Simplexa TM Bordetella Universal Direct

Transcripción

1 Simplexa TM Bordetella Universal Direct REF MOL2700 Rev. F Ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para la detección cualitativa de ADN de Bordetella pertussis y/o Bordetella parapertussis. Para uso diagnóstico in vitro INDICACIONES DE USO El ensayo Simplexa TM Bordetella de Focus Diagnostics se ha diseñado para su uso en el equipo Integrated Cycler de 3M, con la finalidad de efectuar la detección cualitativa y la diferenciación in vitro de Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis en frotis nasofaríngeos de pacientes con signos y síntomas de infecciones bacterianas del aparato respiratorio. Esta prueba sirve de ayuda en el diagnóstico diferencial de infecciones por Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis. Los análisis con la prueba Simplexa Bordetella no deben realizarse a menos que el paciente reúna los criterios clínicos y epidemiológicos para el análisis de muestras sospechosas. La identificación de Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis debe realizarse en conjunto con una evaluación clínica y epidemiológica. Los resultados negativos no descartan una infección por Bordetella pertussis ni Bordetella parapertussis y no deben utilizarse como único fundamento para tratar o tomar otras decisiones sobre el tratamiento de los pacientes. RESUMEN Y EXPLICACIÓN La tos ferina, comúnmente llamada tos convulsiva, es una enfermedad del aparato respiratorio muy contagiosa causada por bacterias gram negativas pequeñas, Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis. Clínicamente, se presenta con tos prolongada, y los pacientes que cursan la forma clásica de la enfermedad suelen sufrir episodios de tos violenta tras los cuales puede aparecer un estridor inspiratorio y vómitos. En los casos graves, que por lo general se observan con mayor frecuencia en los lactantes, estos síntomas pueden ocasionar hipoxia, daño cerebral permanente o la muerte. En niños más mayores y en adultos, en especial en los que se han vacunado o han sufrido previamente la enfermedad, esta puede ser más leve y presentarse como tos prolongada. Durante la primera mitad del siglo XX, la tos convulsiva tuvo una gran prevalencia, y es probable que haya afectado anualmente al 1 % de la población 1 ; la mayoría de los casos comunicados ocurrieron en niños pequeños. La introducción de las vacunas de células completas en la década de 1940 produjo una reducción notable de la enfermedad, aunque persistió un nivel bajo de incidencia. Desde finales de los años 90, ha ocurrido un aumento notable del número de casos de tos ferina comunicados en los países desarrollados, que poseen altas tasas de vacunación. En 2004, se comunicaron casos en los Estados Unidos, con lo cual fue el año de más casos comunicados desde En Canadá y en Europa se ha observado un incremento similar 3. La Organización Mundial de la Salud estima que todos los años se producen 50 millones de casos de tos ferina en el mundo, y se producen muertes 4. La enfermedad se diagnostica en todos los grupos etarios (neonatos, niños, adolescentes y adultos). Una gran mayoría de los casos son causados por Bordetella pertussis, pero un porcentaje de casos de tos convulsiva, aproximadamente entre el 3 y el 35 %, responde a Bordetella parapertussis, que ocasiona una enfermedad similar a la tos ferina aunque más leve 5, 6. Aunque aún no se ha aclarado la causa exacta del resurgimiento de casos de tos convulsiva causados por Bordetella pertussis, se acepta ampliamente que la inmunidad conferida por la vacuna disminuye tras 7 a 10 años. Por lo tanto, al llegar a la adolescencia los niños inmunizados pueden volverse susceptibles, contraer la enfermedad y transmitir la bacteria a los lactantes con los que conviven 1, 4. Se dispone de varios métodos de laboratorio para el diagnóstico de la tos ferina, como el cultivo, la serología y la PCR. El cultivo es el método de referencia y su especificidad es del 100 %; no obstante, su sensibilidad es mucho menor. La sensibilidad del cultivo puede ser de hasta un 56 % al inicio de la evolución de la enfermedad, pero disminuye con el transcurso del tiempo y es más baja en los pacientes que han recibido tratamiento antimicrobiano o vacunación previa. El aislamiento de B. pertussis en el cultivo requiere de medios especiales y su desarrollo puede llevar entre 7 y 14 días, por lo que los resultados podrían no estar disponibles a tiempo para tratar los casos agudos. La serología, con uso combinado en la fase aguda y en la fase de convalecencia, requiere por lo menos de un intervalo de cuatro semanas entre la obtención de las muestras y no resulta de utilidad para el diagnóstico inmediato. Se ha desarrollado una prueba serológica de IgG anti toxina pertussis en muestra única para fines de investigación, pero debe realizarse por lo menos dos semanas después del inicio de los síntomas. Existen,

2 Página 2 además, pruebas serológicas para tos ferina basadas en el uso de reactivos que se comercializan, pero no han sido validadas clínicamente y es probable que no permitan diferenciar la infección reciente de la pasada o de la vacunación 10. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO La prueba consiste en una amplificación de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real y un sistema de detección que utiliza un cebador-sonda fluorescente bifuncional para la detección y la diferenciación de ADN de Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis en frotis nasofaríngeos. La prueba se ha validado con dos protocolos de ensayo diferentes. En el protocolo de EXTRACCIÓN se usa el ADN extraído de las muestras de pacientes; en el protocolo DIRECTO se usan muestras sin procesar. El ADN es amplificado mediante un cebador-sonda fluorescente bifuncional junto con un cebador inverso para cada analito y el control interno de ADN. La prueba proporciona dos resultados; Bordetella pertussis (Bp) se identifica en la muestra mediante la diana IS481, mientras que Bordetella parapertussis (Bpp) se identifica en la muestra mediante la diana IS1001. A fin de monitorizar el proceso de extracción (cuando corresponda) y detectar la inhibición de la PCR se emplea un control interno de ADN. MATERIALES SUMINISTRADOS La prueba Simplexa TM Bordetella de Focus Diagnostics contiene material suficiente para 100 reacciones (incluidos los controles). Tras recibirlos, conserve todos los reactivos a una temperatura comprendida entre -10 C y -30 C (no use congelador de tipo nofrost). Cuando se conservan a una temperatura de -10 C a -30 C, los reactivos permanecen estables hasta el final del mes de caducidad que se indica en el envase del kit. Tras el uso inicial, conserve los reactivos descongelados a una temperatura comprendida entre 2 C y 8 C durante no más de 30 días. Kit Descripción del etiquetado y de los componentes del kit Etiqueta Focus Diagnostics Simplexa Bordetella (REF MOL2700) Componentes INGLÉS REF SÍMBOLO UE Mezcla de cebadores Simplexa Bordetella MOL2701 REAG A Mezcla maestra Simplexa MOL2000 REAG B Control de extracción y amplificación de ADN MOL9001 CONTROL IC Simplexa Control negativo Simplexa (NTC) MOL2001 CONTROL NTC Control positivo Simplexa Bordetella MOL0221 CONTROL + Número de tubos por kit Código de color Etiqueta Simplexa Bordetella Primer Mix (Mezcla de cebadores Simplexa 2 Marrón REF. MOL2701 Lote Caduca Bordetella) Simplexa Master Mix (Mezcla maestra Simplexa ) 2 Verde REF. MOL2000 Lote Caduca Simplexa Extraction and Amplification Control DNA (SEAC) (Control de extracción y amplificación de ADN 3 Azul REF. MOL9001 Lote Caduca Simplexa ) Simplexa No Template Control (NTC) (Control negativo/sin molde Simplexa ) 2 Neutro REF. MOL2001 Lote Caduca Simplexa Bordetella Positive Control (PC) (Control positivo Simplexa 1 Rojo REF. MOL0221 Lote Caduca Bordetella) Componente del kit Simplexa Bordetella Primer Mix (Mezcla de cebadores Simplexa Bordetella) Reaccion es por kit/vial Descripción de los componentes del kit Volumen (µl) por vial 100/50 50 Descripción de los componentes Cebadores fluorescentes específicos para la detección de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y para el control interno de ADN. Fluoróforo Excitació Emisión Gen Diana de la sonda n (nm) (nm) diana Bp FAM IS481 Bpp CFR IS1001 SEAC Q N/C Simplexa Master Mix (Mezcla maestra Simplexa ) 100/ ADN polimerasa, tampón y dntp

3 Página 3 Simplexa Extraction and Amplification Control (SEAC) (Control de extracción y amplificación Simplexa ) Simplexa No Template Control (NTC) (Control negativo/sin molde Simplexa ) Simplexa Bordetella Positive Control (PC) (Control positivo Simplexa Bordetella) Simplexa Bordetella Barcode Card (Tarjeta de código de barras Simplexa Bordetella) variable 250 Amplicón de ADN del control interno 8/4 800 Agua libre de nucleasas variable 50 Amplicón de ADN IS481 y IS1001 n/c n/c Parámetros específicos de la prueba. MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Equipo Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versión 3,0 o superior. 2. Universal Discs para el equipo Integrated Cycler. 3. Sellador de Universal Discs 4. Micropipeta(s), de canal único, multicanal y/o de repetición, de una precisión comprendida en el rango de 1-10 µl, µl y µl. 5. Congelador (eliminación de escarcha manual) de -10 a -30 ºC (para guardar los componentes del kit congelados). 6. Congelador (eliminación de escarcha manual) de -10 a -30 ºC (para guardar congeladas las muestras) 7. Frigorífico de 2 C a 8 C (para los componentes del kit que han sido descongelados) 8. Cabina de bioseguridad (campana de flujo laminar) para las extracciones y la manipulación de muestras. 9. Microcentrífuga. 10. Mezclador vórtex. 11. Puntas de micropipetas, estériles, desechables, exentas de ARNasas/ADNasas, con protección contra aerosoles. 12. Tubos para microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml y gradillas (se recomienda usar tubos exentos de ARNasas/ADNasas, pero no es obligatorio). 13. Tubos de fondo cónico de polipropileno de 15 ml y gradillas 14. Agua libre de ARNasa/ADNasa (solo para el protocolo DIRECTO) 15. Guantes sin polvo desechables. 16. Gradillas frías para los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. 17. Bloque refrigerador para Universal Discs MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS (para uso con el protocolo de EXTRACCIÓN) 1. Tampón TE 1X (ph 8,0) libre de ARNasa/ADNasa (destinado a la preparación del control molecular para uso exclusivo con el protocolo de EXTRACCIÓN) 2. Equipo MagNA Pure LC System de Roche y elementos fungibles asociados 3. Kit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation (Nº de cat. de Roche ) PERÍODO DE VALIDEZ Y MANIPULACIÓN 1. Conserve los reactivos a una temperatura de entre -10 ºC y -30 ºC (no use un congelador de tipo «no-frost»). 2. No use los kits ni los reactivos después de la fecha de caducidad. 3. Deje que los reactivos se descongelen a temperatura ambiente antes de usarlos (aproximadamente entre 18 y 25 ºC). 4. Si la configuración de la PCR no se realiza inmediatamente después de preparar la mezcla de reacción, guarde la mezcla de reacción a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC hasta que esté listo para continuar con la configuración de la PCR. Use la mezcla de reacción antes de una hora 5. Una vez descongelados, guarde la mezcla de cebadores, la mezcla maestra, el control positivo, el SEAC y el control negativo a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC durante no más de 30 días. 6. No vuelva a congelar la mezcla de cebadores, la mezcla maestra, el SEAC, ni el control positivo. 7. No combine los reactivos de distintos lotes. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Siga las precauciones habituales. Todas las muestras de pacientes y controles positivos deben considerarse potencialmente infecciosas y deben manipularse como tales. 2. Cuando manipule los reactivos del kit, use equipos de protección personal, como guantes y batas de laboratorio, entre otros. Lávese las manos minuciosamente cuando termine de realizar la prueba. 3. No pipetee con la boca.

4 Página 4 4. No debe fumar, beber, comer, manipular lentes de contacto ni aplicarse maquillaje en las zonas en las que se usan los reactivos del kit o muestras de origen humano. 5. Elimine los reactivos del kit que no se hayan usado y las muestras humanas según las normas locales, estatales y federales. 6. El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder en una sola dirección, comenzando en las zonas de preamplificación y prosiguiendo en la zona de amplificación/detección. A continuación se muestra la secuencia de acontecimientos desde la extracción de la muestra hasta la amplificación por PCR en tiempo real. Empiece por la extracción de la muestra, continúe con la configuración del equipo de PCR en tiempo real, la preparación del reactivo y finalice con la amplificación mediante PCR en tiempo real. No use materiales fungibles ni equipos en las áreas destinadas a la extracción y preparación de muestras. No se recomienda ningún tipo de movimiento cruzado entre las diferentes áreas. Los materiales y el equipo usado para la preparación de las muestras no debe usarse para la preparación de reactivos ni para procesar el ADN amplificado ni otras fuentes de ácido nucleico diana. Los materiales fungibles de amplificación y los equipos correspondientes deben permanecer siempre en el área de equipos de PCR en tiempo real. El equipo de protección personal, como las batas de laboratorio o los guantes desechables, deben ser específicos de cada zona. 7. La contaminación de las muestras de pacientes o de reactivos puede dar lugar a resultados erróneos. Utilice técnicas asépticas. 8. Pipetee y manipule los reactivos con cuidado para evitar que se mezclen con muestras de pocillos adyacentes. 9. Utilice técnicas de pipeteo adecuadas y mantenga las mismas condiciones de pipeteo durante todo el procedimiento para garantizar valores óptimos y reproducibles. 10. No sustituya los reactivos ni los mezcle con reactivos procedentes de diferentes lotes de kits o de otros fabricantes. 11. No intercambie las tapas de los tubos de reactivos. Eso puede provocar su contaminación y alterar los resultados de la prueba. 12. Siga únicamente el protocolo descrito en este prospecto. Las desviaciones del protocolo o el uso de tiempos o temperaturas diferentes de las especificadas pueden producir resultados erróneos. 13. La preparación de la prueba debe efectuarse en un bloque refrigerador para Universal Discs (aproximadamente en el rango de 2 ºC a 8 ºC). Cuando mezcle los reactivos, mantenga frías las enzimas usando un bloque refrigerador. 14. No reutilice los Universal Discs que ya han estado expuestos a muestras de pacientes o reactivos. 15. Deseche el disco usado sin separar ni retirar la cinta de cubierta. 16. Si se preparan en el mismo disco diferentes kits o lotes Simplexa TM, en la prueba se deberán usar los controles positivos y negativos correspondientes a cada kit. 17. La mezcla maestra contiene entre 1 % y 10 % de glicerol, lo que puede causar irritación si se inhala o entra en contacto con la piel. En caso de inhalación o contacto cutáneo, deben tomarse medidas de primeros auxilios. 18. No se recomienda conservar las muestras extraídas a temperaturas de entre 2 ºC y 8 ºC de forma prolongada puesto que no se ha establecido el rendimiento en estas condiciones. INSTRUCCIONES DE USO PROTOCOLO DE ENSAYO PARA EL ANÁLISIS DIRECTO DE MUESTRAS (PROTOCOLO DIRECTO) A. RECOGIDA DE MUESTRAS Los tipos de muestras aceptables incluyen frotis nasofaríngeos en medios de transporte viral líquidos (p. ej., UTM, VCM, M4). Use solamente hisopos de punta sintética (es decir, dacrón, nailon o rayón) y varilla de aluminio o plástico. No use hisopos de alginato de calcio, ya que pueden contener sustancias que inhiben las pruebas de PCR. B. CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL 1. Consulte el manual del operador del equipo Integrated Cycler para configurar el software Integrated Cycler Studio para añadir una definición de ensayo, configurar los procesos y analizarlos en el equipo Integrated Cycler. C. ZONA DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS Área específica para la preparación de la mezcla de reacción de la prueba Simplexa TM Bordetella. 1. Descongele la mezcla de cebadores y la mezcla maestra a temperatura ambiente (aproximadamente a una temperatura de entre 18 ºC y 25 ºC). Cada vial del kit contiene suficientes reactivos para 50 reacciones. Antes de cada uso, mezcle suavemente la mezcla de cebadores y la mezcla maestra invirtiéndolas de 6 a 8 veces y centrifugándolas brevemente para que el contenido baje al fondo del tubo. 2. Prepare el volumen requerido de la mezcla de reacción en un tubo para microcentrífuga de polipropileno del tamaño adecuado pipeteando el volumen de cada componente como se indica en la siguiente tabla.

5 Página 5 Volúmenes de mezcla de reacción para uso con el protocolo DIRECTO Reactivo Mezcla de reacción/ Volumen/1 reacción Mezcla de reacción/ Volumen/10 reacciones Mezcla maestra Simplexa 4 µl 40 µl Mezcla de cebadores 1 µl 10 µl Simplexa Bordetella Agua libre de nucleasas 1,8 18 SEAC 0,2 2 Volumen total 7 µl 70 µl 3. Mezcle suavemente la mezcla de reacción mediante inversión o pipeteando de 8 a 10 veces. 4. Centrifugue brevemente para que el contenido precipite en el fondo del tubo. 5. Continúe con la preparación de la PCR. 6. Use la mezcla de reacción antes de que pase una hora desde su preparación. Si la configuración de la PCR no se realiza inmediatamente después de preparar la mezcla de reacción, guarde la mezcla de reacción entre 2 ºC y 8 ºC hasta que esté listo para continuar con la configuración de la PCR (antes de una hora). D. ÁREA DE AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL Realice la preparación del Universal Disc de 96 pocillos para la prueba Simplexa Bordetella en un área habilitada exclusivamente para ello. Use el bloque refrigerador para Universal Discs durante la carga de la muestra y la mezcla de reacción. 1. Descongele el control positivo y el control negativo a temperatura ambiente (aproximadamente en el rango de 18 ºC a 25 ºC). 2. Añada 7,0 µl de mezcla de reacción a cada pocillo. 3. Añada 3,0 µl del control positivo al pocillo del disco PC. 4. Añada 3,0 µl de la muestra del paciente al pocillo del disco "S" correspondiente. 5. Añada 3,0 μl de control negativo al pocillo del disco "NTC". 6. Cubra el disco con Universal Disc Cover Tape. 7. Cargue el Universal Disc sellado en el equipo Integrated Cycler e inicie el proceso. PROTOCOLO DE ENSAYO PARA EL ANÁLISIS DE MUESTRAS EXTRAÍDAS (PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN) A. RECOGIDA DE MUESTRAS Los tipos de muestras aceptables incluyen frotis nasofaríngeos en medios de transporte de Amies u otros medios de transporte viral líquidos (p. ej., UTM, VCM, M4). Si usa hisopos, use solo los de punta sintética (es decir, dacrón, nailon o rayón) y varilla de aluminio o plástico. No use hisopos de alginato de calcio, ya que pueden contener sustancias que inhiben las pruebas de PCR. B. ZONA DE EXTRACCIÓN DE MUESTRAS Lleve a cabo el procedimiento en el área destinada a la extracción de muestras. La preparación de muestras para la extracción debe realizarse en una cabina de bioseguridad. PREPARACIÓN DEL CONTROL POSITIVO Prepare el control positivo añadiendo 5 µl de control positivo a 195 µl de TE 1X (ph 8,0). Extracción mediante el método Roche MagNA Pure LC 1. Los ácidos nucleicos se extraen de las muestras de los pacientes y del control negativo mediante el kit MagNA Pure Total Nucleic Acid de Roche y el equipo MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor de Roche. Consulte las instrucciones de uso del fabricante sobre extracción de ácidos nucleicos con este kit. 2. En el menú desplegable «Protocol» (Protocolo) del sistema MagNA Pure LC, seleccione «Total NA» (Ácido nucleico total) y luego «Total NA Variable_elution_volume.blk» (Variable de ácido nucleico total_elución_volumen.blanco). Se cargarán los ajustes apropiados para el proceso. 3. El protocolo de la muestra debe ser «Total NA Variable_elution_volume» (Variable de ácido nucleico total_elución_volumen). 4. El volumen de la muestra debe ajustarse a 200 µl y el volumen de elución a 50 µl. 5. El volumen de dilución debe ajustarse en cero para todas las muestras. 6. Asegúrese de que el protocolo tras la elución se sitúa en «None» (Ninguno). 7. Asegúrese de que las muestras y los controles están en la posición correcta en el cartucho de muestras. 8. Mezcle cada muestra en el mezclador vórtex durante 2 a 4 segundos y centrifugue brevemente para que el contenido baje al fondo del tubo.

6 Página 6 9. Para cada conjunto de 16 muestras (muestras 1-16), pipetee 100 µl del ADN del SEAC en 6 ml del tampón de lisis MagNA Pure en un tubo de fondo cónico. Mezcle con el agitador vórtex brevemente. Añada a la bandeja apropiada del equipo de extracción MagNA Pure. Por ejemplo, si se extraen 32 muestras, pipetee 200 µl del ADN del SEAC en 12 ml del tampón de lisis MagNA Pure en un tubo de fondo cónico. Mezcle con el agitador vórtex brevemente. Añada a la bandeja apropiada del equipo de extracción MagNA Pure. 10. Pipetee 200 µl de cada muestra, del control negativo/sin molde y del control positivo en la posición correspondiente del cartucho de muestras. 11. Inspeccione visualmente el nivel de muestras y controles en el cartucho de muestras para asegurarse de que se haya agregado la muestra (o las muestras). 12. Transfiera el cartucho de muestras con las muestras al extractor automatizado de ácidos nucleicos MagNA Pure LC e inicie el proceso de extracción. 13. Después de completar la extracción del ácido nucleico, se puede retirar el cartucho con las muestras extraídas del MagNA Pure y sellarse. Guarde el ADN extraído a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC antes de usarlo. No se recomienda el almacenamiento prolongado de las muestras extraídas a esta temperatura. Mantenga las muestras de ADN extraído en un bloque refrigerador mientras carga el disco. C. CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL 1. Consulte el manual del operador del equipo Integrated Cycler para configurar el software Integrated Cycler Studio para añadir una definición de ensayo, configurar los procesos y analizarlos en el equipo Integrated Cycler. D. ZONA DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS Área específica para la preparación de la mezcla de reacción de la prueba Simplexa TM Bordetella. 1. Descongele la mezcla de cebadores y la mezcla maestra a temperatura ambiente (aproximadamente a una temperatura entre 18 ºC y 25 ºC). Cada vial del componente del kit contiene reactivos suficientes para 50 reacciones. Antes de cada uso, mezcle suavemente la mezcla de cebadores y la mezcla maestra invirtiéndolas de 6 a 8 veces y centrifugándolas brevemente para que el contenido precipite en el fondo del tubo. 2. Prepare el volumen requerido de la mezcla de reacción en un tubo para microcentrífuga de polipropileno del tamaño adecuado pipeteando el volumen de cada componente como se indica en la tabla siguiente. Volúmenes de mezcla de reacción para uso con el protocolo de EXTRACCIÓN Reactivo Mezcla de reacción/ Volumen/1 reacción Mezcla de reacción/ Volumen/10 reacciones Mezcla maestra Simplexa 4,0 µl 40 µl Mezcla de cebadores 1,0 µl 10 µl Simplexa Bordetella Volumen total 5,0 µl 50 µl 3. Mezcle suavemente la mezcla de reacción mediante inversión o pipeteando de 8 a 10 veces. 4. Centrifugue brevemente para que el contenido precipite en el fondo del tubo. 5. Continúe con la preparación de la PCR. 6. Use la mezcla de reacción antes de que pase una hora desde su preparación. Si la configuración de la PCR no se realiza inmediatamente después de preparar la mezcla de reacción, guarde la mezcla de reacción de 2 a 8 ºC hasta que esté listo para continuar con la configuración de la PCR (antes de una hora). E. ÁREA DE AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL Realice la preparación del Universal Disc de 96 pocillos para la prueba Simplexa Bordetella en un área habilitada exclusivamente para ello. Use el bloque refrigerador para Universal Discs durante la carga de la muestra y la mezcla de reacción. Para uso con el protocolo con EXTRACCIÓN 1. Añada 5,0 µl de mezcla de reacción a cada pocillo. 2. Añada 5 µl del control positivo extraído al pocillo del disco "CP". 3. Añada 5 µl de la muestra del paciente extraída al pocillo del disco "S" correspondiente. 4. Añada 5 μl de control negativo/sin molde extraído al pocillo del disco "NTC". 5. Cubra el disco con Universal Disc Cover Tape. 6. Cargue el Universal Disc sellado en el equipo Integrated Cycler e inicie el proceso.

7 Página 7 INFORME DE LOS RESULTADOS El informe de los resultados es un proceso de tres pasos. 1. Examen de los controles para determinar si el proceso es válido. El software Integrated Cycler Studio suprimirá la interpretación de los resultados del paciente si alguna de las muestras programadas como controles no son válidas. 2. Examen de la validez de los resultados de las muestras del paciente. 3. Interpretación de los resultados del paciente. Si los controles no son válidos, los resultados del paciente no se pueden interpretar. 1. Determine si el proceso es válido examinando el control negativo, el control positivo de Bordetella y el control interno de ADN. Criterios para un control válido (simplificados)* Control Bp Ct Bpp Ct DNA IC Ct Control negativo , pero 0 Control positivo 40, pero 0 40, pero 0 No aplicable *Ver notas siguientes para una descripción completa. a. Si el control negativo/control sin molde es: i. Positivo (valor de Ct [ciclo umbral] 40, pero 0 para Bp o Bpp), esto indica posible contaminación de las muestras preparadas. El control no es válido y todas las muestras de pacientes deben volver a analizarse. ii. Negativo para el detector de Bp y Bpp (Ct = 0), el control es válido y aceptable. iii. Si el ADN IC no se detecta en el control negativo/control sin molde, el proceso de la prueba no es válido y todas las muestras de pacientes deben volver a analizarse. iv. Si el ADN IC se detecta en el control negativo/control sin molde, el proceso de la prueba se considera válido y aceptable. b. Control positivo i. Si el resultado del control positivo es Ct = 0 para Bp o Bpp, el proceso de la prueba se considera inválido e inaceptable. Todas las muestras de pacientes deben volver a procesarse. ii. Si los valores de Ct correspondientes a Bp y Bpp son 40, pero 0, el proceso de la prueba se considera válido y aceptable. 2. Examen de los resultados de las muestras de pacientes. El examen de los resultados de las muestras clínicas debe realizarse después de haber examinado los controles positivo y negativo y de haber determinado si son válidos y aceptables. Los resultados de Bp, Bpp y ADN IC deben examinarse en cada muestra de pacientes. a. Se deben examinar las gráficas de amplificación de cada resultado que muestre un mensaje de "Data Quality" (Calidad de los datos). Una curva de amplificación válida presenta un aumento exponencial progresivo. Una curva de amplificación inválida puede ser no exponencial, lineal o presentar picos de datos en aquellos lugares donde puede cruzar el umbral. Si tras el examen la curva es válida, el valor de Ct informado puede usarse para determinar si las dianas de Bp o Bpp son detectadas como se indica en la sección 3, más abajo. A continuación se presentan ejemplos de curvas válidas e inválidas. Curva de amplificación válida Curva de amplificación válida Curva de amplificación inválida b. Si la curva de amplificación es válida para Bp o Bpp, no hace falta detectar el control interno de ADN (DNA IC) para informar un resultado positivo.

8 Página 8 3. Interpretación de los resultados Interpretación de los resultados Bp Bpp DNA IC Ejemplo Interpretación Valor de Ct Valor de Ct Valor de Ct , 0 Bp y Bpp no detectados 2 40, 0 0 N/C Bp detectado , 0 N/C Bpp detectado 4 40, 0 40, 0 N/C Bp y Bpp detectados Ct = umbral de ciclos. Detectado es un Ct 40, 0. No detectado es un Ct = 0. No hace falta detectar el control interno (IC) de ADN Simplexa para informar un resultado positivo. LIMITACIONES 1. Las personas que realizan los análisis deben tener formación y estar familiarizados con los procedimientos de las pruebas y la interpretación de los resultados antes de realizar el ensayo. 2. Todos los resultados de esta prueba o de cualquier otra prueba realizada junto con ella deben correlacionarse con los antecedentes clínicos, los datos epidemiológicos y otros datos disponibles para el médico a cargo de la evaluación del paciente. 3. La prevalencia de la infección influirá en el valor diagnóstico de la prueba. 4. Como ocurre con otras pruebas, los resultados negativos no descartan una infección por Bp o Bpp. 5. Pueden producirse resultados falsos negativos cuando el organismo causante de la infección tiene mutaciones genómicas, inserciones, deleciones o rearreglos o cuando las pruebas se realizan en una fase muy temprana de la enfermedad. 6. Pueden aparecer resultados falsos negativos si en la muestra hay un número inadecuado de microorganismos debido a una recogida, un transporte o una manipulación incorrectos. 7. Al igual que con cualquier otra prueba, pueden producirse resultados falso positivos. En algunas circunstancias, podría estar indicada la repetición de la prueba o la realización de una prueba con un dispositivo diferente. 8. Esta prueba es de tipo cualitativa y no informa sobre el valor cuantitativo del organismo detectado. 9. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en pacientes sin síntomas de infección por Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis. 10. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba para la monitorización del tratamiento de infecciones por Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis. 11. No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en programas de detección sistemática de la presencia de Bordetella pertussis o Bordetella parapertussis en sangre o hemoderivados. 12. Esta prueba no permite descartar enfermedades causadas por otros agentes patógenos bacterianos o virales. 13. Es posible la infección simultánea por Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis 6,7, Esta prueba no permite distinguir entre la infección por Bordetella pertussis y la infección por Bordetella holmesii. Ambos microorganismos contienen el gen IS481. Se ha comunicado que la incidencia de Bordetella holmesii en las muestras clínicas es muy baja (< 0,5 %) y no queda claro si este agente patógeno puede causar enfermedad respiratoria en individuos sanos Esta prueba no permite distinguir entre la infección por Bordetella pertussis y la infección por Bordetella bronchiseptica. B. pertussis y algunas cepas de B. bronchiseptica contienen el gen IS481. Aunque son excepcionales, se han documentado infecciones por B. bronchiseptica en lactantes y en individuos inmunocomprometidos 11. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO SENSIBILIDAD ANALÍTICA/LÍMITE DE DETECCIÓN El límite de detección (LDD) es la concentración que tiene como resultado una tasa de detección 95 %. El LDD de la prueba Simplexa ha sido evaluado empleando Bordetella pertussis A639, Bordetella pertussis ATCC 8467, Bordetella parapertussis A747 y Bordetella parapertussis E595. Se confirmó el LDD para Bordetella pertussis A639 en 2,5 cfu/ml en el caso del protocolo de EXTRACCIÓN (detección de 20/20) y en 250 cfu/ml en el caso del protocolo DIRECTO (detección de 20/20). Se confirmó el LDD para Bordetella parapertussis A747 en 10 cfu/ml en el caso del protocolo de EXTRACCIÓN (detección de 19/20) y en 1000 cfu/ml en el caso del protocolo DIRECTO (detección de 19/20). Con ambos protocolos se detectaron tanto Bordetella pertussis ATCC 8467 como Bordetella parapertussis E595.

9 Página 9 REPRODUCIBILIDAD Se llevaron a cabo dos estudios de reproducibilidad por separado. El estudio de reproducibilidad para el protocolo de EXTRACCIÓN fue realizado por dos operadores, cada uno de los cuales utilizó un equipo diferente. Cada técnico realizó una única extracción en cada muestra del panel de reproducibilidad y realizó dos procesos de PCR al día durante un total de 5 días (n=20 procesos en total). En cada proceso se analizaron tres réplicas de cada muestra y control positivo. Reproducibilidad del protocolo de EXTRACCIÓN para Bp Intra e interensayo Interequipo Identificación de las muestras n Media de Ct Intraen sayo (DE) Intra-ensayo % CV Interensa yo (DE) Interensayo, % CV Media de Ct DE % CV BP-Med 60 29,5 1,01 3,4 0,70 2,4 29,5 0,00 0,0 BP-Baja 60 32,7 0,92 2,8 0,72 2,2 32,7 0,00 0,0 BPP-Med 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 BPP-Baja 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Negativo 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Reproducibilidad del protocolo de EXTRACCIÓN para Bpp Intra e interensayo Interequipo Identificación de las muestras n Media de Ct Intraen sayo (DE) Intraensayo, % CV Interensa yo (DE) Interensayo, % CV Media de Ct DE % CV BPP-Med 60 31,1 0,43 1,4 0,28 0,9 31,1 0,41 1,3 BPP-Baja 60 34,7 0,77 2,2 0,00 0,0 34,7 0,71 2,0 BP-Med 60 39,9 0,45 1,1 0,00 0,0 39,9 0,00 0,0 BP-Baja 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Negativo 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 En el caso del protocolo DIRECTO, el estudio de reproducibilidad fue realizado por dos operadores. Cada técnico realizó un proceso en cada uno de los tres equipos por día, durante un total de 5 días (n = 30 procesos en total). En cada proceso se analizaron tres réplicas de cada muestra y control positivo. Reproducibilidad del protocolo DIRECTO para Bp Interequipo Interoperador Interproceso/día Intraproceso Total Muestra N Media de Ct DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV Control positivo (PC) 90 30,0 0,58 1,9 0,05 0,2 1,40 4,7 0,37 1,2 1,55 5,2 Positivo medio, BP 89 * 32,3 0,98 3,0 0,00 0,0 0,46 1,4 0,72 2,2 1,30 4,0 Positivo bajo, PB 90 33,2 1,16 3,5 0,00 0,0 0,24 0,7 1,11 3,3 1,63 4,9

10 Página 10 Reproducibilidad del protocolo DIRECTO para Bpp Interequipo Interoperador Interproceso/día Intraproceso Total Muestra N Medi a de Ct DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV Control positivo (PC) 90 27,7 0,67 2,4 0,05 0,2 1,45 5,2 0,38 1,4 1,65 5,9 Positivo medio, BPP 89 * 31,5 0,95 3,0 0,20 0,6 0,39 1,2 0,57 1,8 1,19 3,8 Positivo bajo, BPP 90 34,6 1,15 3,3 0,14 0,4 0,25 0,7 0,96 2,8 1,52 4,4 *Una réplica de muestra fue «No válida». REACTIVIDAD ANALÍTICA/REACTIVIDAD CRUZADA Se analizaron diecisiete (17) microorganismos para observar la reactividad cruzada potencial con Bordetella pertussis y parapertussis. Los resultados de las pruebas se resumen en las tablas siguientes: Reactividad analítica/reactividad cruzada; Bp Reactivo con potencial de reactividad cruzada Resultados del protocolo de EXTRACCIÓN Proceso inicial; Proceso de confirmación Resultados del protocolo DIRECTO Proceso inicial; Proceso de confirmación Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacteria diptheria 2/3; 0/5 0/3 Haemophilus influenzae 1/3; 0/5 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 2/3; 1/5* Gripe A/Solomon Island/03/06 H1 0/3 1/3; 0/5 Gripe B/Florida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitides 0/3 0/3 RSV B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 1/3; 0/5 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 1/3; 3/5** 0/3 Streptococcus pyogenes 0/3 0/3 *El análisis de las secuencias no demuestra una homología significativa entre el diseño del ensayo para BP y el genoma de H. parainfluenzae. **Los resultados BP positivos con S. pneumoniae no pudieron repetirse en las pruebas posteriores.

11 Página 11 Reactividad analítica/reactividad cruzada; Bpp Reactivo con potencial de reactividad cruzada Resultados del protocolo de EXTRACCIÓN Proceso inicial; Proceso de confirmación Resultados del protocolo DIRECTO Proceso inicial; Proceso de confirmación Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacteria diptheria 0/3 0/3 Haemophilus influenzae 0/3 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 0/3 Gripe A/Solomon Island/03/06 H1 0/3 0/3 Gripe B/Florida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitides 0/3 0/3 RSV B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 0/3 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 0/3 0/3 Streptococcus pyogenes 0/3 0/3 INTERFERENCIAS Se añadieron 15 sustancias endógenas y exógenas a las muestras positivas bajas de Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis y se analizó la interferencia potencial en la detección de Bp/Bpp. En el protocolo de EXTRACCIÓN, la cepa A639 de Bordetella pertussis se analizó a una concentración de 25 ufc/ml y la cepa A747 de Bordetella parapertussis se analizó a una concentración de 50 ufc/ml. En el protocolo DIRECTO, la cepa A639 de Bordetella pertussis se analizó a una concentración de 1250 ufc/ml y la cepa A747 de Bordetella parapertussis se analizó a una concentración de ufc/ml. La tabla siguiente resume los resultados del estudio de interferencias. Interferencias Interferente potencial Concentración del interferente potencial Resultados del protocolo de EXTRACCIÓN Resultados del protocolo DIRECTO Bp Bpp Bp Bpp Ampicilina 25mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Azitromicina 25mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Beclometasona 10 % v/v 3/3 3/3 N/C N/C Beclometasona 25 mg/ml N/C N/C 3/3 3/3 Sangre 2 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Ciprofloxacina 25 mg/ml 3/3 3/3 N/C N/C Ciprofloxacina 250 µg/ml N/C N/C 3/3 3/3 Eritromicina 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3

12 Página 12 Interferente potencial Concentración del interferente potencial Resultados del protocolo de EXTRACCIÓN Resultados del protocolo DIRECTO Bp Bpp Bp Bpp Fluticasona 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Guaifenesina/dextrometorfano 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Mucina 60µg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Mupirocin 25mg/ml 3/3 6/8 1 3/3 3/3 Oximetazolina 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 fenol) 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Fenilefrina 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Rifampicina 25 mg/ml 3/3 7/8 2 N/C N/C Rifampicina 250 μg/ml N/C N/C 3/3 3/3 Cloruro de sodio 10 % v/v 3/3 7/8 2 3/3 3/3 1 Una de las tres réplicas iniciales y una de las cinco réplicas adicionales (usadas para confirmar posibles interferencias) no detectaron Bpp. 1 Una de las tres réplicas iniciales no detectó Bpp, sin embargo se detectó Bpp en una de las cinco réplicas adicionales (usadas para confirmar posibles interferencias). CONCORDANCIA CLÍNICA Se analizaron un total de 222 muestras, que incluían muestras positivas (adicionadas y endógenas) y negativas de Bordetella pertussis y muestras positivas (adicionadas y endógenas) y negativas de Bordetella parapertussis utilizando el kit Focus Diagnostics Bordetella (MOL0200) y el kit Simplexa Bordetella mediante el protocolo de EXTRACCIÓN (MOL2700). A continuación se resumen los resultados de la comparación de métodos. Concordancia clínica Resultados para Bp Declarado (MOL0200) n Detectad o Simplexa Bordetella (MOL2700) No detectad o Indeterminado % de coincidencia (observado/esperado) IC del 95 % Detectad o No detectad o ,5 %(65/66) IC 95 %:91,9-99,7 % 96,8 % (151/156) IC 95 %:92,7-98,6 % Declarado (MOL0200) n Detectad o Resultados para Bpp Simplexa Bordetella (MOL2700) No detectad o Indeterminado % de coincidencia (observado/esperado) IC del 95 % Detectado No detectado %(71/71) IC 95 %:94,9-100 % 98 %(148/151) IC 95 %:94,3-99,3 %

13 Página 13 COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS: protocolo de EXTRACCIÓN frente a protocolo DIRECTO Con el fin de demostrar la relación entre los resultados obtenidos con el protocolo de EXTRACCIÓN y el protocolo DIRECTO, se llevó a cabo un análisis comparativo de los valores de Ct obtenidos de una combinación de muestras positivas endógenas y adicionadas. Los valores de Ct de las muestras que fueron positivos mediante el protocolo de EXTRACCIÓN se compararon con los valores de Ct del protocolo DIRECTO para las mismas muestras. Para Bordetella pertussis la pendiente de la línea de regresión es de 0,98 con una intersección de 2,89. Para Bordetella parapertussis la pendiente de la línea de regresión es 1,04 con una intersección de 0,56. En cada caso, la pendiente de la línea de regresión indica una buena correlación entre los dos protocolos. Figura 1: Regresión de Passing y Bablok. Bordetella pertussis Figura 2: Regresión de Passing y Bablok. Bordetella parapertussis CONTAMINACIÓN POR TRANSFERENCIA DURANTE LA AMPLIFICACIÓN Se evaluó el arrastre durante la amplificación usando el Universal Disc y la Universal Disc Cover Tape con otros ensayos Simplexa y se comprobó que el fenómeno no depende del ensayo.

14 Página 14 REFERENCIAS 1. Mattoo & Cherry. Clin Microbiol Rev : Centers for Disease Control Data available at: 3. National Consensus Conference on Pertussis. Available at: 4. Kerr et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis : Linneman et al., Am J Dis Child : Mertsola, J. Eur J Clin Microbiol : Hoppe, J.E. Pediatr Infect Dis : Iwatta et al. Dev Biol Stand : Loeffelholz, M.J et al. J. Clin Microbiol : Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity Mortality Weekly Report (MMWR) 2007 Aug 24; 56: Register, J.B. and Sanden, G.N., Journal of Clinical Microbiology, Dec 2006, p El uso de sondas Scorpions para diagnósticos in vitro en seres humanos está protegido por una licencia de Focus Diagnostics, Inc. de DxS, Ltd. Los colorantes Black Hole QuencherTM, CAL Fluor y Quasar son marcas registradas de Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnología de los fluoróforos Black Hole Quencher, CAL Fluor y Quasar está autorizada según un acuerdo con BTI, y estos productos se venden exclusivamente con fines clínicos, diagnósticos o de investigación y desarrollo. REPRESENTANTE AUTORIZADO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Alemania INFORMACIÓN PARA PEDIDOS Teléfono: Fax: ASISTENCIA TÉCNICA (800) (EE. UU. solamente) (562) (562) (Internacional) PI.MOL2700.IVD.ES Rev. F Fecha de redacción: 18 de julio de 2012 Teléfono: (800) (EE.UU. solamente) Fax: (562) Visite nuestro sitio web en (562) (Internacional) Cypress, California EE. UU.