PROYECTO PRODUCCIÓN NACIONAL INSULINA HUMANA RECOMBINANTE

Transcripción

1 PROYECTO PRODUCCIÓN NACIONAL INSULINA HUMANA RECOMBINANTE

2 Denver Farma S.A. Una compañía local de capitales íntegramente Argentinos

3 Pancreas Glandula insulina Regulador del metabolismo de los Hidratos de Carbono (Azucares)

4 La ausencia o la disminución de la secreción de INSULINA DIABETES Enfermedad metabólica, cuya falta de tratamiento tiene pronóstico grave, insuficiencia renal, shock hiperglucémico, ceguera, muerte, entre otros

5 Epidemiologicamente, se cálcula que en la Argentina el 7% de la población padece Diabetes La mitad NO lo sabe La otra mitad esta bajo tratamiento 0.6% de la población depende su vida de la administración de Insulina UNOS PACIENTES Reciben tratamiento financiado por el estado mediante la Ley 11620

6 Tratamiento de la Diabetes Tipo I. Insulino dependientes, deben administrarse INSULINA Tipo II. No insulino dependientes, deben tratarse con hipoglucemiantes orales Insulino requirentes, alternativamente usan insulina o hipoglucemiantes orales

7 Como se produce Insulina Humana? Desde su aislamiento en 1912 hasta 1980, mediante proceso extractivo de glándula animal, bovino o porcino, incluso humanizada Desde mediados de los 80, mediante biotecnología ADN recombinante.

8 PRODUCCION INDUSTRIAL DE INSULINA HUMANA RECOMBINANTE UN DESAFIO DE GRAN ESCALA

9 Principales objetivos del Proyecto Producir Insulina Humana por ingeniería genética Costos de producción competitivos Volúmenes de producción acordes a la demanda Buscar la posibilidad de Patentar

10

11 Como Llegamos al Producto??

12

13 Biología Molecular

14 Levaduras recombinantes. Fuente de Insulina

15 Selección de los clones recombinantes MD MD MM

16

17 Banco de Células

18 Cultivo celular Desarrollo Fermentativo

19 Banco de Células de Trabajo(BCT) Working Cell Bank (WCB) Banco Células Primario Banco de Células de Trabajo

20 FERMENTADOR SALIDA AIRE Ácido Base ph OXIGENO DISUELTO TEMPERATURA Agua fría Agua caliente AIRE ESTERIL

21 Parámetros de Proceso

22 Downstream Purificación

23

24

25 Purificación de proteínas por HPLC preparativo

26 Diseño del proceso de purificación

27

28 Cómo medir el consumo de insulina? LAS UNIDADES INTERNACIONALES (UI), PERMITEN SUMAR LOS CONSUMOS TOTALES

29 Denver Farma $ ,02 Sanofi $ ,14 Eli Lilly $ ,59 Novo Nordisk $ ,94 IMS Health Datos proyectados para 2014, en base a ventas a Junio y PVP Kairos

30 Scaling Up Pilot Plant R&D Laboratoty 50 ml Shake-flask culture 2.5 l Fermentor, with 1.5 l working volume 20 l Fermentor, with 15 l working volume 370 l Fermentor, with 300 l working volume

31 Pilot Plant Biorreactor 370L

32 Process Lay Out

33 Fermentation Process for a MUT+ Phenotype Pichiastrain 1. Glycerol batch phase for initial cell growth, 2. Glycerol fed-batch, for increasing biomass, 3. Methanol phase for AOX1 induction and IP (insulin precursor) expression.

34 Methanol Induction of a Mut+ Pichiastrain: Expression of an Insulin Precursor 1,0 2, ,8 2, Methanol (%) 0,6 0,4 Precursor (g/l) 1,5 1, OD 600 nm Cell (%) 0,2 0, ,0 0, Time (hs)

35 In Process Control Along the process, samples are taken to perform the following assays: Biomass (dry weight, optical density) Methanol concentration (GC) Product quality and concentration (HPLC, SDS-PAGE, Western Blot)

36 First Step Separation Methodology Continuous centrifugation Results Yield: 85% recovery, with 2-5% cells Cycle: 0,5-1,5 hs

37 Second Step Separation Methodology Cross Flow Filtration, 0,22 um hollow fibber Results: Cell free supernatant Filtration Yield: 85% Cross Flow Filtration Cycle: 5 hs.

38 Fermentation Yield 3000 L Fermenter 30% biomass (2,5 g/l IP) 70% supernatant Centrifugation Tangential Flow Filtration 3,8 kg IP

39 DOWNSTREAM Insulin Process Flow Sheet TFF-UF FERMENTATION CAPTURE UPSTREAM CENTRIFUGATION ENZYMATIC TREATMENT INTERMEDIATE PURIFICATION POLISHING TFF CRYSTALLIZATION

40 Downstream Processing Capture Capture: during the capture the IP is recovered from the culture medium through an ionic exchange chromatography. During the elution, some contaminants areremoved

41 Capture Pool of Precursor desb30minic-insulin

42 Impure Recombinant Insulin

43 Purified Recombinant Insulin

44 Upstream Yield and Process Cycle FERMENTATION: 2,5 g/l CENTRIFUGATION FILTRATION CYCLE: hs

45 Dowstream Yield CAPTURE PRECIPITATION ENZYMATIC DIGESTION INTERMEDIATE PURIFICATION POLISHING CRYSTALLIZATION YIELD: 0,3-0,5 g/l PURITY: > 98,5% INSULIN

46 rh-insulin and Insulin Analogues Molecular characterization

47 Molecular Characterization Plasmid DNA sequence Aminoacid sequence of the insulin precursor and the mature product (crystals API) Mapping Peptide with V8 protease Binding to the insulin receptor (in vitro assay) Mapping peptide and Mass Spectrophotometry Circular dichroism Bio identity Potency

48 SDS-PAGE FOR CHARACTERIZATION OF FERMENTATION SAMPLES fermentación AND de TRYPSIN insulina ELIMINATION y separación de tripsina Control de proceso mediante SDS-PAGE

49 SDS Sylver Stained geles for the detection of Trypsin in aspartic insulin samples

50 Carboxipeptidasa-B detection by WB assay in Aspart Insulin

51 Glucose determination in mice treated with Bio 07 Insulin and Aspart Insulin

52 Pichia pastoris Host Cell proteins Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Pichia pastoris Host Cell Proteins(Commertial Kit) Sensitivity: 1 ppm. Developed In House Sensitivity: 3 ppm

53 Pichia pastorishost DNA Kit Quant-iT dsdna HS Assay (Q32851) Invitrogen. Calibration with standards plusp. pastoris DNA. Read the sample. Sensitivity: 5 ppm.

54 Pichia pastorishost DNA PCR in house developed PCR with specific insulin primers. Sensitivity: 0.5 ppm

55 Determination of cell viability in the presence of different insulin concentration using 2 cell lines: CHO and Swiss mouse 3T3. CellTiter 96 cell proliferation assay (Promega) was employed S3T3 cell viability stimulated for 24 hs. 1,2 1 Abs. 490 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Co ntro l Insulina control 1 mg/ml Bio 4 1 mg/ml Bio 4 G50 1 mg/ml FCS 10 % Insulina control 0,1 mg/ml Bio 4 0,1 mg/ml Bio 4 G50 0,1 mg/ml

56 Patents Process for obtaining Aspart Insulin using a Pichia pastoris yeast strain USPA EURASIA: P00428(EA Expression of Human Insulin Precursor in P. Pastoris. US 7,091,032;. Mexico IMPI: Canadá 2,357,072 Argentina Cepa de Levaduras Metilotróficas Recombinantes Productoras de un Precursor de Insulina, Construcciones de ADN y Método para Obtener la Cepa AR025646B1. Un procedimiento paraincrementar los rendimientos en la expresión de proteínas recombinants expresadas en Levaduras Metilotróficas. AR040162B1. Cepa de Levaduras Metilotróficas Recombinantes Productoras del Homodímero BB de PDGF Humano, Construcciones de ADN y Métodos Para Obtener Dicha Cepa AR034567B1

57 Biosimilares Se refiere a proteínas y péptidos extraídos de fuentes naturales o producidos por biotecnología, similares a productos que ya han sido aprobados, de los cuales se toman aquellos conocimientos científicos de seguridad y eficacia como datos confiables Dos productos serán considerados biosimilares si se demuestra que ambos tienen el mismo principio activo, misma forma farmacéutica y se demuestra que son terapéuticamente equivalentes

58 Disposición : Registro de especialidades medicinales de origen biológico con antecedentes en otras especialidades medicinales de origen biológico autorizadas (Biosimilares) Aunque la definición de BIOSIMILAR utilice términos técnicos, basados en propiedades analíticas y clínicas del producto, en verdad, es una definición que se origina en el campo de la REGULATORIA y se utiliza para definir una EM que se registra mediante una vía particular. ANMAT ( ): Art(2): Establécese que a fin de dar cumplimiento a lo dispuesto en el artículo 1 de la presente, el solicitante deberá presentar la información fisicoquímica, farmacéutica y biológica descripta en la Disposición A.N.M.A.T. NO 7075/11, o la que en el futuro la sustituya, conjuntamente con estudios efectuados que permitan, por un lado, demostrar similar comportamiento en términos de identidad, potencia y perfil de pureza del producto a registrar con el seleccionado como comparador o referente del mismo (ejercicio de comparabilidad) y por otro lado generar la evidencia que permita juzgar comportamiento similar en cuanto a su seguridad y eficacia.

59 FDA -EMA FDA (Explicita): The biological product is highly similar to the reference product notwithstanding minor differences in clinically inactive components; and there are no clinically meaningful differences between the biological product and the reference product in terms of the safety, purity, and potency of the product. 42 U.S.C. 262(i)(1). EMEA: Biosimilarity is not explicitly defined, but is situational: Whether a medicinal product would be acceptable using the similar biological medicinal product approach depends on the state of the art of analytical procedures, the manufacturing processes employed, as well as clinical and regulatory experiences. CHMP/437/04. Comparability studies are needed to generate evidence substantiating the similar nature, in terms of quality, safety and efficacy, of the new similar biological medicinal product and the chosen reference medicinal product authorised in the Community. CHMP/437/04.

60 Ensayos de Bio Similaridad La similaridad con el producto de referencia debe estar claramente demostrada con la totalidad de datos del ejercicio de comparabilidad Una exhaustiva caracterización y comparación de las propiedades fisicoquímicas y la actividad biológica del biosimilar y el producto original es el concepto fundamental y el prerrequisito para una reducción en la cantidad de datos no-clínicos y clínicos.

61 Diferencias entre moleculas de sintesis y biologicos (Recombinantes) DEXAMETASONA (síntesis) RITUXIMAB (Recombinante)

62 Características propias de los productos proteicos Estructura Fisicoquímica Son mas complejas que los productos de síntesis Su caracterización requiere de la combinación de análisis fisicoquímicos y biológicos La calidad esta estrechamente relacionada con el proceso de producción ( producto = proceso ) Regulatorio No se los puede considerar productos genéricos La similaridad entre productos incluye análisis fisicoquímicos y una serie de ensayos no clínicos y clínicos, específicos para cada producto.

63 Caracterización de Proteínas Secuencia primaria (mapeo peptídico), IE, HPLC, gel electroforesis Potencia, bioensayos en células, ADCC, modelos animales Conformación, dicroísmo circular, espectroscopia, cristalografía Glicosilación, análisis de monosacáridos, perfil de oligosacáridos, CE, MALDI- TOF, MS/MS Fosforilación, mapeo peptídico con MS Truncado, gel electroforesis, SE-HPLC, mapeo peptídico-ms Pegylación, HPLC, CE Agregación, SE-HPLC, el electroforesis Oxidación, desamidación, HPLC Proteínas del Huesped, ELISA, endotoxinas. Binding, ELISA, ensayos celulares, espectroscopía Actividad Biológica, ensayos celulares, modelos animales

64 process is the product. Carson KL. Flexibility The guiding principle for antibody manufacturing. Nature Biotechnol 23(9): 1054 (2005)

65 5-Definición de las especificaciones para cada atributo de calidad critico: Rangos de aceptación y rechazo. Enfoque de la problemática: Análisis de diferentes lotes del original (difícil). Ejercicio de comparabilidad: Es el desarrollo experimental por el cual se demuestra que el producto en desarrollo es biosimilar al producto original, es decir, donde se establecen formalmente las especificaciones, los atributos de calidad y sus rangos de variación; donde también, se detectan las diferencias y se establece el perfil de riesgo asociado a las mismas. Así, es posible registrar una nueva especialidad medicinal, en adelante el biosimilar, demostrando biosimilaridad con otra ya aprobada por la autoridad regulatoria pertinente y con comercialización efectiva (CHMP/437/04), que se denominará el original o referencia. Esto se hace demostrando formalmente, mediante lo que se define como un ejercicio de comparabilidad, que ambas especialidades son similares en términos de calidad, seguridad y eficacia. Atributo Especificacion Isoforma Rango % % % n xxx-xxx

66 Que implica realmente el ejercicio de comparabilidad Biosimilar desde la analítica: Es una molécula idéntica al original en términos de estructura primaria (secuencia), que puede presentar variaciones (micro-heterogeneidades) cuantitativas y cualitativas en sus atributos de calidad con respecto al original. No obstante, estas variaciones se encuentran dentro de los limites especificados por el original o en su defecto, las diferencias son identificadas y se demuestra que no impactan en el perfil de seguridad ni de efectividad del medicamento (esto último es muchas veces un intangible y está sujeto a discusión). Asimismo, un biosimilar debe demostrar bioequivalencia con el original o referencia. 1-Origen de la complejidad. (Conocimiento profundo de la molécula). 2-Identificación de los atributos de calidad críticos (Quality Attributes). Quality by design, TQPP, normas ICH. 3-Eleccion del producto de referencia. Muchas observaciones mayores a los ejercicios de comparabilidad son referidas a la elección del producto de referencia: Este NO puede ser estandar de referencia, solo son aceptables EM. La secuencia primaria debe ser idéntica.

67 Diferencias-Similaridad Mismo productos con cambio de proceso EPOrecomb: Idéntica secuencia de aminoacidos. Distintos clones vs distintas células

68 EM aprobados vía biosimilaridad EMEA, FDA, ANMAT Al 2011 ANMAT: 0 FDA: 0 EMA: 14

69 Los biológicos mas complejos, pueden ser biosimilars? Cuanto debemos conocer? Idea: C. Nick Cuanta similaridad necesitamos?

70

71

72

73 Glicoproteínas Un número alto de proteínas se encuentran unidas covalentemente a uno o más carbohidratos, formando glicoproteínas Abarca un amplio espectro de proteínas con diferentes funciones: enzimas, proteínas de transporte, receptores, hormonas, proteínas estructurales. El contenido de carbohidratos es variable, desde 1 hasta 90% del peso de la proteína. Los carbohidratos pueden estar distribuidos uniformemente en la estructura proteica o estar concentrados en una región particular de la proteína.

74

75 Acceptable changes in quality attributes of glycosylated Biopharmaceiticals NATURE BIOTECHNOLOGY VOL. 29 Nº4 APRIL 2011

76 Comparación de tributos críticos de calidad

77 Aranesp TM (darbepoetina alfa)

78 Rituxam TM / Mabthera TM (rituximab)

79 Etanercept

80 Cambio Mayor de Manufactura Avonex (interferón ß1a) El producto tomado como referencia fue el Bioferon. Avonex desarrolló su propio proceso de manufactura Se debió cambiar la Línea Celular Teniendo en cuenta datos fisicoquímicos y el resultado de múltiples bioensayos la FDA los consideró suficientemente comparables para tomar los datos de eficacia de Bioferon como soporte de la aprobación de Avonex

81 Evolución de Anticuerpos Monoclonales Mabs Murino humano Murine mab Chimaeric mab Humanized mab Fully Human mab Arcitumomab (CEA-Scan ) (1996) Infliximab (Remicade ) (1999) Trastuzumab (Herceptin ) (2000) Adalimumab (Humira ) (2003) Immunogenicity

82 Origen de la complejidad y atributos de calidad

83 Características Mab vs Prot de Fusión Mabs CEPT IEF Etanercept

84 Top 5 Biotecnológicos Marca Ingrediente Activo Indicación Compañía 2011 ventas globales (US$ billion) Humira adalimumab Arthritis Abbott 7.9 Enbrel etanercept Arthritis Amgen 7.3 Remicade infliximab Arthritis Johnson & Johnson 6.9 Lantus insulin glargine Diabetes sanofi-aventis 5.9 MabThera rituximab Arthritis Roche 5.5

85 El mercado mundial de medicamentos biológicos y biotecnológicos Mercado mundial de medicamentos en el año 2011: 941 mil millones U$S (IMS). América Latina representa el 5,1% del total. Mercado mundial de medicamentos biológicos y biotecnológicos ascendió a 157 mil millones U$S, con un crecimiento del 8,8% respecto del año anterior. Los medicamentos biotecnológicos representaron el 17% del mercado total en el Se proyecta que ese porcentaje ascenderá a 23% en el año Los 10 primeros productos concentran el 34,5% de esas ventas, con un crecimiento anual del 10,3% respecto del año 2010.

86 Implicancias para pacientes y médicos Los biosimilares permiten mejorar el acceso de la población al segmento de productos bioterapéuticos, con costos reducidos El prolongado tiempo necesario para desarrollar un biosimilar asícomo los altos requerimientos regulatorios para asegurar su calidad, seguridad y eficacia hacen que la reducción en su precio no sea todo lo profunda como se ha logrado para drogas de síntesis Sin embargo, ha sido estimado que con un 20% de reducción en el precio de 5 biofarmacéuticos con patentes vencidas permitirán ahorra mas de 1.6 billones de euros/año en EU y de 9 a 12 millones de dólares/año al gobierno de US por los próximos 10 años

87 Principales Patologías Enfermedades autoinmunes 15% Tratamientos oncológicos 15% Diabetes 13% Vacunas 8% Esclerosis múltiple 7%

88 CONCLUSIONES GENERALES Los BIOSIMILARES o FOLLOW-ON son concepciones originadas en la REGULATORIA de EM. *Su existencia se debe a la necesidad del estado de balancear las necesidades de los pacientes (y de la sociedad en general) y de la motivación a invertir e innovar de la industria farmacéutica: Favorecer la innovación y la inversión de las farmaceuticas. Evitar la duplicación de ensayos clínicos en humanos innecesarios. Acortar tiempos de aprobación. Asegurar el acceso a la mayoría de la población de tratamientos efectivos de alto costo. *Con el estado analítico actual ES POSIBLE caracterizar algunas moléculas biológicas, con márgenes de riesgo aceptables (FDA, EMEA, ANMAT). Pero NO TODASlas moléculas son susceptibles a ser consideradas biosiosimilares considerando la complejidad intrínseca especifica de algunas proteínas.