IX CONGRESO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS y V FORO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

Transcripción

1 Viabilidad de Trichinella spiralis en Carne de Cerdo Expuesta a Diferentes Condiciones Experimentales de Conservación 1 Medina, L. M. S. 1 Ramírez, A. A. 1 Pérez, T. E. 1 Pacheco, G. C 1 Ruvalcaba, B. S. 1 González, A. D. G. 2 De La Rosa, A. J. L. 3 Kühne,M. 1 Departamento de Salud Pública, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA), Departamento de Salud Pública, Las Agujas Nextipac, Zapopan Jalisco, México, msueml@yahoo.com. 2 Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE), Laboratorio de Helmintos Tisulares, Secretaría de Salud, México, D. F. Mx. jldelarosa@salud.gob.mx. 3 Escuela Superior de Medicina Veterinaria Hannover, Instituto para la Seguridad y Calidad de los alimentos, Hannover, Alemania Michael.Kuehne@tiho-hannover.de Resumen La triquinellosis es una enfermedad mundial zoonótica causada por larvas y adultos de parasito nematodo de Trichinella spiralis. La infección ocurre tanto en animales domésticos como en animales silvestres. La infección humana se adquiere por la ingestión de carne de cerdo infectada mal cocinada. De acuerdo a la regulación mexicana (NOM-SSA1-2004) la carne de cerdo deberá ser libre de Trichinella spiralis, no obstante la triquinoscopía no es obligatoria. El propósito del presente estudio fue evaluar la viabilidad de las larvas de triquina en carne de cerdo después de diferentes procesos de conservación, secado (60ºC y 57ºC por 24 h), refrigeración (0ºC y 4ºC), sazonado (dos productos comerciales), curado (solución curante 3%) y congelado (-18ºC, -20ºC). La carne fue obtenida de cerdos infectados experimentalmente. 3 cerdos fueron alimentados con músculo de rata contaminada (5000 larvas). Durante el periodo de engorda (aprox. 105 días) fueron analizadas muestras de suero para determinar anticuerpos específicos por ELISA. Al sacrificio se obtuvieron muestras de músculo que fueron analizadas por digestión artificial según la Guía reconocida para este fin. Después de los métodos de conservación la carne de cerdo fue digerida y las larvas contadas. Con el fin de asegurar la infectividad de la larva, se suministraron oralmente a varios ratones. Los resultados de este estudio apoyan la conclusión que el curado, sazonado y refrigeración no tienen un impacto relevante en la viabilidad de la larva, por su parte, congelado y secado son procedimientos que reducen de manera efectiva el riesgo a una infección por Trichinella spiralis. Palabras claves: Trichinella spiralis, viabilidad, cerdo. Abstract Viability of Trichinella spiralis in Meat Pig on Various Experimental Conditions of Conservation". Trichinellosis is a worldwide, zoonotic disease caused by adults and larvae 235

2 of the parasitic nematode Trichinella spiralis. The infection occurs in domestic and wild animals. Human infection is acquired most often trough ingestion of undercooked pork meat containing infective encysted larvae. According to mexican regulations (NOM-SSA1 2004) pork meat must be free of Trichinella spiralis, nevertheless obligatory trichinelloscopy is not enforced. The aim of present study is to evaluate the viability of Trichinella larvae in pork meat after different preservation procedures: Drying (60º C and 57ºC for 24 h), refrigeration (0ºC and 4ºC), seasoning (two commercial products), curing (3% sol. of curing ingredients) and freezing (-18ºC, -20ºC). The meat was obtained from experimentally infected swine. Contaminated mouse muscle (5,000 larvae) was fed to 3 male pigs. During fattening period (aprox. 105 days) serum samples were investigated to specific antibodies with and ELISA. At slaughter muscle samples were obtained and tested by artificial digestion performing. After preservation procedures the pork meat was digested and the larvae counted. In order to assure the infectivity of larvae, mice were orally infected. The results of this study support the conclusion that curing, seasoning and refrigeration have not a relevant impact on larvae viability, on the contrary freezing and drying are procedure that reduce the risk to Trichinella spiralis infection. Key words: Trichinella spiralis, viability, swine. Introducción La triquinelosis es una enfermedad parasitaria zoonótica de amplia distribución mundial producida por larvas y adultos del nematodo Trichinella spiralis (9). La enfermedad afecta a los animales domésticos y salvajes, puede ser transmitida al hombre por ingestión de carne cruda o mal cocinada procedente de animales que contienen larvas encapsuladas (4). A pesar del establecimiento de programas de control, los brotes de triquinelosis humana están constantemente presentes en diferentes partes del mundo, incluido México (2), por lo tanto no se refleja la verdadera prevalencia en este tipo de padecimientos, el último registro por parte de Sistema Único de Información para la vigilancia Epidemiológica/Dirección General de Epidemiología /SSA, fue en el año 2002 con sólo 3(7.8%) casos en el estado de Jalisco en relación a 38 casos a nivel nacional (14). La inspección sanitaria en rastros tiene como uno de sus objetivos el evitar enfermedades en el consumo de carne contaminada. En recientes años, varios ensayos han sido desarrollados para detectar triquinelosis porcina (17). Para el diagnostico clínico de la triquinosis en humanos es muy importante el antecedente de la ingestión de carne de cerdo 236

3 o de otros carnívoros involucrados en la transmisión del parásito, como por ejemplo jabalíes en Europa y rata de campo en el centro del país, según lo comentado por De-la-Rosa y col. (7). El caballo también se relaciona con la transmisión del parásito al hombre. Para el diagnóstico de la infección se usan métodos directos como la triquinoscopía (observación de larvas por compresión de muestras de músculo en el microscopio de proyección) y la digestión artificial (digestión de muestras de músculo y la observación de larvas en el sedimento); actualmente se emplean métodos inmunoenzimáticos para detectar anticuerpos contra antígenos de la larva muscular de Trichinella spiralis. Existen las pruebas ELISA, por sus siglas en ingles enzyme linked immnosorbent assay y, sus variantes como el Dot ELISA y la inmunoelectrotransferencia o western blot. Los métodos moleculares, como la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis del DNA amplificado al azar, han sido utilizados principalmente para caracterizar genómicamente al parásito (1, 5). El presente trabajo tuvo como objetivos la reproducción experimental de la infección por Trichinella spiralis en cerdos, y la determinación de la viabilidad del parásito en carne de cerdo sometida a diferentes procedimientos de conservación. Materiales y Métodos 4 cerdos fueron utilizados en el estudio, 3 cerdos se infectaron y 1 control. La infección se llevó a cabo en cerdos de 3 meses de edad a través del suministro de carne de roedor contaminada con 5,000 larvas de Trichinella spiralis aproximadamente. Los cerdos fueron sacrificados a los 105 días post infección. Previamente fueron monitoreados para determinar anticuerpos anti-triquina en periodos cada 15 días hasta el sacrificio. Se hicieron pruebas serológicas para demostrar la ausencia de anticuerpos vs triquina antes del inicio del estudio. La prueba de ELISA se llevó a cabo por medio del uso del kit comercial IVD Research Inc. Carlsband, CA USA (Internacional Trichinella spiralis Serum Microwell ELISA). Las lecturas se realizaron en un lector automático de ELISA con filtro a 450 nm (ELx 800 ) Al sacrificio se seccionaron los músculos: diafragma, base de la lengua y maseteros principalmente para obtener una muestra compuesta de 50g. Los tratamientos descritos a continuación se llevaron a cabo en muestras individuales de 150g c/u. Se congelaron 24 muestras de carne a-20ºc y -18 C por 30 días así como a 0ºC y 4ºC respectivamente por 105 días. Para el secado de la carne, se utilizó un horno a en donde se mantuvo la muestra durante 24 horas; después de la desecación se mantuvo a 4 C. Para el sazonado de la carne se emplearon 2 productos comerciales, siguiendo las indicaciones de 237

4 los mismos y mantenidas así durante 105 días a 4 C. Para el curado se introdujo la carne en salmuera al 3% (93.75% de Na Cl y 6.25% de Nitrito de sodio) (Sal Cura Premier ) durante 105 día. Se realizó la digestión artificial y solo se reportó el número de larvas encontradas. Para verificar la viabilidad fue preciso reproducir la infección en ratones. Para el análisis de resultados fue empleado el paquete estadístico SIGMA STAT V3.1 (Advisory Statistics for Scientists). Resultados Prueba de ELISA: solo se encontraron anticuerpos anti-triquina en los tres cerdos infectados y el cerdo testigo, el número 4 fue negativo. La respuesta inmunológica, manifestada por los niveles de anticuerpos de los tres cerdos se mantuvo durante los 105 días. El cerdo testigo se mantuvo sin respuesta inmunológica (Gráfica 1). La validación de los resultados y la interpretación de los mismos se llevó a cabo mediante el Kit de ELISA utilizado, se consideraron negativos los valores entre 0.0 a 0.3 de densidad óptica (D.O.) y positivos los mayores de 0.5 D.O. Densidad óptica Densidad óptica De 0.0 a 0.3 D.O. = negativo > 0.5 D.O.= positivo Días Testigo Cerdo 1 Cerdo 2 Cerdo 3 Densidad óptica De 0.0 a 0.3 D.O. = negativo > 0.5 D.O.= positivo Gráfica 1. Cinética de anticuerpos por ELISA tras la infección experimental de cerdos con larvas de Trichinella spiralis (n=3). 238

5 Digestión artificial de la carne: se llevó a cabo cada 15 días durante el estudio. Se comprobó la viabilidad de las larvas según cada tratamiento. A -18 C y -20 C las larvas no fueron viables (Tabla 1). La refrigeración a 0 C y 4ºC no afectó la viabilidad de las larvas (Tabla 2). En secado en estufa a temperaturas de 54ºC y 60ºC por 24 horas, afectó la viabilidad de las larvas (Tabla 3). Los condimentos utilizados para adobar la carne de cerdo y mantenidos a 4ºC no afecta la viabilidad de las larvas (Tabla 4). En el curado a 0 C y 4ºC no afecta la viabilidad de las larvas (Tabla 5). Tabla 1. Viabilidad de larvas de Trichinella spiralis en carne de cerdo sometida a congelación a -18 ºC y -20ºC. Congelación Día 0 Día 15 Día C -20ºC -18 C -20ºC -18 C -20ºC Muestra Muestra Muestra Promedio Resultado de la viabilidad Viables No viables No viables Tabla 2./Table 2. Viabilidad de Trichinella spiralis en carne de cerdo sometida a refrigeración 0ºC y a 4ºC /Viability of Trichinella spiralis in pig meat handing of refrigeration at 0 C and 4 C. Día 0 Día 15 Día 30 Día 45 Día 60 Día 75 Día 90 Día 105 Refrigeración 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC Muestra Muestra Muestra Promedio Viabilidad Viables Viables Viables Viables Viables Viables Viables Viables Tabla 3./Table 3. Número de larvas muertas de Trichinella spiralis en carne de cerdo sometida a secado en estufa 54 C y 60 C/24hrs. en refrigeración a 4 C/Numer of deat larvae of Trichinella spiralis handling of store at 54 C and 60 C/24hrs. Secado en estufa /24hrs. Refrigeración (4 C) Día 0 Día 15 Día 30 4 C 4 C 54 C 60 C 54 C 60 C Muestra Muestra Muestra Promedio Viabilidad Viables No viables No viables 239

6 Tabla 4./ Table 4. Viabilidad de Trichinella spiralis en carne de cerdo adobada en refrigeración a 4 C/ Viability of Trichinella spiralis in pig meat adobada in refrigeration at 4 C. Adobo Refrigeración 4ºC Día 0 Día 15 Día 30 Día 45 Día 60 Día 75 Día 90 Día 105 1* ** Muestra Muestra Muestra Promedio Viabilidad Viables Viables Viables Viables Viables Viables Viables Viables *Adobo tipo 1** Adobo tipo 2 Tabla 5./Table 5. Viabilidad de Trichinella spiralis en carne de cerdo a sometida a curado en refrigeración a 0 C y a 4 C/ Viability of Trichinella spiralis in pig meat handling of cure in refrigeration at 0 C and 4 C. Curado Refrigeración Día 0 Día 15 Día 30 Día 45 Día 60 Día 75 Día 90 Día C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC 0 C 4ºC Muestra Muestra Muestra Total Promedio Viabilidad Viables Viables Viables Viables Viables Viables Viables Viables Al efectuarse un análisis estadístico, no se encontró diferencia estadística (P > 0.05). Para comprobar la viabilidad, se infectaron ratones con larvas procedentes de las muestras de la carne de cerdo sometidas a los diferentes tratamientos utilizados; La supervivencia de las larvas fue comprobada reproduciendo la infección en ratones y como resultado se decidió establecer como viable o no viable cuando no se reprodujo el ciclo del parasito. Discusión Los resultados de la prueba de ELISA concuerdan con los resultados de Ribicich y col. (2000), respecto a la sensibilidad del método aplicado a Trichinella spiralis. Datos similares se obtuvieron con los sueros de cerdos infectados con 5,000 larvas en nuestro estudio como una dosis infectiva para obtener larvas en la carne de cerdo, así los sueros constituyen muestras positivas de infección a la enfermedad de triquinosis porcina. Los resultados demuestran que la utilización de la prueba de ELISA proporciona un diagnóstico certero que 240

7 permite detectar animales con bajos niveles de anticuerpos que no pueden ser identificados como positivos por medios directos como la triquinoscopía y/o la digestión artificial como lo afirman Gamble y col. (1983) quienes mencionan que los métodos directos como triquinoscopía y digestión artificial en los que se demuestra la presencia de larvas en tejidos pueden ser costosos y laboriosos; además de que las infecciones tempranas pasan desapercibidas debido a que la sensibilidad de estas pruebas no es adecuado y no son tan confiables en bajos niveles de infección como ocurre con la prueba de ELISA. Con la prueba de ELISA, es posible la detección de anticuerpos anti-trichinella spiralis en el suero de cerdos infectados; estos niveles de anticuerpos se mantienen durante más de 100 días postinfección Vignau (2004). Esto concuerda con los resultados obtenidos en el presente estudio ya que a los 105 días los niveles de anticuerpos se mantenían. En el experimento realizado en este estudio se encontró que las larvas no sobrevivieron a temperatura de -18ºC y -20ºC a los 15 días posteriores al tratamiento, lo cual concuerdo con lo mencionado por Acha y Szyfres (1) quienes afirman que tratamiento de congelación es un método de conservación de la carne aplicado en muchas ocasiones para la destrucción de larvas de Trichinella spiralis. Mientras que el tratamiento de refrigeración a 4ºC sólo disminuye la cantidad de larvas, esto coincide con lo encontrado por Chávez y col. (2005). Se observó que el adobo utilizado en la carne de cerdo no afectó la viabilidad de la larva, como ocurrió en el experimento de Quiroz y Landeros (1988), quienes realizaron un estudio sobre la valoración del tiempo de supervivencia de las larvas de trichinella spiralis en chorizo de cerdo, mostrando evidencia, por la cantidad de larvas en los animales sacrificados, de que estas sobreviven en el embutido, encontrando larvas viables en los que se maduraron de los 15 a los 30 días por lo que se establece que el consumo de chorizo con menos de 15 días de maduración tiene un alto riesgo de producir una infección. Mientras que diferencia de lo ocurrido con el experimento de Quiroz y Bañuelos (1972), quienes prepararon chorizo casero, gallego y andaluz con carne de rata infectada con Trichinella spiralis, después de 30 días de maduración, fueron administradas a ratas sanas, se sacrificaron a los 30 días, y los resultados indicaron que las larvas no eran viables. La supervivencia de las larvas en el presente experimento demuestra que el curado con sal nitro no altera la viabilidad de los parásitos ni sus características físicas. Esto concuerda con lo encontrado con Allen y col. (1962) quienes encontraron larvas en carne con diferentes concentraciones de sal común a los 39 días pero después de los 42 días ya no. Sin embargo 241

8 estudios realizados por Smith y col. (1989) demostraron que el curado en carne tienen un efecto destructivo de larvas. El primer monitoreo de viabilidad de las larvas se llevó a cabo a los 15 días de iniciados los tratamientos. En congelación, en este periodo ya no se observaron larvas viables, por lo que se hace necesario realizar este monitoreo a intervalos más cortos para establecer con precisión los días en que las larvas pierden viabilidad. Conclusión Los resultados obtenidos permiten concluir que las larvas de Trichinella spiralis expuestas a - 18ºC y -20ºC pierden viabilidad. Las larvas cuentan con una gran capacidad de resistencia a la refrigeración 4ºC por largo tiempo. El secado en estufa a temperaturas de 54ºC y 60ºC por 24 horas, afectó la viabilidad de la larva y sus características físicas. El adobo utilizado en la carne de cerdo no afectó la viabilidad de las larvas. El curado utilizado no fue suficiente para inactivar a las larvas de Trichinella spiralis. Bibliografía 1.-Acha N. P. y Szyfres B., (2003). Zoonosis y enfermedades trasmisibles comunes al hombre y a los animales. 3ra edición. Vol. III. Parasitosis. Organización Panamericana de la Salud. P Aguilar, F. B. R., Bautista, G. C. R., Rojas, J., De Nova, E. M., Ixta, R. O. and Martínez, G. F., (2000). Experimental Swine Trichinellosis: Use of Dot-ELISA and Western Blot with Excretion/Secretion Antigens (ES) from Infective Larvae to Detect Anti-Trichinella spiralis Antibodies. Revista Latinoamericana de Microbiología. 42: Allen, R. W., and Goldberg, A., (1962). American Journal Veterinay Research, Vol. 23, (Suppl. 94): Bartoloni, A., Cancrini, G., Bartalesi, F., Nicoletti, A., Méndez, P. G., Rosado, J., Roselli, M., y Paradisi, F., (1999). Anticuerpos contra Triquinella spiralis en la población rural de la provincia Cordillera, Bolivia. Revista Panamericana Salud Pública. 5(Suppl. 2): Costamagna, S. R., (2000). Trichinellosis: A propósito de un peritaje judicial. VI Congreso Argentino de Protozología y Enfermedades Parasitarias. Huerta Grande, 25 al 28 de Octubre (Suppl. 3): Chávez, G. E. G., Saldívar, E. S. J., Reveles, H. R. G., Muñoz, E. J. J., Moreno, G. M. A., (2005). Determinación del efecto de la temperatura en la persistencia de Trichinella spiralis, Revista digital de la Universidad Autónoma de Zacatecas, Nueva época. Publicación cuatrimestral. Tomado de la red mundial: 7.-De la Rosa J. L. Aranda, J.G., Padilla, E., and Correa D., (1998). Prevalence and risk factor associated with serum antibodies against Trichinella spiralis. International Journal Parasitology. 28: Gamble, H. R., Anderson, W. R., Graham, C. E. and Murrel, K. D., (1983). Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-liked inmunosorbent assay (ELISA) using an excretorysecretory antigen. Verterinary Parasitology. 13:

9 9.-Jiménez, C. E., Caballero, G. M De L., Uribe, G. G., Trejo, H. E., Gay, J. F. R., (2005). Frecuencia de Trichinella spiralis en sangre y músculo de equinos sacrificados en dos diferentes mataderos uno de tipo industrial y otro de tipo rural en el Estado de México. Vet. Méx. 36(Suppl. 3): Quiroz, R. H., Bañuelos, (1972). Viabilidad de Trichinella spiralis en el chorizo, Veterinaria, México, 3: Quiroz, R. H., Landeros, R. R., (1988). Valoración del tiempo de sobrevivencia de larvas de Trichinella spiralis en chorizo de cerdo. Revista Mexicana de parasitología. Vol. 1 (Suppl. 1): Ribicich, M., (2000). Fundamentos e importancia de la utilización de test de ELISA para el diagnostico de Triquinelosis de Argentina. Parasitología y Enfermedades Parasitarias. 13.-Ribicich, M., Miguez, M., Franco, A. and Basso, N., (2000). Evaluation of ELISA test for the diagnosis of porcine trichinellosis, The Pig Journal. 46: Sistema Único de Información para la Vigilancia Epidemiológica/Dirección General de Epidemiología/ SSA, (2002). Casos de Triquinosis (B75) por fuente de notificación Estados Unidos Mexicanos Smith, H. J., Messier, S., and Tittiger, F., (1989). Destruction of trichinella spiralis during the preparation of the Dry Cured pork products proscuitto, proscuittini and genoa salami, Canadian Journal of Veterinary Research. 53: Tay, Z. J., Sánchez, V. J., Ruiz, S. D., Calderón, R. L., García, Y. Y., Alonso, T., Martínez, CH. J. F., y Rivas, C., (2004). Estado actual de nuestros conocimientos sobre triquinellosis en la república mexicana. Reporte de nuevas localidades infectadas. Rev. Fac. Med. UNAM. 47(Suppl. 3): Venturiello, S. M., Ben, G. J. M., Constantino, S. N., Malmassari, S. L., Nuñez, G. G., Venerini, R. L. y Traversa, M. J., (1998). Diagnosis of porcine trichinellosis: parasitological and inmunoserological test in pigs from endemic areas of Argentina. Veterinary Parasitology. 74: