GUIA DE CONOCIMIENTOS Y CUESTIONARIO GENERAL PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL PRESENTADO POR:

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1 GUIA DE CONOCIMIENTOS Y CUESTIONARIO GENERAL PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL PRESENTADO POR: Alejandro Camacho Rosalba Esquivel Cote Adriana Mejía Chavez Rosa María Ramírez Gama María del Carmen Urzúa Hernández BIOLOGÍA CELULAR: GUIA DE CONOCIMIENTOS Organización celular y dimensiones de organismos procariotas y eucariotas Composición de pared celular y diferencias. Composición de membrana celular y diferencias Microscopio. Tipo y usos de los microscopios Biomoléculas: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucléicos. Composición química Monómeros Estructuras celulares en las que están presentes Enzimas. Concepto de enzima y sustrato. Funciones y tipo de enzimas. Exo y endoenzimas. QUÍMICA ANALÍTICA: Indicadores de ph. Vire de indicadores Ley de Lambert y Beer MATEMÁTICAS: Conversión de unidades del Sistema Internacional (SI): longitud, peso y volumen Cálculo de áreas Cálculo de promedios Química General: Reacciones de oxido-reducción (donadores y aceptores de electrones) Propiedades de sólidos, líquidos y geles

2 CUESTIONARIOS PARA EL LABORATORIO MICROBIOLOGÍA GENERAL PRÁCTICA 1 REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD 1. Qué es un microorganismo? 2. Escribe el nombre de 5 microorganismos patógenos que conozcas y la enfermedad producen. 3. Escribe el nombre de 5 microorganismos que no sean patógenos y donde se encuentran. 4. Qué es y que se hace en un laboratorio de Microbiología? 5. Cuáles son las consideraciones que hacen a este laboratorio diferente a otros que hayas cursados durante la carrera (Química General, Analítica, Orgánica, etc.)? 6. Cuáles son las principales reglas de higiene y seguridad que deben observarse en el laboratorio? 7. Indica la importancia de cada una de ellas. 8. Definición de asepsia, desinfección y esterilización 9. Qué entiende por técnica aséptica?. Cuáles son los desinfectantes que se emplean comúnmente en el laboratorio de microbiología? 11. Qué se debe hacer cuando se derrama un cultivo microbiano sobre: - La mesa de trabajo - La bata - El piso - Las manos 12. Qué harías si te encontraras que las cajas petri con hongos que guardaste en tu gaveta sé quedaron destapadas el fin de semana? PRÁCTICA 2 MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO 1. Describe el fundamento y la utilidad del microscopio óptico y del microscopio electrónico. 2. De que tipo es el microcopio que utilizarás en el laboratorio de Microbiología?. Esquematiza sus partes y menciona cual es la función de cada una de ellas. 3. Describe los tipos de iluminación que se emplean con el microscopio óptico y su aplicación. 4. Qué es poder de resolución y de que depende? 5. Explica con tus propias palabras los siguientes términos: - Apertura numérica - Propiedad parafocal - Aumento total - Distancia focal 6. Ilustra de manera comparativa el diámetro de las lentes de los objetivos X, 40X y 0X 7. Cuál es la repercusión del diferente diámetro de las lentes? 8. Qué es un aumento vacío? 9. Cómo se calcula el aumento total de un microscopio?

3 . Con base en la longitud de onda de la luz, cómo se puede mejorar el poder de resolución de un microscopio? 11. Qué es, de donde proviene, cual es su función y en que objetivos se usa el aceite de inmersión? 12. Enlista los pasos para realizar el adecuado enfoque con el microscopio 13. Cómo se calibra el microscopio para realizar la medición de microorganismos? 14. Qué microorganismos se pueden observar con cada uno de los objetivos? PRÁCTICA 3 ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LOS MICROORGANISMOS Preparaciones 1. Cuál es la aplicación de las preparaciones en fresco? 2. Qué grupos microbianos se observan con las preparaciones en fresco? 3. Qué es un frotis y para que se sirve? 4. Cuál es el objeto de dejar secar al aire la muestra? 5. Para que se fija una muestra? 6. Describe los métodos que se emplean para fijar una muestra? Tinciones 1. Por qué es necesario teñir a los microorganismos o bien el fondo de la preparación? 2. Qué es un colorante? Cómo está constituido? Qué factores intervienen para que los colorantes se combinen con los componentes celulares? 3. Para que se emplean los mordentes? Describe algunos ejemplos. 4. Qué es una tinción? Cuántos tipos existen? 5. Describe las diferencias entre una tinción positiva y una negativa Tinciones simples 1. En que consiste una tinción simple? 2. Qué es y cuáles son las principales características de un colorante vital y para que se emplean? 3. Qué información proporcionan - Una preparación en fresco con tinción simple? - Una preparación fija con tinción simple? 5 Compara la forma y tamaño de los microorganismos observados. Tinciones diferenciales 1. Qué es una tinción diferencial? 2. Indica las diferencias que existen entre una tinción simple y una diferencial 3. Describe el fundamento de la tinción de Gram y de Ziehl Neelsen 4. Cuál es la importancia de ambas tinciones? 5. Describe los reactivos empleados en la tinción de Gram y la función de cada uno de ellos

4 6. Cómo se denomina a las bacterias que retienen el primer colorante y de que color se observan? 7. Cómo se denomina a las bacterias que pierden el primer colorante, indique de que color se observan y explique el por qué? 8. En la tinción de Ziehl Neelsen, para que se emplean: - la anilina y el fenol - el calentamiento - los detergentes 9. Cuál es la diferencia de los decolorantes empleados en la tinción de Gram y de Ziehl Neelsen. De que color se observan las bacterias ácido alcohol resistentes? Indique la causa 11. De que color se observan las bacterias no ácido alcohol resistentes? Indique la causa. Tinciones selectivas 1. Qué es una tinción selectiva? 2. Por qué es necesario efectuar el calentamiento durante la tinción del las endosporas bacterianas 3. Qué tipo de tinción se emplea para la observación de flagelos de: - bacterias - algas - protozoarios 4. Para que se usa el ácido tánico en la tinción de flagelos bacterianos? 5. Por qué no deben fijarse a la flama las preparaciones que serán empleadas para la tinción y observación de: - Núcleo - Cápsula 6. Por qué se emplea la tinción negativa para la observación de la cápsula? Integración 1. Indica que tipo de estructura celular presentan: a) Las bacterias b) Los hongos c) Los protozoarios d) Las algas 2. Cómo se clasifican las algas?. Esquematiza cada grupo 3. Qué tipos de locomoción presentan los protozoarios? Esquematiza cada grupo 4. Cuál es la función de las endosporas bacterianas y de las esporas de hongos?

5 5. Al concluir la práctica llenar los siguientes cuadros con los resultados de las de las preparaciones observadas 5.1 De bacterias Nombre científico o clave de muestra O tipo de muestra Morfología Movilidad (+ o -) Tamaño Tipo de agrupación Gram (+ o -) Acido resistencia (+ o -) Endosporas (+ o -) Tamaño Posición dentro de la célula Cápsulas (+ o --) Grosor con respecto al diámetro de la bacteria Presencia de una o mas bacterias dentro de la cásula 5.2 De hongos levaduriformes Nombre científico o tipo de muestra Morfología Núcleo Tamaño Blastosporas 5.3 De hongos filamentosos Nombre científico o tipo de muestra Hifas cenocíticas o septadas Diámetro de las hifas Esporas dentro o fuera del cuerpo fructífero

6 PRÁCTICA 4 ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Esterilización 1. Esquematice una autoclave, indicando cuales son las partes que la conforman, así como la función de cada una de ellas. 2. Qué es y como se lleva a cabo la esterilización por calor húmedo? 3. Qué es y como se lleva a cabo la esterilización por calor seco? 4. Describe los siguientes métodos de esterilización: tindalización, pasteurización, filtración, radiaciones, gases. 5. Qué es una sustancia termolábil? y Cómo se esteriliza? 6. Qué significa termorresistencia en Microbiología? 7. Qué tipo de indicadores se utilizan para verificar el proceso de esterilización? 8. Qué es una espora bacteriana? 9. Qué es un indicador de ph? Menciona 5 ejemplos, indicando el intervalo de ph de cada uno.. Con la información anterior llenar el siguiente cuadro PROCESO O MÉTODO EQUIPO Y CONDICIONES TIPO DE MATERIAL MECANISMO DE MUERTE CELULAR Medios de cultivo 1. A que se le llama medio de cultivo? y Para que se utiliza? 2. Qué es el agar?. Menciona la forma de obtención, así como su uso. 3. Indica la clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico y la utilidad de cada uno de ellos 4. Qué en un medio de cultivo natural o complejo? 5. Qué en un medio de cultivo sintético? 6. Define los medios de cultivo de acuerdo a su utilidad: enriquecido, enriquecimiento, selectivo, diferencial, prueba bioquímica, de transporte y de conservación. Menciona un ejemplo de cada uno de ellos. 7. Qué es un factor de crecimiento? 8. Indica los cuidados que se deben tener al preparar los medios de cultivo 9. Escribe el nombre y fórmula de 3 ejemplos de sustancias que son utilizadas en los medios de cultivo como fuente de: Carbono, Nitrógeno, Fósforo y Azufre.. Qué factores físicos y químicos afectan la estabilidad de los medios de cultivo?

7 11. Investiga la fórmula y preparación de los medios de cultivo indicados en el siguiente cuadro y completa la información del mismo MEDIO DE CULTIVO Agar CASOY o caseína soya Caldo CASOY o caseína soya Agar Sabouraud Agar eosina azul metileno (EMB) Manitol de sal Agar (MSA) Agar Vogel Jonson Agar cetrimida Gelosa Nutritiva Agar sangre Tripticasa soya agar TIPO DE MEDIO DE CULTIVO (Selectivo, diferencial etc) COMPUESTO (S) QUE LO HACEN SELECTIVO O DIFERENCIAL TIPO DE MICROORGANISMOS QUE CRECEN EN EL MEDIO CARACTERÍSTICAS COLONIALES DE LOS MICROORGANISMOS QUE CRECEN 12. Qué condiciones se necesitan para el crecimiento saprofito de un microorganismo?

8 PRÁCTICA 5 TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS 5.1 Siembra, cultivo y estudio de bacterias 1. Qué es un cultivo microbiológico? 2. Qué es una colonia bacteriana? 3. A que se le denomina cepa en microbiología? 4. Qué es una cepa pura? Investiga el nombre de tres instituciones que se encarguen de vender cepas puras. 5. Para cultivar un microorganismo, cuáles son los cuidados que debes tener en el medio de cultivo y durante la incubación? 6. Qué es un cultivo axénico? 7. Mencione los cuidados para eliminar los riesgos de contaminación. 8. Qué entiendes por técnica aséptica? 9. De acuerdo a la información del siguiente cuadro, indique el dispositivo (s) y técnica (s) de siembra que se emplea en cada caso TIPO DE MEDIO DE CULTIVO Caldo en tubo Caldo en matraz Medio sólido (fundido) Medio sólido en tubo inclinado Medio sólido en tubo vertical Placas de Agar Nutritivo DISPOSITIVO (S) TÉCNICA DE SIEMBRA. Qué información te proporciona el desarrollo de bacterias en medios líquidos? 11. Qué información te proporciona el desarrollo de bacterias en medios de cultivo semisólidos? 12. Qué características culturales se observan en: a) Agar inclinado b) Agar vertical c) Placas de Agar 13. Esquematiza 5 tipos de colonias bacterianas 14. De acuerdo a la reacción de Gram las bacterias se clasifican como 15. Indica el factor que determina que algunas bacterias sean acidorresistentes y da 2 ejemplos de este tipo de bacterias. 16. Esquematiza las características microscópicas que pueden presentar las bacterias en cuanto a: d) Morfología e) Tipo de agrupación

9 f) Estructuras especiales 5.2 Siembra, cultivo y estudio de hongos. 1. Qué diferencias existen entre los hongos filamentosos y los levaduriformes 2. En qué ambientes se encuentran este tipo de microorganismos? 3. Indica en nombre científico de 3 hongos filamentosos y de 3 levaduriformes 4. Describe la técnica que se emplea para sembrar hogos filamentosos y levaduriformes en placa. 5. Cuáles son las condiciones óptimas para el crecimiento de hongos filamentosos y levaduras? 6. Qué es un microcultivo? 7. Qué ventajas presenta el microcultivo con respecto al cultivo en placa? 8. Qué son las hifas y los micelios? 9. Cuántos tipos de tipos se conocen?. Como se denomina al micelio de acuerdo a su posición y función? 11. Qué características culturales de hongos levaduriformes se observan en un cultivo en placa 12. Qué características culturales de hongos filamentosos se observan en un cultivo en placa 13. Qué tipo de reproducción presentan los hongos micromicetos? 14. Esquematiza las diferentes estructuras de reproducción asexual de hongos filamentosos 5.3 Cultivos de y estudio de protozoarios de vida libre. 1. Describe la importancia ecológica de los protozoarios 2. Qué se requiere para cultivar protozoarios parásitos? 3. Cuáles son los cuidados que se deben tener para obtener cultivos mixtos de protozoarios de vida libre? 4. Describe el procedimiento para obtener un cultivo puro de protozoarios 5. Qué se utiliza para inhibir el movimiento de los protozoarios y facilitar su observación en preparaciones en fresco? 6. Cuántos tipos de órganos de locomoción presentan los protozoarios? 7. Cuáles son las estructuras que se observan con los siguientes colorantes: a) Rojo neutro diluido b) Lugol c) Verde de metilo d) Solución de Noland 8. Esquematiza 3 protozoarios (un sarcodario, un flagelado y un ciliado) e indica en cada uno de ellos las estructuras que se observan 5.4 Siembra, cultivo y estudio de algas. 1. Describe las características de las algas 2. Cuál es la diferencia fundamental de las algas con los hongos y los protozoarios? 3. Describe la importancia ecológica e industrial de las algas 4. Cuáles son los componentes que se utilizan en los medios de cultivo para algas 5. Qué cuidados se deben tener durante su incubación? 6. Indica el nombre científico de 5 algas y esquematizalas.

10 PRÁCTICA 6 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 1. Explica los métodos que se utilizan para el aislamiento de microorganismos. 2. Que tipo de microorganismos se pueden aislar en los siguientes medios de cultivo. a) Agar cetrimida b) Agar Eosina azul de metileno (EMB) c) Agar Mc Conkey d) Agar Lipman libre de nitrógeno e) Agar sal manitol f) Agar Sabourau-Rosa de Bengala-Estreptomicina g) Agar Vogel Johnson 3. De cada uno de los medios anteriores, indica cuál es el componente que lo hace selectivo y a que tipo de microorganismos inhibe. 4. Indica algunas de las características fisiológicas de los microorganismos que se aprovechan para efectuar su aislamiento. 5. Explica las diferentes técnicas que existen para crear condiciones de anaerobiosis y microaerofilia 6. Investiga que géneros de bacterias pueden crecer bajo estas condiciones y cual es su importancia 7. Investiga la composición química y usos de los siguientes medios de cultivo: Caldo tioglicolato y agar anaeróbico de Brewer. 8. Qué compuesto(s) de estos medios de cultivo permiten el desarrollo de bacterias anaerobias? 9. Investiga algunas aplicaciones de estas técnicas en la industria y en la clínica. PRÁCTICA 7 CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 1. Para que se aplica la cuantificación de microorganismos? 2. Qué tipo de métodos se emplean para cuantificar los microorganismos totales?. Da dos ejemplos. 3. Qué tipo de métodos se emplean para cuantificar los microorganismos viables en una muestra?. Da dos ejemplos. 4. Qué tipo de muestras deben ser diluidas antes de proceder a la cuantificación? 5. Qué tipo de muestras deben ser concentradas antes de proceder a la cuantificación? 6. Qué métodos emplea para concentrar los microorganismos de una muestra? 7. En las técnicas de cuantificación cuáles son los errores más frecuentes? 8. Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación directos? 9. Para cuantificar hongos utilizarías el método turbidimétrico?. Explique el por que?. Cómo se determina la superficie que ocupa un campo microscópico? 11. Qué importancia tiene la determinación anterior en el método de Breed? 12. Cómo lograrías cuantificar las células viables de todos los grupos microbianos existentes en una muestra dada? 13. En el método de dilución y vaciado en placa por que se recomienda agitar cada una de las diluciones un número constante de veces? 14. En la preparación de diluciones emplearías agua destilada? Indique el por que.

11 15. Qué temperatura debe tener el medio de cultivo antes de vaciarlo a las cajas que contienen la muestra 16. Qué entiendes por efecto de dilución aparente? 17. Qué debe hacer cuando en las cajas inoculadas con diferentes diluciones no se observa el efecto de dilución aparente? 18. Cuál es el significado de UFC y NMP? 19. Para que tipo de muestras se emplea el recuento por filtro de membrana? 20. Para qué se utilizan estas técnicas en la industria o en la clínica? PROBLEMAS 1. Comparar la calidad de 2 muestras de leche. Con tal fin entregaste una muestra de cada leche a 2 de tus técnicos, y les indicaste aplicar el método de Breed. Los reportes a partir de los cuales harás la interpretación se especifican a continuación: Técnico 1 Diámetro de campo microscópico Área en la que se colocó la muestra Volumen de la muestra =70 μm = 2.0 cm2 = 0.01 ml Número de campo Número de microorganismos Técnico 2 Diámetro de campo microscópico = 0.65 μm Área en la que se colocó la muestra = 1.0 cm2 Volumen de la muestra = 0.01 ml Campos observados = Promedio de microorganismos/ campo microscópico =18

12 2. En una planta de aguas residuales se está probando la eficiencia de dos productos para disminuir la cantidad de microorganismos presentes. Con tal motivo, se procedió a analizar 3 lotes de muestras en las que determinó: a) La cantidad de microorganismos totales/ 0 ml de agua b) la cantidad de coliformes/ 0 ml de agua Los lotes y resultados obtenidos se especifican a continuación: Cuadro 1 Resultados del método de Dilución y siembra por placa vertida Lotes Repeticiones Diluciones Número de UFC por placa I Agua sin 1 Incontables tratar 2 Incontables II Agua tratada con cloro III Agua tratada con plata coloidal 3 Incontables Incontables Cuadro 2 Resultados del método de Dilución y siembra en tubos que contienen caldo lactosado Lotes Repeticiones Diluciones -4-5 Número de tubos positivos I Agua sin tratar II Agua tratada con cloro III Agua tratada con plata coloidal Analice los resultados del cuadro 1 e indique: a) Se observa el efecto de dilución en todas las series de los 3 lotes?. b) En caso de que la respuesta sea negativa indique en cuáles no se observa este efecto c) De cada lote cuáles resultados eligió para efectuar sus cálculos? E indique el criterio en que baso su elección d) Cuál es la cantidad de UFC/ 0 ml de agua en cada uno de los lotes? Cuál es el NMP/ 0 ml de muestra? Que resultó en cada lote Cuál de los productos tiene mayor capacidad de desinfección?

13 PRÁCTICA 8 NUTRICIÓN MICROBIANA 1. Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo a la fuente de carbono que utilizan? 2. Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo a la fuente de energía que utilizan? 3. Define microorganismo auxótrofo y da algunos ejemplos 4. Cuáles son los microorganismos prototrofos? 5. Indica como son utilizados por los microorganismos los siguientes compuestos químicos: a) Peptona de carne, b) Extracto de levadura, c) NaCl, FeSO 4, d) MgSO4, e) (NH4)2SO 4, f) K2HPO 4, g) KH2PO 4, h) glucosa, i) sacarosa j) almidón. 6. Diseña un medio de cultivo para propagar bacterias quimiolitótrofas y una fotoautótrofa 7. Describe las condiciones de incubación para los dos casos. 8. La glucosa puede ser considerada como fuente de carbono y energía. En caso afirmativo o negativo indique el por qué? 9. Investiga las necesidades nutricionales de los siguientes microorganismos: Escherichia coli Micrococcus luteus Azotobacter sp Rhodotorula Aspergillus Níger Spirulina sp E indica cuáles son autótrofos o heterótrofos Cuáles son fotótrofos, cuáles quimiótrofos Cuáles son protrofos o auxótrofos Cuáles presentan alguna característica adicional

14 PRÁCTICA METABOLISMO MICROBIANO 1. Qué es una enzima? 2. Cómo actúan las enzimas? 3. Investiga la composición y utilidad de los siguientes medios de cultivo: Caldo lactosado bilis verde brillante. 4. Investiga la composición y utilidad de los siguientes medios de cultivo: Caldo rojo de fenol manitol y RMVP 5. Cuál es el fundamento de las Pruebas bioquímicas Caldo rojo de fenol manitol y RMVP? 6. Escribe el nombre correcto de dos microorganismos que den reacciones positivas para estas pruebas y dos microorganismos que den reacciones negativas 7. Cuál es el fundamento de las Pruebas bioquímicas a) Kligler b) SIM? 8. Escribe el nombre correcto de dos microorganismos que den reacciones positivas para estas pruebas y dos microorganismos que den reacciones negativas. 9. Investiga la composición y utilidad de los siguientes medios de cultivo: Caldo nitrato y Hugh-Leifson (Oxidación - Fermentación). Cuál es el fundamento de las Pruebas bioquímicas Caldo nitrato y OF? 11. Escribe el nombre correcto de dos microorganismos que den reacciones positivas para estas pruebas y dos microorganismos que den reacciones negativas. 12. Investiga el fundamento de las siguientes pruebas bioquímicas: a) citrato de Simmons, b) catalasa, c) oxidasa, d) leche tornasol, e) DNAsa, f) urea, g) fenilalanina, h) descarboxilación de aminoácidos, i) leche descremada, j) agar almidón, k) hidrólisis de la gelatina 13. Busca una tabla que contenga los resultados de las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de enterobacterias. 14. Explica la reducción asimilatoria de nitratos. En este caso los nitratos son utilizados como fuente de nitrógeno o como fuente de energía 15. Explica el proceso de desnitrificación, y analiza, si en este caso los nitratos son utilizados como fuente de nitrógeno, o como fuente de energía. 16. Investiga que rutas del metabolismo se utilizan para el catabolismo de las fuentes de carbono y nitrógeno.

15 PRÁCTICA INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO Y MUERTE DE LOS MICROORGANISMOS 1. De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento y necesidades de oxígeno, Cómo se clasifican las bacterias? 2. Define los siguientes términos: a) Periodo térmico mortal b) Punto térmico mortal c) Psicrófilo d) Mesófilo e) Termófilo f) Hipertermófilo g) Halófilo h) Xerófilo i) Osmófilo 3. Qué efecto tiene el ph sobre el crecimiento de los microorganismos? 4. Cómo afecta la presión osmótica a los microorganismos? 5. Cómo pueden regular este efecto algunos microorganismos?. 6. Qué daño causa la luz ultravioleta a los microorganismos? Esquematiza 7. Qué mecanismos utiliza la bacteria para revertir el efecto de la luz UV? 8. Define los siguientes términos y da un ejemplo de cada uno de ellos a) Antibiótico b) Biocida c) Bioestático d) Desinfectante e) Antiséptico f) Agente químioterapéutico 9. Investiga 4 microorganismos productores de antibióticos, mencionando el antibiótico que producen y como actúa. Qué es la resistencia a antibióticos? Y Cómo se transmite? 11. Qué es la concentración mínima inhibitoria? 12. En que consiste la técnica de difusión en placa? 13. De acuerdo con su mecanismo de acción, Cómo se clasifican los antibióticos?