LOS GENES SLC28 COMO NUEVAS DIANAS PARA EL TRATAMIENTO DEL ICTUS Y DE LAS ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

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1 LOS GENES SLC28 COMO NUEVAS DIANAS PARA EL TRATAMIENTO DEL ICTUS Y DE LAS ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS Investigador principal: Dr. Marçal Pastor Anglada Facultat de Biologia UB Duración: 3 años 1

2 1. Resumen El nucleósido adenosina (Ado) es un eficaz neuroprotector. La caracterización de su vía clásica de acción a través de los receptores purinérgicos de membrana P1 ha dado, a su vez, resultados contradictorios en cuanto a su potencial terapéutico. Este proyecto pretendía estudiar las vías alternativas que permitieran explicar el comportamiento dual de la Ado y de sus antagonistas en patologías cerebrales. El conocimiento de las vías de captación de la Ado, su influencia en la activación de la enzima reguladora AMPK (cinasa dependiente de AMP) y la influencia de ésta última sobre el metabolismo energético del sistema nervioso, abren grandes posibilidades en cuanto al desarrollo de medicamentos útiles frente a patologías como el infarto cerebral y enfermedades neurodegenerativas. Además de la acción neuroprotectora de la adenosina debido a su interacción con los receptores de membrana, nuestra hipótesis de trabajo sugiere que el aumento intracelular de este nucleósido, mayoritariamente mediado por el transportador de alta afinidad CNT2 (codificado por el gen SLC28A2), activa la AMPK, conduciendo todo ello a un contexto de potenciación del metabolismo energético, llegando a resultar neurotóxico en condiciones de estrés. De confirmarse este modelo, se anticipa que la inhibición farmacológica de CNT2 o de otros transportadores candidatos a intervenir en este mismo tipo de respuesta, comportaría una acción terapéutica eficaz, en tanto que incrementaría la Ado extracelular y a la vez inhibiría la activación de AMPK. 2. Resultados Este proyecto pretendía demostrar si el modelo que se incluye a continuación era funcional en el sistema nervioso central. 2

3 A lo largo del desarrollo de este proyecto ha habido dos limitaciones que se han tenido que superar. La primera ha sido conseguir un sistema celular adecuado para poder abordar los estudios de modulación de CNT2. Se ha conseguido encontrar actividad biológica del transportador en cultivos primarios neuronales pero con elevada heterogeneidad entre preparaciones. Finalmente se han utilizado células PC12 diferenciadas con el factor de crecimiento nervioso (NGF) como modelo de alta expresión endógena de CNT2 de manera repetitiva. La segunda limitación ha sido la obtención de mejores anticuerpos contra esta proteína con el fin de proceder a estudios de inmunohistoquímica previstos tanto in vitro como in vivo, con una especial necesidad debida a la intención de utilizarlo en muestras del banco de tejidos neurológicos humanos tal como estaba previsto en la solicitud. La diferenciación celular se asociaba a un incremento progresivo en la expresión de la proteína CNT2 a la vez que se inducía de forma muy significativa el gen que codifica para el receptor de Ado A 1 (A1R). El resto de receptores (A 2a, A 2b y A 3 ) también se expresaban, aunque la diferenciación inducía un descenso en sus niveles de ARNm, con una caída mucho más acusada en el caso del receptor A 3. En cualquier caso, teníamos 3

4 un modelo donde se coexpresaban los elementos del purinoma, imprescindibles para probar nuestra hipótesis. En este modelo se ha estudiado ampliamente la regulación purinérgica de la actividad CNT2, poniéndose de manifiesto que el transportador CNT2 es sensible a la activación de manera rápida a través de los receptores de tipo A 1 y, secundariamente, A 2a. También se ha demostrado que la actividad de CNT2 se encontraban disminuida cuando se inducía experimentalmente una situación de hipoxia (24h al 3%) en los cultivos celulares, siendo un efecto totalmente específico, ya que la actividad de los otros transportadores de nucleósidos presentes en nuestro modelo, como ENT1 y ENT2, se veían inalterados. Se clonó el promotor del gen SLC28A2 que codifica para el transportador humano CNT2 para poder estudiar los mecanismos de regulación transcripcional por hipoxia. También se pudo comprobar que la adenosina extracelular, a concentraciones bajas, era capaz de estimular la fosforilación de la cinasa dependiente de AMP (AMPK), potenciando así la acción sobre dianas que tiene por debajo esta enzima reguladora del metabolismo energético celular. Se demostró que esta inducción era dependiente de la función CNT2. También se realizaron medidas de inhibición de la actividad de CNT2 por cafeína, demostrándose que, al contrario de lo que cabía esperar, la inhibición era muy débil. Esto apunta a un mayor papel de los receptores como dianas terapéuticas de las metilxantinas. En colaboración con el grupo de la Dra. Anna Planas (CSIC-IDIBAPS) se procedió al análisis de expresión tanto de los transportadores de nucleósidos como de los receptores de adenosina en cerebros de rata a las cuales se les había inducido experimentalmente un ictus focal transitorio. En coherencia con nuestra hipótesis de trabajo se observó que los niveles de expresión de CNT2, así como también para otros transportadores de Ado (como ENT1 y CNT3), y no en el caso de ENT2 y CNT1, eran más bajos en el hemisferio infartado respecto al hemisferio control y a cerebros de animales que no habían sido manipulados. 4

5 Se han generado dos anticuerpos policlonales nuevos contra el ortólogo de rata de CNT2 y se está caracterizando otro monoclonal contra la proteína CNT2 humana. Esta era la segunda limitación que había que superar durante el desarrollo del proyecto. Lo que más ha costado pero que también nos permitirá demostrar, con resultados sólidos, la localización en el plasmalema y/o en los endosomas de CNT2, así como también la translocación sináptica o extrasináptica del transportador. El anticuerpo monoclonal contra hcnt2 (humano) se está caracterizando en estos momentos y nos permitirá analizar los niveles de expresión en tejidos procedentes de infartos cerebrales, tal como estaba previsto en el proyecto original. Si sumamos todas estas observaciones y las analizamos conjuntamente, veremos que son totalmente compatibles con el modelo y la hipótesis de trabajo que nos impulsó a llevar a cabo este estudio, anticipándose así que CNT2 es un transportador regulado por hipoxia, que su expresión también puede verse afectada en respuesta a un cuadro de ictus y que su función está asociada a cambios en el metabolismo energético celular. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Tal como se planteó, este era un proyecto orientado hacia la generación de conocimiento nuevo en un ámbito donde no existía demasiada información, como es la de los transportadores concentrativos de Ado (proteínas CNT) en el sistema nervioso central y de su posible uso como dianas terapéuticas. El estudio debía demostrar, y en gran parte creemos que se ha conseguido, que CNT2 se expresa en sistema nervioso central y que este transportador de alta afinidad para Ado está sujeto a una regulación purinérgica, así como también lo está en situaciones experimentales de hipoxia/isquemia, favoreciendo en estos casos la acción neuroprotectora de este nucleósido. Este avance en conocimiento incorpora al modelo de regulación de los niveles extracelulares de Ado la proteína CNT2, de la cual su farmacología 5

6 hasta ahora es muy poco conocida, especialmente si la comparamos con la de los receptores purinérgicos de tipo P1. Creemos que esta es la principal observación de este estudio y la que debería permitir potenciar ulterior investigación en la farmacología de CNT2 como eventual diana terapéutica en el tratamiento del ictus y enfermedades neurodegenerativas. 4. Publicaciones Pinilla-Macua, I., Aymerich, I., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Pastor- Anglada, M. The high-affinity adenosine transporter, rcnt2, requires dual sorting signals for its trafficking to plasma membrane. Purinergic Signalling 6:66, Suppl. 1, 2010 IF: 2.87 Medina-Pulido, L., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Burgaya, F., Pastor- Anglada, M. Purinergic regulation of the nucleoside transporter rcnt2 in rat neuronal model. Purinergic Signalling 6:66, Suppl. 1, 2010 IF: 2.87 Estas dos publicaciones son resúmenes de conferencias y existen dos primeros trabajos en vías de publicación. 6