NO coloque preparaciones con exceso de solución en el microscopio porque puede derramarse sobre sus partes. Si ocurre limpie inmediatamente. B. Corte longitudinal Utilizando la misma muestra de tallo y peciolo haga ahora varios cortes longitudinales (a lo largo), uno en la parte interna central del tallo y otro hacia la periferia siguiendo las indicaciones anteriores (DIAGRAMA 2). Observe las diferencias en la forma de las células con respecto al corte transversal anterior. 5

6 muestra estereofón DIAGRAMA 2. Uso de un soporte de estereofón para realizar cortes manuales POSICIÓN DE DESCANSO DEL MICROSCOPIO Al finalizar la sesión de laboratorio, limpie con papel absorbente la platina del microscopio y déjelo en posición de descanso de la siguiente forma: Baje la platina a su posición más inferior e interna (hacia adentro) Seleccione el objetivo menor (4X) Reduzca al mínimo la intensidad de la lámpara de luz y apáguela Junte los oculares Recoja el cable y enróllelo alrededor de la cabeza del microscopio RECORDATORIO: a partir de esta práctica es responsabilidad de los estudiantes dejar el equipo utilizado limpio y en la posición de descanso después de cada laboratorio. 6

7 Historia breve del primer microscopio Como otras invenciones, es difícil atribuir el invento del microscopio a una sola persona. Se dice que, en el siglo XIII, Salvino D Armate (italiano) produjo el primer lente de vidrio. Posteriormente, durante la década de 1590s, los holandeses Zacharias y su padre Hans Jansen crearon lo que puede ser el precursor del microscopio actual al poner varios lentes en un tubo. Sin embargo, la magnificación no era grande (ca. 9x) y la imagen borrosa. Fue otro holandés, Anton van Leewenhoek ( ) quien mejoró la eficiencia de los microscopios al desarrollar mejores lentes pulidos y alcanzar una magnificación de hasta 270X. Sin embargo, la apariencia de su microscopio distaba mucho de lo que conocemos actualmente. Con ese microscopio rudimentario, van Leewenhoek, fue el primero en observar y describir bacterias y levaduras, espermatozoides, el flujo de sangre en capilares y realizar estudios pioneros en microbiología. Aunque no fue un científico de formación, sino más bien proveniente de una familia de comerciantes, sus descubrimientos y aportes le valieron ser considerado como el Padre de la Microbiología. 7