Citotoxicidad Celular y Fagocitosis

Transcripción

1 Citotoxicidad Celular y Fagocitosis Dra. Sabrina Andara. Profesora invitada Cátedra de Inmunología Escuela de Medicina José María Vargas Facultad de Medicina Universidad Central de Venezuela 2016

2 Objetivos específicos 1.- Describir los mecanismos de citotoxicidad mediada por células, precisando mediadores solubles, de membrana y celulares implicados 2.- Describir las características morfológicas y funcionales de los fagocitos 3.- Describir el proceso de fagocitosis y destrucción intracelular de patógenos 4.- Explicar el fundamento de las diversas pruebas de la función fagocítica 5.- Enumerar los trastornos de la función fagocítica en humanos

3 CITOTOXICIDAD CELULAR

4 Citotoxicidad Celular Mecanismo efector esencial de la respuesta inmunitaria Rama celular Defensa contra: Patógenos intracelulares (Virus, algunas bacterias y parásitos) Células tumorales Células propias alteradas sometidas a estrés térmico o traumático. Importante en el rechazo de tejidos alógenicos (Trasplantes)

5 Células Citotóxicas Linfocitos T citotóxicos Específicos de antígeno CTL Células Asesinas Naturales Inespecíficas de antígeno Linfocitos NK Linfocitos NKT

6 Cada tipo de linfocito T efector expresa un conjunto particular de moléculas efectoras CD45 RO Mayor sensibilidad a la activación por PP/MHC TCR No requieren coestimulación Alta expresión moléculas de adhesión FAS CD40 CD40 CITOCINAS: IFN- TNF-β IFN- IL-2 IL-4, IL-5 MOLÉCULAS DE MEMBRANA: GRÁNULOS TÓXICOS: FAS-L CD40L CD40L Perforinas y Granzymas

7 Células T Citotóxicas CTL Marcadores: CD3 y CD8 Maduran en timo Pre-CTL: Ly T CD8 que todavía no tienen actividad citotóxica Generación de CTL efectores: 1.- Señal específica de Ag transmitida por el complejo TCR (reconocimiento péptido-mhc clase I) 2.- Señal co-estimuladora (CD28-B7) 3.- Interacción IL-2 con receptor IL-2: Proliferación y diferenciación de CTL-P activado por Ag hacia CTL efector

8 Después de 5 días del encuentro con el Ag

9

10 Proliferación de CTL memoria no requiere de TH1

11

12 Mecanismos de Citotoxicidad 1. Interacciones Celulares Directas 2. Interacciones Celulares Indirectas: Citoquinas, Fas-Fas L soluble

13 1. Reconocimiento TCR- PP/MHC 1 2. Adherencia firme. Mayor afinidad LFA-1 por ICAM- 1(5-10min) luego disminuye afinidad y se disocian.

14 1. Formación de conjugado CTL-Célula Blanco. (aumento de Ca 2+ intracelular) 2. Orientación de gránulos (Aparato de Golgi) hacia membrana y fusión con esta (exocitosis) 3. Liberación perforina monomérica 4. Cambio de conformación monomeros de perforina (inducido por Ca2+) Se insertan en membrana célula blanco 5. Se polimerizan dentro de la membrana 6. Formación de poros Entrada de granzimas

15 Proteína de los gránulos de las células T citotóxicas Perforina Granzimas 5 Granzimas en humanos Granzimas A, B y C Granulisina Acción sobre la célula diana Se polimeriza para formar un poro en la membrana Serin-proteasas Activan la apoptosis (Vía apoptósica) al llegar al citoplasma de la célula diana. Fragmentación del DNA. Media la despolarización de la membrana mitocondrial en células diana y liberación de citocromo C, promoviendo apoptosis

16

17 Fas - Fas L Muerte celular mediada por Receptores

18 Citotoxicidad indirecta mediada por Citoquinas Muerte celular mediada por Receptores

19 Entrecruzamiento de CD95 o TNFR1 Trimerización del receptor Unión de proteínas adaptadoras a dominios de muerte Reclutamiento y activación de caspasas Apoptosis.

20 Tipos de Muerte Celular Apoptosis Necrosis Proceso de autodestrucción activo Requiere expresión de genes y síntesis proteica activa Culmina en desnaturalización del genoma por endonucleasas Formación de cuerpos apoptóticos Encogimiento celular Degradación de la cromatina Los eventos son ordenados No hay inflamación Daño tisular masivo por noxas como: Trauma, calor, hipoxia, tóxicos, etc. Asociada a lesiones de membrana (lisis osmótica). Se pierde organización celular. Conduce a inflamación del tejido circundante No ocurre bajo condiciones fisiológicas

21 NECROSIS APOPTOSIS Fragmentación del núcleo Integridad de la membrana Diseminación del contenido intracelular Cuerpos apoptóticos Fagocitosis con INFLAMACION Fagocitosis sin INFLAMACION

22 Celulas NK Natural Killer o Citotóxicas Naturales Son linfocitos grandes granulares No tienen TCR, no expresan Ig de membrana Se activan por IFN- y TNF Su mecanismo de destrucción no es específico, pero no es al azar (células infectadas y algunas líneas tumorales pero no células normales) No tienen restricción por MHC Defensa contra virus y tumores Citotóxicas de manera constitutiva. Siempre tienen gránulos en su citoplasma. No genera memoria inmunitaria

23 Activación Ly NK Balance entre señales activadoras e inhibidoras de receptores en células NK

24 Activación Ly NK Las células modificadas pueden expresar bajos niveles de MHC I. Los virus pueden inhibir la síntesis de proteínas entre ellas la mayor producción de MHC I inducida por IFN. Proteína virales pueden bloquear el ensamblaje y transporte de las moléculas clase I. Los virus pueden alterar la glicosilación de proteínas celulares del hospedador. La unión de Receptores Activadores (como NKR-P1) junto con una baja expresión o unión a Receptores KIR activa a las células NK para que maten a las células blanco por Apoptosis. Las señales inhibitorias tienden a superar a las activadoras

25 Receptores: 1. Activadores - Tipo Lectina: CD94/NKG2D o C (dominios ITAM) ligando MIC A y B - Tipo Inmunoglobulina: NKp30,44,46 - CD16 (R de Ac) 2. Inhibidores - Tipo Lectina: CD94/NKG2A (dominios ITIM) ligando HLA-E - Tipo Inmunoglobulina: KIR. Ligando móleculas HLA B o C

26 ADCC. Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos

27 Actividad efectora anti-viral de linfocitos NK y linfocitos T citotóxicos IL-12

28 Ly NKT Poseen TCR (invariante) Ligando Glicolipidos por CD1d No forman células memoria Marcadores de células NK Secretan Il-4 INF- Il-2

29 FAGOCITOSIS

30 Fagocitosis Fagocitosis se define como el acto de engullir, con el propósito de destruir, un objeto, tal como un microorganismo Liu H, Pope RM. Phagocytes: mechanisms of inflammation and tissue destruction. Rheum Dis Clin N Am 30 (2004) 19-39

31 Células Fagocíticas Localización Neutrófilos Sangre periférica Macrófagos Tejidos Vida Media Horas Prolongada Blanco Bacterias Piógenas Bacterias,Virus y Protozoarios intracelulares Otras funciones: Presentación Antigénica y Citotoxicidad.

32 Gránulos Específicos Gránulos Azurófilos Gránulos Azurófilos 0,5 μm 1.500/ célula Lisozima Mieloperoxidasa Elastasa Catepsina G H + Hidrolasas Defensinas BPI - Depósitos de Glucógeno Les permite actuar de forma eficiente en Anaerobiosis. - Estallido respiratorio mayor que MO generan mayor cantidad de reactivos de O2 y Nitrógeno. Gránulos Específicos 0,2 μm 3.000/ célula Lisozima Citocromo b 558 OH - fosfatasa Lactoferrina Proteína Fijadora de Vitamina B 12

33 Monocitos y Macrofagos - Tamaño 5-10 veces - Complejidad estructural y organelas - Capacidad fagocítica - Enzimas líticas

34 Macrófagos ACTIVADOS: Aumento de su eficacia por mayor: - Capacidad fagocítica - Potencial para destruir patógenos - Secreción mediadores inflamatorios - Actividad citotóxica - Expresión MHC II

35 Fases de la Fagocitosis 1.Movilidad 2.Reconocimiento y Adhesión 3.Ingestión 4.Desgranulación 5.Muerte intracelular

36 Fases de la Fagocitosis Moléculas de Adhesión Quimiocinas Complemento Sistema de la Coagulación Interacción PAMP-PRR Opsonización Complemento IgG

37 Moléculas de Reconocimiento Patrones Moleculares Asociados a Patógenos PAMPs Receptores de Reconocimiento De Patrones PRR También receptores para moléculas opsonizantes: - Inmunoglobulinas - Complemento

38 PAMPs Infecciones Extracelulares Lipopolisacárido Ácido lipoteicoico Mananos Glicolípidos Infecciones Intracelulares Secuencias no metiladas CpG RNA bicatenario Bacterias Gamnegativas Bacterias Grampositivas Pared celular de levaduras Micobacterias DNA Bacteriano Virus RNA

39

40 Fagocitosis en ausencia de señal de Peligro Fagocitosis de células apoptóticas Señales de cómeme No desencadena eventos inflamatorios Molécula Candidata: C1q

41 Fases de la Fagocitosis Activación del Citoesqueleto Emisión de Pseudópodos Englobamiento Formación del Fagosoma

42

43 Fases de la Fagocitosis En minutos Formación del fagolisosoma

44 Fases de la Fagocitosis Clase de Mecanismo Acidificación Productos tóxicos derivados de Oxígeno Productos tóxicos derivados de Nitrógeno Péptidos Antimicrobianos Enzimas Competidores Productos específicos ph = ~ , bacteriostático o bactericida Superóxido, Peróxido de Hidrógeno, radical hidroxilo, hipoclorito NO Defensinas y proteínas catiónicas Lisozima (disuelve la pared celular de ciertas bacterias grampositivas) Hidrolasas ácidas (digestión de la bacteria) Lactoferrina (une Fe) y proteína fijadora de vitamina B 12

45 Destrucción mediante intermediarios reactivos de Oxígeno Citosol Proceso fagocítico Membrana Proceso oxidativo Gránulo Flavocitocromo b 558 Desencadenante Anión superóxido (para pasar a 2 enzima: superoxido dismutasa) 2. Peróxido de Hidrogeno 3. Radicales hidroxilo 4. Hipoclorito (Por enzima Mieloperoxidasa)

46 Destrucción mediante intermediarios reactivos de Nitrógeno NO Sintetasa L-ARGININA CITRULINA L-NMMA 1. Óxido Nítrico 2. Superóxido 3. Dióxido de Nitrógeno

47 Destrucción mediante mecanismos independientes de Oxígeno Catepsina G Defensinas de bajo PM Proteínas catiónicas de alto PM Proteína incrementadora de la permeabilidad bacteriana (BPI) Lisozima Daño a las Membranas microbianas Escinde los mucopéptidos de la pared celular bacteriana Lactoferrina Forma complejos con el hierro Enzimas proteolíticas Otras enzimas hidrolíticas diversas Digestión de microorganismos digeridos

48 Factores secretados por Macrófagos Activados Interleukina 1 (IL-1) Interleukina 6 (IL-6) Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) Proteínas del Complemento Enzimas hidrolíticas Interferón α (IFN-α) Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) GM-CSF G-CSF M-CSF Promueve respuestas inflamatorias y fiebre Promueven la inmunidad Innata y la eliminación de Patógenos Promueven la respuesta Inflamatoria y la eliminación de patógenos Promueven la respuesta Inflamatoria Activa genes celulares, dando lugar a la producción de proteínas que confieren un estado antiviral a la célula Destruye algunas células tumorales Promueve la hematopoyesis inducible

49 Métodos de Estudio de la Fagocitosis Conteo de PMN Conteo de monocitos y Macrófagos Pruebas de Movilidad de PMN Prueba de Movilidad al azar: Método del tubo capilar Prueba de la membrana para quimiotaxia Pruebas de reconocimiento y adherencia CD18 (Subunidad β de LFA-1, Mac-1 y CR4) Receptores para CC e IG FcR y CR

50 Cámara de Boyden Two chambers are separated by a filter through which cells migrate. Chemotactic gradients can be set up by placing different concentrations of the putative chemo-attractant in the upper and lower chambers. The advantage of the Boyden chamber is that is can discriminate between chemo-kinetic and chemotactic influences. The use of this chamber requires that the cells under test have to move in three dimensions (most do) and to squeeze between the pore size of the particular filter. Filters are available in different average pore sizes, so this latter point is seldom a problem. The Boyden chamber is reproducible and the chemokinetic, chemotactic response easy to quantify.

51 Prueba para quimiotaxia de PMN PMN Sust. Quimiotáctica Sust. No Quimiotáctica

52 Prueba para quimiotaxia de PMN

53 Métodos para el Estudio de la Fagocitosis Pruebas de Ingestión Cuenta Directa al Microscopio de Luz Estimación de la radioactividad emitida por fagocitos que han ingerido partículas marcadas Medición de la tinción de lípidos Análisis mediante citometría de flujo

54

55 Métodos para el Estudio de la Fagocitosis Pruebas de Desgranulación Fagocitosis Frustrada Pruebas de Muerte Intracelular Prueba de Reducción del Azul de Tetrazolio Nitrado Quimioluminiscencia Citometría de Flujo (Estallido Oxidativo) Análisis Microbicida de Neutrófilos

56 Fagocitosis Frustrada PMN Enzimas Lisosómicas IgG agregada

57 Prueba Cuantitativa del NBT azul de tetrazolio nitrado NBT Látex Formazán Piridina

58 Quimioluminiscencia - O - 2 H 2 - H 2 - H 2 H 2

59 Quimioluminiscencia - O - 2 H 2 - H 2 - H 2 H 2

60 Quimioluminiscencia - O - 2 H 2 - H 2 - H 2 H 2

61 Quimioluminiscencia COO - Inestable H 2 H 2 H 2 H 2 -

62 Quimioluminiscencia COOH Edo. Basal H 2 H 2 H 2 H 2 -

63 Citometría de Flujo

64 Análisis Microbicida de Neutrófilos

65 Alteraciones de la Función Fagocitaria Neutropenia congénita o adquirida Síndrome de Job Deficiencia de Mieloperoxidasa Deficiencia de Glucosa-6-P Deshidrogenasa Leucemia aguda Disfunción Transitoria del Neutrófilo Infecciones agudas Ataxia-Telangiectasia Crioglobulinemia Enfermedad Granulomatosa Crónica Síndrome de Chédiak-Higashi Déficit de Adhesión leucocitaria Prematuridad Síndrome de Down Susceptibilidad a infección por micobacterias Modelo de Enfermedades autoinmunes

66 Bibliografía Roitt: Inmunología Fundamentos Kuby: 5ta. Edición Stites (Sección de métodos de estudio)

67 Muchas Gracias!