MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA GENERAL Y ALIMENTARIA

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1 Fundación H. A. Barceló Facultad de Medicina 2do.AÑO MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA GENERAL Y ALIMENTARIA Módulo 3 Metabolismo, nutrición y control del crecimiento microbiano. UNIDAD 3: Control del crecimiento microbiano. Docentes Dra. Susana Carnevali de Falke Dra. Maria Claudia Degrossi 1

2 OBJETIVO Comprender que el estudio de los sistemas químicos y biológicos utilizados por los microorganismos para establecer y mantener la vida y los factores ambientales que promueven su crecimiento, sirven para interpretar los métodos que se pueden utilizar para controlar su crecimiento. z. Comprender la cinética de muerte de los microorganismos y la utilidad de los valores D y Estudiar y comprender los medios físicos y químicos utilizados, sus aplicaciones prácticas y algunos mecanismos utilizados por los microorganismos para vencer los intentos para su control. Analizar y entender la importancia del estudio del metabolismo, la formación de esporas, el mecanismo de acción de los agentes antimicrobianos, la resistencia a los antibióticos y la epidemiología. EJES TEMÁTICOS Generalidades. Términos utilizados con mayor frecuencia Cinética de muerte microbiana. Condiciones que influyen sobre la eficacia de un agente antimicrobiano. Control microbiano por agentes físicos. Control microbiano por agentes químicos. GENERALIDADES Deberíamos comenzar con una pregunta: Por qué es necesario controlar el crecimiento microbiano? Si volvemos al módulo anterior y calculamos el número total de microorganismos (por ej. Escherichia coli) que se pueden obtener en 48 horas a partir de una sola célula de esta bacteria, veremos que su masa es mucho mayor a la masa de la Tierra. Si bien es un ejemplo teórico, pues en la naturaleza y otros medios biológicos el crecimiento está limitado por los nutrientes y factores ambientales, nos ayuda a ver la dimensión que adquiere el desarrollo de los microorganismos. Si bien muchos microorganismos son beneficiosos y necesarios para el bienestar humano, la actividad microbiana puede tener efectos indeseables como el deterioro de los alimentos y el desarrollo de enfermedades. 2

3 Su control, se puede llevar a cabo de dos maneras, mediante la utilización de agentes físicos o químicos que pueden actuar: 1. matando a los microorganismos 2. inhibiendo su crecimiento La utilización de un sufijo denota la acción de los agentes antimicrobianos sobre los microorganismos. Así podemos distinguir: Microbicida: los agentes que destruyen los microorganismos, a menudo tienen el sufijo cida (del latín, cida, destruir). Pueden ser eficaces contra un grupo específico de microorganismo, en cuyo caso se denominan: bactericidas, fungicidas, algicidas, viricidas. Los germicidas son aquellos que destruyen microorganismos patógenos (y muchos no patógenos) pero no necesariamente endosporas. Microbiostático: los agentes que no destruyen sino que inhiben el crecimiento microbiano, tienen el sufijo stático (del griego statikos, que causa detención). Por ejemplo bacteriostático, fungistático. Estos agentes actúan destruyendo o inhibiendo microorganismos patógenos y no patógenos. Su capacidad para reducir la población total microbiana es muy importante en numerosas situaciones. TÉRMINOS UTILIZADOS CON MÁS FRECUENCIA La terminología empleada tiene una especial importancia cuando se aborda el control microbiano. Hay términos como desinfectante y antiséptico que suelen emplearse como sinónimos. Un tratamiento particular puede inhibir el crecimiento o destruir los microorganismos, según las condiciones y agentes empleados. Por otro lado algunos procesos pueden requerir la eliminación o destrucción completa de microorganismos y otros sólo necesitan disminuir la población microbiana hasta límites aceptables. Por ello es imprescindible utilizar una terminología adecuada, para evitar confusiones. Algunos términos utilizados en el control de los microorganismos son: Antisepsia (del griego anti, contra; sepsis, putrefacción): Es la destrucción o eliminación de agentes infecciosos y contaminantes en tejidos vivos. Los antisépticos son agentes químicos que se aplican sobre los tejidos para prevenir una infección destruyendo o inhibiendo el crecimiento de los agentes patógenos. Como no deben dañar el tejido del huésped, los antisépticos no suelen ser tan tóxicos como los desinfectantes. Desinfección: es la destrucción o eliminación de agentes infecciosos y contaminantes que se encuentran fuera del organismo, por aplicación directa de medios físicos o químicos. 3

4 No incluye necesariamente endosporas o virus. Normalmente es un compuesto químico que se aplica sobre un objeto o material y tiende a reducir o inhibir el crecimiento, no suele esterilizar. Se aplica al uso de soluciones químicas sobre superficies o a la eliminación de patógenos del agua, como en la cloración del agua. Esterilización (del latín sterilis, incapaz de reproducirse): es el proceso de destrucción de todas las formas de vida en un objeto o hábitat, incluidas las endosporas, virus y viroides. Es absoluta, no hay grados de esterilidad. Un objeto o hábitat esterilizado está totalmente libre de microorganismos viables, endosporas y otros agentes infecciosos. Limpieza: La eliminación de tierra, residuos de alimentos, suciedad, grasa u otras materias objetables. (Codex Alimentarius). Saneamiento: las acciones destinadas a mantener o restablecer un estado de limpieza y desinfección en las instalaciones, equipos y procesos de elaboración a los fines de prevenir enfermedades transmitidas por alimentos. (Res.233/98 SENASA) Sanitización: está estrechamente relacionado con desinfección. El sanitizante es el agente que reduce el número de microorganismos a niveles bajos, de manera que no sean riesgosos para la salud. Se utilizan sobre elementos inanimados y están generalmente ligados a operaciones de limpieza de elementos diversos. CINÉTICA DE MUERTE MICROBIANA Cuando se aplica un agente letal sobre una población microbiana, ésta no muere instantáneamente, sino que su muerte sigue una función exponencial o logarítmica, es decir se reduce en niveles iguales a intervalos constantes (Tabla 1). Si realizamos un experimento teórico de destrucción térmica microbiana (a 121ºC) y suponemos que partimos de una muestra inicial que contiene 10 6 microorganismos vegetativos por ml y que el 90% de los mismos se destruyen durante cada minuto de exposición, obtendremos: Minutos Nºmicroorg.al Microorg. destruidos en Microorg.al Log.de comienzo del 1 minuto (90% del total) final de 1 supervivientes ensayo minuto x x x x x Tabla 1 Destrucción térmica de microorganismos 4

5 Si graficamos el logaritmo del nº de microorganismos de la población superviviente en función del tiempo de exposición al agente empleado, resulta una línea recta, tal como se ve en la Figura 1. Gráfico 1 - Cinética de muerte microbiana log.nº de supervivientes tiempo muerte microbiana Figura 1 Cinética de muerte microbiana CONDICIONES QUE INFLUYEN SOBRE LA EFICACIA DE UN AGENTE ANTIMICROBIANO La destrucción de los microorganismos y la inhibición de su crecimiento no es sencilla porque la eficacia de un agente antimicrobiano depende al menos de seis factores: 1.- Tamaño de la población: en cada intervalo se destruye una fracción constante de la población microbiana. Si ésta es muy grande se necesitará más tiempo para destruirla, lo cual se puede comprobar volviendo al ejemplo presentado en el punto anterior (Tabla 1). 2.- Composición de la población: la eficacia de un agente varía considerablemente con la naturaleza de los microorganismos ya que estos difieren sustancialmente en cuanto a su susceptibilidad. Las endosporas bacterianas son mucho más resistentes a la mayoría de los agentes antimicrobianos que las formas vegetativas, y las células más jóvenes se destruyen con más facilidad que los organismos maduros. Algunas especies son capaces de soportar mejor que otras las condiciones adversas. Por ej. Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis es mucho más resistente a los agentes antimicrobianos que la mayoría de las bacterias. 3.- Concentración e intensidad del agente antimicrobiano: la eficacia de un agente antimicrobiano normalmente no está directamente relacionada con su concentración o intensidad. En un rango corto, un aumento pequeño en la concentración ocasiona una elevación exponencial de la eficacia; por encima de cierto punto, los aumentos pueden que no incrementen en absoluto la velocidad de destrucción. Esto dependerá fundamentalmente de la naturaleza del agente empleado. Por ejemplo el etanol al 70% es más eficaz que al 95% 5

6 4.- Duración de la exposición: cuanto más tiempo se exponga una población a la acción de un agente antimicrobiano, más microorganismos se destruirán. 5.-Temperatura: normalmente un agente químico incrementa su eficacia al aumentar la temperatura. Por ello, con frecuencia se puede reducir la concentración de un desinfectante o esterilizante si se utiliza a una temperatura superior. Hay que tener en cuenta que otros agentes pueden no ser afectados o disminuir su actividad al aumentar la temperatura. 6.- El entorno: la población a destruir no está aislada, sino rodeada de factores ambientales que pueden ofrecer protección o facilitar su destrucción. ph. La actividad de un agente antimicrobiano puede influenciarse por los cambios de ph. El calor destruye más fácilmente a un ph ácido, por lo tanto los alimentos y bebidas ácidas, como frutas y hortalizas, se pasteurizan con más facilidad que los alimentos con valores de ph más altos, como la leche. Los agentes químicos tienen su ph óptimo de acción. Algunos como los derivados de amonio cuaternario actúan mejor a ph neutro o ligeramente alcalino, mientras que el cloro es más activo a ph ácido, bajo la forma de ácido hipocloroso no disociado. Materia orgánica. La existencia de materia orgánica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, etc.) puede proteger a los microorganismos frente al calor y los desinfectantes químicos. Su presencia afecta negativamente la actividad de ciertos agentes químicos hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante, ya que al combinarse con la materia orgánica disminuyen su concentración efectiva. Para que el desinfectante actúe, debe ponerse en contacto con el microorganismo y ser absorbido por él. La suciedad, grasas, proteínas, materia orgánica, constituyen barreras que impiden ese contacto protegiendo a los microorganismos de la acción del desinfectante. Cuando el suministro de agua de una ciudad tiene un elevado contenido de materia orgánica, hay que añadir más cloro para desinfectarlo. CONTROL MICROBIANO POR AGENTES FÍSICOS Los agentes físicos más utilizados para el control del crecimiento microbiano son: Calor Bajas temperaturas Presión osmótica Desecación Irradiación Filtración CALOR: el fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esterilizar y desinfectar desde la época de los griegos, siendo el calor aún hoy en día uno de los métodos más comunes para destruir microorganismos. La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización de proteínas y a la fusión de lípidos de membrana, debido a que se 6

7 rompen muchos enlaces débiles, sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos C=O y H2-N. Se puede aplicar húmedo o seco. Debería ser de primera elección para todas las situaciones donde pueda emplearse, salvo elementos termosensibles o presencia de tejidos vivos, ya que reúne una serie de condiciones: Simple Económico Fácil de controlar No deja residuos sobre el material tratado Eficaz Hay que tener en cuenta el tipo de calor, el tiempo y la temperatura empleados para asegurar la destrucción de todos los microorganismos. La temperatura letal varía con cada microorganismo. El tiempo requerido depende del número de microorganismo, especie, naturaleza del producto, ph y temperatura. Las endosporas bacterianas son las más resistentes y su destrucción garantiza la esterilidad. Calor húmedo: la inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. En la Tabla 2 se observan las condiciones aproximadas necesarias para la destrucción de microorganismos utilizando el calor húmedo. Organismo Condiciones Bacterias* Células vegetativas 10 minutos a 60-70ºC Endosporas de 2 a 800 minutos a 100ºC Levaduras 5 minutos a 50-60ºC Mohos 30 minutos a 62ºC Esporas fúngicas Entre 5 a 30 minutos a 80ºC Virus 30 minutos a 60ºC *condiciones para bacterias mesófilas Tabla 2 Condiciones aproximadas para destruir microorganismos con calor húmedo Los diferentes procesos que se pueden llevar a cabo mediante la utilización de calor húmedo son: Ebullición: una exposición al agua en ebullición durante 30 minutos es suficiente para destruir células vegetativas y esporas de eucariotas, sin embargo es insuficiente para eliminar las endosporas bacterianas. Tindalización: (nombre en honor de John Tyndall) es un método de esterilización fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a más de 100ºC. Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 ó 4) de dos fases sucesivas cada uno. En la primera el material se calienta a una temperatura entre 90 y 100ºC, durante 30 minutos; en la segunda el material se incuba en una estufa, a 30-37ºC durante 24 horas. El primer 7

8 ciclo destruye todos los microorganismos salvo las endosporas bacterianas, las cuales germinarán durante la incubación posterior y se destruirán durante el segundo calentamiento. Pasteurización: mediante este procedimiento puede destruirse la mayoría de los agentes infecciosos: bacterias vegetativas, hongos, protozoos, Micobacterium tuberculosis y virus, pero los organismos termodúricos y termófilos y las esporas bacterianas no son afectados. Este procedimiento tiene gran aplicación en la industria de alimentos. También mediante la utilización de agua caliente o vapor de agua, se utiliza para desinfectar instrumentos, superficies, equipos, etc. Esterilización mediante autoclave: se realiza a 121ºC durante 15 minutos aproximadamente, mediante la utilización del autoclave. Es un procedimiento eficaz pero debe ser llevado a cabo en condiciones apropiadas, el material esterilizado deberá ser conservado en condiciones adecuadas. Sustancias termolábiles pueden ser desnaturalizadas o destruidas. El Autoclave (introducido por Chamberland en 1884) es un aparato que permite calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sin que ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. Los parámetros de esterilización suelen ser: temperatura 121ºC y min. Como se puede deducir, estos parámetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especies saprofitas, que son las formas de vida que más soportan el calor sin perder viabilidad. En la práctica, hay que emplear muchas veces condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volúmenes de líquido, habrá que prolongar el tratamiento, ya que el centro del recipiente donde va el líquido tarda más en alcanzar la temperatura de esterilización. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a 115ºC, ya que a temperaturas superiores la glucosa carameliza ; por lo tanto, en estas ocasiones, el tiempo también es mayor). Parámetros que caracterizan la inactivación por calor de una suspensión bacteriana Como el calor es tan eficaz para destruir microorganismos es esencial poder disponer de una medida precisa de su eficacia. Ésta puede expresarse como: tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para destruir todos los organismos de una suspensión microbiana a una temperatura específica y en condiciones definidas. Como la destrucción es logarítmica y, en teoría, no es posible destruir completamente los microorganismos de una muestra, incluso aumentando el tiempo de calentamiento, se utiliza otros parámetros. 8

9 punto térmico mortal: es la temperatura mínima a la que una suspensión microbiana se destruye en 10 minutos. Punto térmico mortal Microorganismos 55ºC Escherichia coli 60ºC Mycobacterium tuberculosis 120ºC Endosporas de Bacillus Tabla 3 Punto térmico mortal para distintos microorganismos tiempo de reducción decimal (Valor D) y valores z y F: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura. Si se representa el logaritmo del número de células supervivientes a un tratamiento térmico (realizado a una temperatura dada) en función del tiempo de tratamiento, se obtiene un gráfico como el de la figura 2. Figura 2 Cinética de termodestrucción y valor D La recta tiene una pendiente que permite calcular la velocidad de termodestrucción. Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N 0 como el número de células al inicio del tratamiento y N x el número de células supervivientes después de un tratamiento de x minutos a una temperatura t, el tiempo de destrucción decimal se calcula de la siguiente manera: 9

10 Las unidades del valor D se expresan en minutos. El valor D varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas. Cuando se aumenta la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica, esto se puede ver en la figura 3: Figura 3 Valor z El valor D indica el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se reduzca al 10% de la población inicial. El valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial. La fórmula incluida en la gráfica permite calcular el valor z cuando conocemos el incremento de temperatura (t 2 -t 1 ) y los respectivos valores D. Los valores D y z varían para cada microorganismo y para cada condición. Microorganismo Sustrato Valor D (ºC) en minutos Valor z en ºC Clostridium botulinum Solución amortiguadora de D 121 = fosfatos Clostridium perfringens Medio de cultivo D 90 = (cepa termorresistente) Salmonella Pollo a la King D 60 = Staphylococcus aureus Pollo a la King D 90 = Pavo relleno D 90 = ClNa al 0.5% D 90 = Tabla 4 Valores D y z para distintos microorganismos y distintos sustratos (Fuente: CDC Atlanta 1979 adaptado de Prescott, Harley y Klein, Microbiología, 1999) 10

11 Las esporas, por ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetativas de los mismos microorganismos. Los microorganismos presentes en los alimentos, por otra parte, suelen tener valores D más altos que cuando se cultivan en condiciones de laboratorio. Para poder determinar las condiciones en las que hacer un tratamiento térmico para destruir microorganismos es necesario dominar los conceptos de los valores D y z. Otro valor que tiene gran importancia para describir la eficacia del calentamiento es el valor F que es el tiempo, medido en minutos, a una temperatura determinada (generalmente a 121.1ºC) necesario para destruir una población microbiana o sus esporas. En la industria alimentaria se utilizan ampliamente estos valores y es muy importante saber trabajar correctamente con ellos. Algunas aplicaciones principales del calor húmedo: 1. En la práctica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de medios de cultivo y soluciones. 2. En la esterilización de material quirúrgico. 3. En la esterilización o inactivación parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados). Calor seco: Como ya dijimos, la esterilización por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la fusión de membranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor seco son los daños por oxidación y el provocar un aumento de la concentración de electrolitos. Aplicaciones del calor seco: El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a ºC durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metálico, aceites y jaleas, etc. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metálicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias. Incineración de materiales de desecho: para destruir cartones, telas, etc. BAJAS TEMPERATURAS. Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) retrasan el crecimiento microbiano, y aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación (p.ej., especies patógenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo bacteriostático, ya que durante un almacenamiento prologando 11

12 los psicrófilos y los psicrótrofos se multiplican y producen descomposición de los alimentos. Ciertos microorganismos son muy sensibles al frío, y su número se reducirá en estas circunstancias, pero el frío no produce disminución significativa de las poblaciones microbianas totales. En el laboratorio, la congelación se aplica para preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Para maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cómo se efectúa tanto la congelación como la descongelación. Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo. Se lo utiliza para guardar cultivos durante largas temporadas. Para preservar aún mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a añadir a la suspensión ciertas sustancias, como glicerina, lactosa, leche, suero, etc. que protegen a los microorganismos de los efectos indeseables del frío. DESECACIÓN La mayoría de los microorganismos no pueden desarrollar a una a w reducida (<0.90). Esto es utilizado usualmente para preservar los alimentos (frutas, granos, etc.). Los métodos involucran la remoción de agua del producto por calor, evaporación, freeze-drying, adición de sal o azúcar La desecación al aire (sin vacío) mata a las células vegetativas bacterianas, pero no a las endosporas. Sin embargo algunas especies pueden conservar su viabilidad. La sensibilidad a la desecación varía de una especie a otra. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia de luz), de ahí que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos. En cambio, el vibrión colérico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de sólo dos horas. Las causas de la muerte son, principalmente: el aumento de concentración intracelular de sales, lo que conlleva efectos tóxicos y desnaturalizantes de proteínas daños por oxidación. Los microorganismos se hacen más resistentes a la desecación cuando están embebidos en mucosidad, heces o pus, de allí que esto es de suma importancia en hospitales donde el polvo, uniformes y ropas de cama, pueden contener microorganismos procedentes de estos materiales desecados (heces, pus u orina). Los virus son más resistentes, pero no tanto como las endosporas. Liofilización: es la desecación al vacío de una muestra previamente congelada. Aplicada a bacterias, es uno de los métodos que mantiene por más tiempo la viabilidad bacteriana (varios años). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero se congela 12

13 sobre hielo seco (-78ºC) y se conecta a una bomba de vacío, que provoca la desecación. La eliminación de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la viabilidad de ésta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente, hasta su uso que puede ser incluso muchos años después. PRESIÓN OSMÓTICA: la utilización de sales y azúcares para la conservación de los alimentos está basada en los efectos de la presión osmótica. RADIACIONES: Algunas formas de radiación electromagnética son muy perjudiciales para los microorganismos. Particularmente nos interesan las radiaciones ionizantes y la radiación ultravioleta. Efecto de las radiaciones ionizantes. Las radiaciones ionizantes son de longitud de onda muy corta o de energía alta. En la práctica, la unidad que se emplea es el Gray (Gy). Las fuentes de radiaciones ionizantes son los rayos X y los rayos gamma, que se emiten durante la desintegración de los radioisótopos como el Co60 o el Cs137. Sus efectos dependen de la dosis de exposición, o sea, de la cantidad de radiación a que se somete un material. A dosis bajas se producen mutaciones en los microorganismos y pueden causar indirectamente su muerte, mientras que niveles superiores son directamente letales. Aunque los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantes que los seres superiores, pueden ser destruidos con una dosis suficientemente grande. El tratamiento matemático de la destrucción de microorganismos por estos procedimientos es similar al utilizado para el tratamiento térmico. Algunas bacterias y las endosporas bacterianas pueden sobrevivir a dosis elevadas de radiación ionizante. Diversos cambios producidos en las células se deben a la radiación ionizante ruptura de los enlaces de hidrógeno; oxidación dobles enlaces destrucción de las estructuras en anillo polimerización de algunas moléculas El oxígeno aumenta estos efectos destructivos probablemente por la generación de radicales hidroxilo (OH. ). Aunque pueden afectarse muchos tipos de constituyentes, es lógico suponer que la destrucción del DNA sea la causa más importante de muerte celular. Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilización de: material farmacéutico; 13

14 material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc.); alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento). Debido al gran poder penetrante de las radiaciones hay que mantener normas y controles de seguridad muy estrictos en su manipulación: planchas protectoras de plomo y revisiones periódicas de los manipuladores. Ventajas: es más controlable que el calentamiento ya que la penetración de la radiación es profunda, instantánea y uniforme. Mantiene las características de frescura del producto, al no producir variación de sus características organolépticas. La FDA acepta la irradiación como un método seguro. En 1981 el comité de expertos de la FAO aceptó la irradiación hasta 10 kgy, declarándolo atóxico y considerando innecesarios exámenes toxicológicos complementarios. El Codex Alimentarius, órgano de FAO que dicta normas para las buenas prácticas de elaboración y manipulación de alimentos, tomó (marzo de 2003) en consideración las conclusiones de FAO y OMS de 1999, y aceptó la irradiación a dosis superiores a 10 kgy cuando existe una necesidad tecnológica justificada. En estos enlaces pueden obtener información sobre la irradiación de alimentos: Efectos de las radiaciones ultravioleta. Pueden producir la muerte de todas las clases de microorganismos debido a su longitud de onda corta. La más letal es la de 260 nm. que es absorbida eficazmente por el DNA. Los rayos UV no tienen actividad ionizante. El mecanismo principal de destrucción por radiación UV es la formación de dímeros de timina en el DNA. Dos moléculas de timina contiguas en una cadena de DNA se unen covalentemente inhibiendo la replicación y función del DNA. Este daño puede repararse mediante diferentes mecanismos. Su inconveniente es que no es penetrante y no atraviesa eficazmente el cristal, las partículas de suciedad y otras sustancias. Debido a ello la radiación UV se utiliza como agente esterilizante en muy pocas situaciones. La luz ultravioleta es utilizada usualmente en la esterilización de superficies y la esterilización del aire y superficies expuestas en las cabinas de seguridad. Las principales aplicaciones de las radiaciones ultravioletas son: Control de esporas de mohos en panaderías. 14

15 Desinfección del agua para la preparación de alimentos. Depuración del marisco. Podría servir para desinfectar superficies, pero la protección de los MO por la materia orgánica (grasas) puede reducir su eficacia. Desventajas: Pueden acelerar la rancidez por alterar los ácidos grasos insaturados. Produce quemaduras en la piel y en los ojos. FILTRACIÓN: Involucra la remoción física de todas las células de un líquido o gas, especialmente importante para esterilizar soluciones que se desnaturalicen por el calor como vitaminas, aminoácidos, antibióticos, etc. Consiste en hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana (diámetro de poro =0,22μ, 0.45μ, 0.80μ). El mismo principio se utiliza en los filtros HEPA (High efficiency particulate air filters), que retiene partículas > 0.3 μ utilizados por ejemplo en quirófanos y salas con pacientes quemados; en bioterios; en laboratorios de microbiología. CONTROL MICROBIANO POR AGENTES QUÍMICOS Los agentes químicos son sustancias que matan o inhiben el crecimiento de microorganismos. Incluyen desinfectantes, conservadores, antisépticos, y drogas utilizadas en el tratamiento de enfermedades del hombre o de las plantas. Los agentes antimicrobianos de origen natural o sintético, pueden ser: Esterilizantes son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana (o sea su "muerte"). Desinfectantes (o germicidas) son capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes. No necesariamente matan las esporas. Se utilizan sobre objetos inanimados tales como mesas, pisos, utensilios, etc. Cloro, hipoclorito, compuestos clorados, compuestos de amonio cuaternario son algunos ejemplos. Conservadores: son utilizados para inhibir el desarrollo microbiano, generalmente en alimentos. Su ingesta no debe ser tóxica. Propionato de calcio, benzoato de sodio, nitritos, dióxido de azufre son algunos ejemplos. Se establecen límites regulatorios para estas sustancias. 15

16 Agentes antisépticos son sustancias químicas antimicrobianas con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican. Son lo suficientemente inocuos como para ser aplicados sobre la piel y las mucosas, no deben ingerirse. Mercuriales, nitrato de plata, yodo, alcohol, detergentes son algunos ejemplos. Quimioterápicos son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del organismo. Pueden ser: quimioterápicos de síntesis: agentes antimicrobianos de origen sintético utilizados en el tratamiento de enfermedades microbianas o víricas. Sulfonilamidas, isoniazidas, ethambutol, AZT, cloranfenicol. Esta clasificación no incluye los agentes sintéticos utilizados para la terapia contra enfermedades de origen no microbiano. Antibióticos: son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos (antibióticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibióticos semisintéticos), que a pequeñas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostáticos), tras ser administrados por vía adecuada a un organismo receptor. La mayor parte de los antibióticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (actinomicetos, Bacillus, etc.) o eucariotas (hongos de los géneros Penicillium, Cephalosporium, etc.). Penicillium y Cephalosporium, son la fuente de los antibióticos beta-lactámicos (penicilinas y sus derivados). Los Actinomycetes, especialmente las especies de Streptomyces, producen una variedad de antibióticos como los aminoglucósidos (estreptomicina), macrólidos (eritromicina) y tetraciclinas. Los bacilos formadores de esporas como Bacillus producen antibióticos polipeptídicos tales como polimixina y bacitracina. DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS. Los agentes químicos son utilizados frecuentemente para la desinfección y antisepsia. Los factores que influyen en su eficacia son los expuestos anteriormente. Su utilización apropiada es fundamental para la industria, los hospitales o centros de salud y el laboratorio. Estos agentes intervienen en algunas etapas de la vida microbiana. Sus mecanismos de acción no son tan simples y puntuales sino que, por lo general, son complejos, participando muchas veces varios de ellos. Por ello se los puede agrupar de acuerdo a su acción sin descartar que puedan ejercer otro mecanismo, simultáneamente y secuencialmente (Tabla 5) 16

17 Mecanismo Daños en la pared y membrana celular Desnaturalización de proteínas y grupos enzimáticos Daños en el material genético Agente Aldehídos Solventes orgánicos Detergentes Parabenos Fenoles y derivados Agentes Halógenos Agentes alquilantes Alcoholes Acidos y álcalis Metales pesados Agentes Colorantes Oxido de etileno Tabla 5 Desinfectantes y/o antisépticos según su mecanismo de acción (Adaptado de D Aquino, M; Rezk, R. Desinfección, desinfectantes, desinfestantes, limpieza ) Desinfección. Se acepta como buen desinfectante aquel que reduce en 5 logaritmos la población microbiana, o sea que provoca una mortandad del 99,999%. En la desinfección la regla de oro es que la limpieza debe preceder a la desinfección. Una excepción a esto es cuando se produce una contaminación accidental. En estas circunstancias es importante desinfectar de inmediato, antes de limpiar, invirtiendo el orden, a fin de preservar al operario y disminuir la contaminación ambiental. Hay numerosos agentes químicos disponibles para su uso como desinfectantes pero pueden ser afectados por diversos factores. Uno de estos factores a tener en cuenta es su estabilidad. Los desinfectantes son estables en sus formulaciones originales, sin diluir. No obstante algunos como las soluciones de hipoclorito sódico, requieren de valoraciones periódicas para comprobar su concentración. Por lo tanto la utilización de desinfectantes tiene LIMITACIONES E INCONVENIENTES. En manos descuidadas o personas mal informadas, estos agentes químicos pueden transformarse en FUENTES DE INFECCIÓN. Por ello al elegir a un desinfectante, se debe conocer sus características y propiedades y tener en cuenta: su efectividad, simplicidad; su especificidad para los microorganismos; no deben ser tóxicos ni corrosivos para los elementos a tratar; su costo (precio y concentración de uso recomendado). 17

18 También se deben seguir las siguientes recomendaciones: Medir correctamente la cantidad de desinfectante y la cantidad de agua para efectuar la dilución de uso. No volver a llenar con nuevo desinfectante, un envase que ya lo contuvo, primero lavarlo y desinfectarlo (pasteurización). No utilizar el desinfectante preparado el día anterior, preparar una dilución fresca cada día y desechar el sobrante al finalizar la jornada de trabajo. No usar dos desinfectantes juntos, salvo que uno de ellos sea alcohol. No mezclar desinfectantes con detergentes. No desinfectar sobre la suciedad. Lavar antes de desinfectar, la desinfección no reemplaza a la limpieza ni es efectiva. Tener en cuenta las incompatibilidades entre el desinfectante y las superficies con las que se contacta (envases, materiales, etc) Aplicarlo tratando de alcanzar las condiciones óptimas de efectividad (temperatura, ph, tiempo de contacto, etc.) Controlar los resultados obtenidos mediante las técnicas microbiológicas adecuadas. El no cumplimiento de estas pautas entraña un doble peligro: Falla en el proceso de desinfección. Aumento en el riesgo de infección, ya que las bacterias que sobreviven en una solución desinfectante deteriorada, pueden desarrollar en la misma, y alcanzar resistencia. AGENTES QUIMIOTERÁPICOS. Son agentes antimicrobianos utilizados en el tratamiento de enfermedades infecciosas. La moderna era de la terapia antimicrobiana comenzó en 1929 con el descubrimiento de Fleming de la penicilina y Domagk descubrió en 1935 los químicos sintéticos (sulfonamidas) con una amplia actividad antimicrobiana. En 1940 con la necesidad de agentes antibacteriano para ser utilizados en la Segunda Guerra Mundial, la penicilina fue aislada, purificada e inyectada en animales de experimentación, donde se encontró que no solamente curaban las infecciones sino que poseían una baja toxicidad. Este hecho marcó el inicio de la era de los antibióticos e inició una intensa búsqueda de agentes similares que poseyera una baja toxicidad y fueran efectivos en el tratamiento de las enfermedades 18

19 infecciosas. Le siguieron el rápido aislamiento de la estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina y para 1950, estos y otros antibióticos ya eran de uso clínico. La propiedad más importante de los agentes antimicrobianos de uso clínico, especialmente visto desde el punto de vista del paciente, es su toxicidad selectiva, esto significa que el agente actúa de alguna manera inhibiendo o matando las células bacterianas, pero no tiene (o a un nivel muy pequeño) toxicidad sobre el animal que toma la droga. Esto implica que el proceso bioquímico en la bacteria es diferente del que ocurre en las células animales y constituye una ventaja en el uso de los antimicrobianos. Estos agentes antimicrobianos pueden tener un efecto microbicida o estático. Su mecanismo de acción depende del agente elegido. Algunos actúan inhibiendo la síntesis de la pared celular, otros la síntesis de ácidos nucleicos, otros como antimetabolitos bloqueando las rutas metabólicas, entre otros. El rango de bacterias u otros microorganismos sobre los que actúa efectivamente el antibiótico se denomina su espectro de acción. Aquellos antibióticos que son efectivos contra un amplio rango de microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos, se dice que tienen un amplio espectro. Resistencia bacteriana a los antibióticos. La resistencia bacteriana puede ser: Inherente o natural Las bacterias Gram-negativas tienen una membrana externa que establece una permeabilidad contra el antibiótico. Un organismo puede carecer del sistema de transporte para un ATB, o carecer del objetivo o punto de acción del mismo. Resistencia adquirida resulta de cambios en el genoma bacteriano y es regida por dos procesos: mutación y selección e intercambios de genes entre cepas y especies. Sobre la resistencia bacteriana y sus consecuencias es interesante la lectura del artículo que figura en Lecturas sugeridas. LECTURA OBLIGATORIA Capítulo 7 Control del crecimiento microbiano del libro Introducción a la Microbiología de Tórtora-Funke-Case. BIBLIOGRAFÍA 1. D Aquino, M; Rezk, R. Desinfección, desinfectantes, desinfestantes, limpieza Eudeba, 1995, Buenos Aires, Argentina 2. D Aquino, M; Saneamiento: Higiene y sanidad Ediciones H.Macchi Buenos Aires, Argentina 19

20 3. Ingraham, J. L.;Ingraham, C.A. Introducción a la Microbiología (Vol I y II), Editorial Reverté, Barcelona, España 4. Madigan M.T., Martinko J.M.,Parker J. Brock. Biología de los Microorganismos Ed. Pearson Alhambra. 10ª. Edición. 5. Prescott,L.M.; Harley,J.P.; Klein, D.A. Microbiología. 1999, McGraw Hill-Interamericana. Madrid, España 6. Tortora, G.J., Funke, B. R., Case, C.L. Introducción a la Microbiología Editorial Médica Panamericana, 9ª.Edición. ACTIVIDADES 1. Cómo podemos saber cuando un microorganismo está muerto? 2. Distinga y compare los siguientes términos: esterilización, sanitización, pasteurización, limpieza, tindalización, desinfección, antisepsia, saneamiento. Cuál es la definición del Codex Alimentarius para desinfección? 3. Cuál es la ventaja del calor frente a otros métodos de esterilización? 4. Compare el uso del calor húmedo con el calor seco desde el punto de vista de: su aplicación, mecanismo de acción, eficiencia. Utilice una tabla o esquema. 5. Interprete los datos para Staphylococcus aureus que figuran en la tabla Investigue los distintos tipos de pasteurización y esterilización utilizados en la industria alimentaria. A qué se denomina esterilización comercial? 7. Se estudió la resistencia térmica de 2 patógenos: Escherichia coli O157:H7 y Listeria monocytogenes en un jugo de uvas concentrado (58 Brix, ph 3.3). Se obtuvieron los siguientes valores: Microorganismo Valores D Escherichia coli O157:H7 D 62 C = 2 ± 0.3 min Listeria monocytogenes D 62 C = 1 ± 0.1 min Cuál de los patógenos es más resistente al proceso térmico en esas condiciones? 8. Luego de la lectura del siguiente texto conteste a las consignas formuladas. En una planta de lácteos se trabaja en el diseño del proceso de pasteurización de la leche. Se pretende emplear un tiempo de pasteurización de 12 minutos a una temperatura de 60ºC. La materia prima (leche fresca) de la cual se parte contiene una población inicial de UFC/l. El D 60ºC de Salmonella spp. en la leche es de 4 min. Consigna 1. Cuál será la población de supervivientes luego del proceso? Para mejorar la calidad del producto se quiere llegar a una población de 1 UFC/l. 20

21 Consigna 2. Cuánto tiempo se deberá prolongar el tratamiento, partiendo de la misma población inicial? En la semana siguiente durante el proceso se detectaron fallas en el equipo, y la temperatura descendió a 56ºC. Teniendo en cuenta un valor z: 4ºC. Consigna 3. Cuántos minutos serán necesarios para obtener un producto final con una población de 1 UFC/l? 9. Se afirma que los detergentes actúan por efectos humectantes y emulsionantes. Cómo lo explicaría? 10. Investigue y compare el uso de compuestos clorados, ozono, alcohol desde el punto de vista de: su aplicación, mecanismo de acción, ventajas y desventajas. Utilice una tabla o esquema y tenga en cuenta las condiciones que debe cumplir un agente antimicrobiano. 11. Compare el uso de las radiaciones ionizantes con la luz ultravioleta desde el punto de vista de: su aplicación, mecanismo de acción, ventajas y desventajas. Utilice una tabla o esquema. 12. En un artículo aparece la siguiente afirmación: El frío es un tratamiento microbiostático. Está de acuerdo o en desacuerdo con la misma? Por qué se descomponen algunos alimentos mantenidos en refrigeración? Justifique su respuesta. 13. Sobre que productos o en qué circunstancias utilizaría la filtración? 14. Investigue sobre los distintos tipos de cabinas de flujo laminar, sus aplicaciones y alcances. Qué es una cabina de seguridad biológica? 15. Discuta la utilización de la desecación y salazón en la conservación de alimentos. 21