Retos de la Ingeniería Genética del Banano en el Ecuador: Resistencia a la Sigatoka Negra y otras Aplicaciones.

Transcripción

1 Retos de la Ingeniería Genética del Banano en el Ecuador: Resistencia a la Sigatoka Negra y otras Aplicaciones. Efrén Santos, Ph.D. CIBE-ESPOL 29 octubre 2012

2 Qué son los OGMs? Un organismo genéticamente modificado (OGM), comunmente denominado transgénico, es aquel cuya información genética ha sido alterada mediante técnicas de ingeniería genética (tecnología recombinante), con la adición de genes (ADN) de otro organismo, normalmente de otra especie.

3 MAIZ BT Tabaco, tomate, algodón, papa, maíz, canola, soya y arroz

4 Golden rice

5 Ventajas de alimentos genéticamente modificados Reduce propiedades alérgicas en ciertos alimentos Incrementode la producción: mayor tamañoynúmerode semillas. Incremento en el sabor y textura. Reducción de enfermedades y plagas. Reducción del uso de agroquímicos. Incremento del valor nutricional de los alimentos.

6 Aluminum toxicity roduction of organics acids and their xudation from the roots to the soil to ombine aluminum forming chelatedspecies nd eliminated their toxicity allowing xtraction of phosphate and iron. omato and papaya: transformed with citrate ynthasegene. Secretion five times more of citrate from their roots. Tolerance to Aluminum.

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11 Plantas cisgénicas Plantas cisgénicas.la introducción de genes en una planta, con sus secuencias regulatorias originales, de una planta compatible de cruzamiento o de la misma planta (Schouten y Jacobsen, 2006). Transformación genética en banano ADN insertado va a estar confinado en las plantas transformadas ya que las plantas de banano son estériles por lo que no habría fuga de los genes insertados.

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13 Expresión génica roceso en el cual la información en una secuencia de ADN de un gen es usado para producir un ARN o una proteína, en donde participan la transcripción y la traducción (para proteínas). Promotor Gen Proteína mrna DNA + 1 TATA-box Sitio de Inicio de la Transcripción

14 Pseudotallo Actividad alta otores de anano nados con reportero ciferasa Constitutivo Cormo, raíz Control (-) Actividad baja Barra = 1cm Clases de promotores: Constitutivos, regulados de acuerdo al desarrollo de la planta, tejido específico, inducibles (estrés biotico/abiotico)

15 Métodos de transformación genética en plantas Agrobacterium tumefaciens Biolística

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18 Cómo la ingeniería genética se puede utilizar para solucionar el problema de la sigatoka negra en banano? Insertandoen el genomade lasplantasde banano genes de resistencia a la sigatoka negra.

19 El mayor problema en la producción de banano y plátano en el Ecuador es el control del hongo causante de la enfermedad sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis). Puede ocasionar pérdidas de hasta el 50% en la cosecha. El uso de fungicidas para controlar la enfermedad puede ocasionar graves daños en el medio ambiente y en las personas (25-40% costos de producción).

20 El mejoramiento de banano por métodos convencionales es dificultoso debido a altos niveles de esterilidad, a la constitución genómica de los cultivares y a los largos períodos del ciclo de cultivo. Los pocos híbridos seleccionados son de alto rendimiento y resistentes a enfermedades pero usualmente pierden otras características deseadas a nivel de postcosecha como vida verde y maduración de la pulpa. Rosales y Pocasangre 2002

21 yecto de investigación financiado por SENESCYT: mplementación de métodos biotecnológicos en ejora genética del banano (Musaspp.) para esistencia a sigatoka negra (Mycosphaerellafijiensis)

22 plementación de biotecnologías para la generación de bananos con resistencia a la Sigatoka negra Permiso otorgado por el Gobierno Ecuatoriano (Presidencia de la República)

23 Modificación genética encia de sformación ética mediante dición de actividad gen reportero S. sencia de puntos les en presencia sustrato X-Gluc. Análisis histoquímico Células embriogénicas de banano

24 Regeneración en vitroplantas de banano modificadas genéticamente

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27 CaMV35S::LUC2 85-1::LUC2

28 Inoculación de Mycosphaerella fijiensis en condiciones controladas en variedades de banano resistentes y susceptibles a sigatoka negra. Hibridación substractiva por supresión Identificaciónde genes quese inducen durante la infección Genes candidatos de resistencia: quitinasa genes análogos de resistencia

29 Amplificación de genes candidatos a resistencia a sigatoka negra en diferentes variedades de banano y plátano con distintos niveles de resistencia a sigatoka negra. 28 variedades de banano y plátanos: 4 resistentes, 5 susceptibles, 12 tolerantes, 7 cultivares ecuatorianos(susceptibles) Genes % esión utta 4 a Yik ia-1 ia-2 ia-3 Guia Berlin bi Km5 Nivel de resistencia a SN Resistete Susceptible Tolerante Tolerante Tolerante Resistente Susceptible Resistente 6 Resistente Enano Susceptible a-17 Tolerante a-23 Tolerante -905 Tolerante -908 Tolerante v-215 Susceptible v-219 Susceptible Tolerante 3640 Tolerante 925 Tolerante P-39 Tolerante a-18 Tolerante Patucho rado Michel 1341 pb R S T T T S R R S T - M Quitinasa Análogos de resistencia, Miller et al RT-PCR Resistentes(50) Susceptibles(60) Tolerantes(50) Cultivares ECU (71) Resistentes(25) Susceptibles(40) Tolerantes(42) Cultivares ECU (29)

30 Hibridación substractiva por supresión Ensayo Aislamiento de ARN mensajero Extracción de ARN total SSH PCR de las colonias con los ESTs generados.

31 tein family expressed hionein like protein lase chloroplastic like Gen metabolismo funcion transcription and nuclear specific proteins metabolismo unknow metabolismo unknow osintesis de purinas y pirimidinas/sr protein /gen regulation transcription and nuclear specific proteins in like protein metabolismo epeat domain containing protein 2 like VI heat shock protein proteolipid sub unit of vacuoar H+ ATPase, partial pr 107 like r transcription factor like protein epeat domain containing protein 2 like ribulokinase precursor st chlorophyll ab binding protein/ abc transporter family ne s-transferase c-terminal domain containing protein ose pyrophorylase small sub unit reonine protein kinase r transcription factor like protein/musa balbisiana clone bac minata UDP-glucose pyrophosphorylase mrna transcription and nuclear specific proteins unknow stress related metabolismo metabolismo transcription and nuclear specific proteins transcription and nuclear specific proteins metabolismo unknow metabolismo metabolismo unknow metabolismo transcription and nuclear specific proteins unknow transcription and nuclear specific proteins metabolismo 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 3% 27% 9% 27% 33% METABOLÍSMO TRANSCRIPCIÓN Y PROTEINAS ESPECÍFICAS SECUENCIAS DESCONOCIDAS RELACIONADAS A ESTRÉS Light protein cct motif family metallothionein unknow beta amylase serine/sr protein chaperonin like ankyrin repeat kda class VI heat putative protein gpr 107 like zinc finger phosphoribulokinas chloroplast glutathione s- adp-glucose musa acuminata musa acuminata musa acuminata minata AAA group (IAA9) mrna ribulokinase precursor minata NBS LRR disease resistance protein minata NBS LRR disease resistance protein minata NBS LRR disease resistance protein transcription and nuclear specific proteins transcription and nuclear specific proteins unknow unknow genes de resistencia unknow genes de resistencia genes de resistencia

32 Escalpos(Scalps) Barraganete Williams Orito Morado Calcutta-4

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34 Regeneracion de plantas a partir de embrioides de Barraganete a las 10 semanas después de colocar los embrioides en el birreactor.

35 Conclusiones Protocolo estandarizado para producción de plantas de banano modificadas genéticamente. Colección de vitroplantas modificadas genéticamente. Genes candidatos de resistencia a sigatoka negra obtenidos. Suspensiones celulares embriogénicas obtenidas en diferentes cultivares de banano y plátano.

36 Perspectivas Aislamiento de gen completo y modificación genética con genes candidatos de resistencia en las variedades de banano y plátano. Evaluación de resistencia a sigatoka negra en condiciones controladas. Bananos cisgénicos mediante el uso de promotores de tejido específico o inducibles a la enfermedad. Utilización de tecnología desarrollada para mejorar banano y plátano para resistencia o tolerancia a estrés bióticos(fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 4) o abióticos(sequía, salinidad, etc). Biofortificación de folato.

37 Implementación de biotecnologías para la generación de bananos con resistencia a Sigatoka negra standarización transformación genética ediante Agrobacterium tumefaciens de spensiones celulares embriogénicas de anano. cación de genes candidatos de ciaa Sigatokanegra en Musa itinasas, genes análogos de cia, análisis de transcriptoma en des resistentes y susceptibles te SSH: hibridación sustractiva pro ón) Desarrollo de suspensiones celulares embriogénicas de cultivares de banano y plátano de Ecuador ( Orito, Barraganete, Dominico, Gros

38 Proceso Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

39 AGRADECIMIENTOS KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN