Facultad de Ciencias

Transcripción

1 Facultad de Ciencias Desarrollo de nuevos métodos de vacunación basados en la anafilotoxina C5a y la proteína extra A de la fibronectina y péptidos sintéticos inhibidores de las células T reguladoras Francesc Rudilla Salvador 2011

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3 Facultad de Ciencias Desarrollo de nuevos métodos de vacunación basados en la anafilotoxina C5a y la proteína extra A de la fibronectina y péptidos sintéticos inhibidores de las células T reguladoras Memoria presentada por D. Francesc Rudilla Salvador para aspirar al grado de Doctor por la Universidad de Navarra El presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección en el Departamento de Hepatología y Terapia Génica y autorizo su presentación ante el Tribunal que lo ha de juzgar. Pamplona, 17 de Junio de 2011 Dr. Juan José Lasarte Sagastibelza

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5 A mi mujer Sílvia y a mi hijo Biel. Caminant sempre junts

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7 AGRADECIMIENTOS

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9 Han sido muchas las personas que me han ayudado y apoyado antes y durante la realización de esta tesis. El espacio para darles las más sinceras gracias se hace corto. A todas ellas quiero darles las gracias y espero de todo corazón no dejarme a nadie. A la Clínica Universidad de Navarra por la formación especializada en Inmunología que he recibido. Por la formación académica que en ellas he adquirido, quiero expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a la Universidad de Navarra, a la Universitat de Girona y a la Universitat Autònoma de Barcelona. Al Dr. Jesús Prieto, por permitirme formar parte del equipo de la División de Terapia Génica y Hepatología y por el gran entusiasmo que muestra en los proyectos. Muchas gracias por su apoyo. A mi director de tesis, el Dr. Juan José Lasarte, creador de este proyecto. Gracias por confiar en mí y darme la oportunidad de trabajar con un equipo humano extraordinario. Gracias por tu dedicación e ilusión en el trabajo, tus brillantes ideas, tu optimismo y por tener siempre en cuenta mis opiniones. A los Dres. Francisco Borrás y Pablo Sarobe, por todas las buenas ideas que aportáis y porque siempre se puede contar con vuestra inestimable ayuda y objetividad científica, muchas gracias. Quiero expresar, también, mi gratitud y mi consideración más sincera a la Dra Noelia Casares y al Dr Javier Dotor porque cuando más lo he necesitado me han proporcionado una dosis de esperanza e ilusión. Muchas Gracias Noe, muchas gracias Dotor. Mi gratitud también para la Dra Laura Arribillaga y la Dra Maika Durántez, por su estímulo y ayuda desinteresada. Para Cristina Mansilla, Marta Martínez, Teresa Lozano y Lorea Villanueva por ser unas excelentes compañeras de trabajo. Muchas gracias por vuestro apoyo.

10 A todos los peptídicos, tengo la gran suerte de poder contar con vosotros siempre que lo he necesitado, por eso esta tesis también es en parte vuestra. Muchas gracias. Al resto de mis compañeros del departamento y, en especial, a aquellos con los que comparto planta gracias por hacer agradable el simple hecho de estar. Gracias al Dr José Ignacio Riezu, por tener siempre una sonrisa. Muchas gracias Edurne por tu ayuda en el trabajo realizado. Quiero agradecer al Dr Rubén Pío por proporcionarme ratones C5aR ko y al Dr Daniel Ajona por su entusiasmo y apoyo en el proyecto. A la Dra Claude Leclerc, y a Catherine por su colaboración con los ensayos con ratones TLR4 ko. Al equipo del animalario, por ser un apoyo imprescindible para la manipulación de los ratones. Han sido prácticamente cinco años de trabajo tres de los cuales han sido especialmente duros, por tener que combinar el trabajo como biólogo residente (guardias incluidas) con la tesis doctoral y vivir lejos de la familia. Quiero agradecer profundamente a mis padres Núria y Francisco por el apoyo que constituyen en mi vida y por animarme siempre a mirar hacia delante sin perder el presente. A mis hermanas Núria y Laia por el cariño que siempre me han transmitido y por hacerme saber que siempre tendré cerca a mis hermanas. A mis amigos y compañeros de viaje, gracias por ayudarme a crecer como persona. Mis últimas palabras de agradecimiento son para ti, Sílvia. Cada día recibo mucho de ti, me apoyas incondicionalmente en todo aquello que me propongo realizar y sin tu apoyo este proyecto no hubiese terminado. Muchas gracias por ayudarme en todo aquello que has podido y gracias por permitirme crecer a tu lado. A todas aquellas personas que, aunque no he nombrado, han sido muy importantes y necesarias. Muchas y muchísimas gracias.

11 ABREVIATURAS

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13 Aa: AMPc: APC: as: CFSE: CML: CpG: Cpm: DAF: DC: DIDS: DNA: DTc: DTh: EDA: FBS: FITC: FPLC: GMCSF: HPPTLP: Ig: IL: i.p.: IPTG: i.t.: i.v.: LB: LPS: aminoácido adenosín monofosfato cíclico célula presentadora de antígeno (del inglés antigen presenting cell) antisentido (aplicado a los cebadores) carboxifluorescein succinimidil ester cultivo mixto leucocitario regiones de DNA viral o bacteriano ricas en pares de citosina y guanina enlazados por fosfatos cuentas por minuto factor acelerador de la degradación célula dendrítica (del inglés dendritic cell) ácido 4,4'diisotiocianostilbeno2,2'disulfónico ácido desoxirribonucléico (del inglés deoxyribonucleic acid) determinante T citotóxico determinante T helper dominio extra A de la fibronectina (del inglés, extradomaina fibronectin) suero fetal bovino (del inglés foetal bovine serum) isotiocianato de fluoresceína cromatografía liquida de proteína (del inglés Fast protein liquid chromatography) factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (del inglés, granulocytemacrophage colony stimulatory factor) péptido señal de la preprotripsina humana (del inglés human preprotrypsin leader peptide) inmunoglobulina interleucina intraperitoneal isopropil βd1tiogalactopiranosido intratumoral intravenosa linfocitos B lipopolisacárido

14 LTc: LTh: MC: linfocito T citotóxico linfocito T helper medio completo MHC: complejo principal de histocompatibilidad (del inglés major histocompatibility complex) MyD88: NFкB: NK: NKT: PAMP: PBS: PCR: PE: poly(i:c): PRR: RNA: factor de diferenciación mieloide 88 (del inglés myeloid differentiation factor 88) factor de transcripción nuclear kappa de los linfocitos B (del inglés, nuclear factor kappalightchainenhancer of activated B cells) célula asesina natural (del inglés natural killer) linfocitos T asesinos naturales (del inglés natural killer T lymphocyte) patrones de moléculas asociados a patógenos (del inglés pathogenassociated molecular patterns) tampón fosfato salino (del inglés phosphate buffered saline) reacción en cadena de la polimerasa (del inglés polymerase chain reaction) ficoeritrina (del inglés phycoerythrin) ácido poliinosínico:policitidílico receptores de patrones de reconocimiento (del inglés pattern recognition receptors) ácido ribonucléico (del inglés ribonucleic acid) s: sentido (aplicado a los cebadores) TCR: TLR: TNF: Treg: receptor de células T (del inglés T cell receptor) receptores tipo peaje (del inglés tolllike receptors) factor de necrosis tumoral (del inglés tumor necrosis factor) células T reguladoras

15 ÍNDICE

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17 INTRODUCCIÓN Sistema inmunitario Inmunidad innata Receptores Tolllike (TLR) y vías de señalización Sistema del complemento. Generalidades Activación del complemento Vía clásica del complemento Vía de las lectinas Vía alternativa o sistema properdina Rutas alternativas de la activación del complemento Funciones efectoras del complemento Interacción del complemento con los receptores Toll like (TLR) Inmunidad adaptativa o adquirida Respuesta humoral Respuesta celular Linfocitos Th Linfocitos T citotóxicos Linfocitos T reguladores CD4CD Activación de una respuesta inmunitaria Presentación antigénica Células dendríticas Señalización del calcio en la activación linfocitaria Estrategias de vacunación DNA desnudo Proteínas recombinantes de fusión basadas en el dominio extra A de la fibronectina (EDA) El domino extra A de la fibronectina (EDA) Péptidos inhibidores de las células T reguladoras Anafilotoxinas. Generalidades Efecto biológico de C5a Receptores del fragmento C5a Receptor C5aR (CD88) Receptor C5L2 (GPR77) Adyuvantes... 48

18 OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS Células Ratones Antígenos Péptidos Síntesis de péptidos Péptidos comerciales Análisis de interacción biomolecular Plásmidos de expresión Construcción Transfección en células adherentes Western blot Proteínas recombinantes de fusión Construcción Purificación Purificación por afinidad Intercambio iónico Replegado y detoxificado Análisis de la pureza Geles SDSPAGE y tinción con Azul de Coomassie Ensayos de actividad Análisis de activación de monocitos Análisis de maduración de células dendríticas Diferenciación DC Análisis in vitro de la maduración de las células dendríticas Expresión de marcadores de maduración Producción de citocinas Presentación antigénica Migración celular Estudio in vitro de los intercambiadores de iones cloruro, calcio y potasio en la activación linfocitaria Análisis de la expresión de mrna por PCR quantitativa Purificación de células T reguladoras Ensayos de proliferación celular... 76

19 4.4. Cinéticas de calcio intracelular Estudio de la apoptosis linfocitaria in vitro Técnica de Tunel Estudio de la respuesta inmunitaria en ratones Inmunización Plásmido Proteína Estudio in vitro e in vivo de las respuestas inmunitarias inducidas Aislamiento de esplenocitos ELISPOT In vivo killing Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR Depleción in vivo de células NK Estudios in vivo de protección tumoral Modelo tumoral Estudios de protección de tumores Estudios de tratamiento de tumores Estadística RESULTADOS Implicación de los intercambiadores de Cl y canales de Ca 2 en la activación celular de los linfocitos T efectores y T reguladores (CD4CD25FOXP3) Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la acción de las células T reguladoras (CD4CD25FOXP3) Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la expresión de mrnas en los linfocitos T Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre el flujo de entrada de calcio en los linfocitos Desarrollo de péptidos inhibidores del intercambiador cloruro/bicarbonato AE Síntesis de los péptidos y ensayos funcionales de selección de los péptidos inhibidores Ensayos de unión del péptido AE217 al bucle 3 del intercambiador AE Efecto del péptido p17ae2 en la proliferación celular Efecto del péptido p17ae2 en la apoptosis celular Estudio del potencial inmunomodulador de las anafilotoxinas para el desarrollo de vacunas Cribado con plásmidos de expresión Utilización del fragmento C5a como adyuvante de vacunación Purificación de las proteínas recombinantes de fusión Purificación de EDASIINFEKL

20 Purificación de C5aEDASIINFEKL Purificación de EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a Inducción de la producción de TNFα por la línea THP Maduración de células dendríticas Estudio de la expresión de marcadores de superficie en las células dendríticas Inducción de citocinas y quimiocinas por las células dendríticas Análisis in vitro de la quimiotaxis inducida por C5a Presentación antigénica de EDASIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a Inducción de la respuesta inmunitaria frente a SIINFEKL Efecto de las proteínas recombinantes sobre la población de las células T reguladoras en la inducción de la respuesta inmunitaria Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización TLR Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR Inducción de la respuesta inmunitaria NK Inducción de protección antitumoral y tratamiento de tumores establecidos DISCUSIÓN Estudio del desarrollo de inhibidores de la acción de las células T reguladoras Estudio del efecto adyuvante de las proteínas del complemento CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS

21 INTRODUCCIÓN

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23 Introducción 1. Sistema inmunitario El sistema inmunitario está compuesto de muchos tipos celulares interdependientes que en conjunto protegen al organismo contra bacterias, parásitos, hongos, infecciones virales y frente al crecimiento tumoral. Muchos de estos tipos celulares tienen funciones especializadas, pueden engullir bacterias y parásitos o eliminar células tumorales o células propias del organismo infectadas por virus. Por lo tanto, es un sistema que discrimina entre lo propio y lo ajeno, permitiendo actuar de forma específica. Cuando esta tolerancia inmunológica se altera, es decir, cuando falla la no respuesta a lo propio y a lo no dañino, se generan respuestas frente a estructuras propias dando lugar a procesos autoinmunes o bien procesos de hipersensibilidad donde el sistema inmunitario responde de forma exagerada a estructuras foráneas no patógenas, produciendo daño al organismo. La respuesta inmunitaria está formada por dos tipos principales de respuesta en función de la naturaleza de las estructuras de reconocimiento del patógeno. Estas estructuras pueden ser genéricas (respuesta innata) o bien específicas, utilizando receptores generados al azar que tienen un repertorio de reconocimiento prácticamente ilimitado (respuesta adaptativa). La interacción entre ambas formas de respuesta es esencial para una respuesta inmunológica eficaz. Los mecanismos innatos son fundamentales para la iniciación de las respuestas adaptativas y además permiten controlar el tipo de respuesta inducida, por otra parte la respuesta innata también es reclutada en la fase efectora de la respuesta adaptativa. Es importante destacar que las interacciones entre ambas respuestas son muchas, complejas y bidireccionales, formando parte de una única respuesta global de defensa Inmunidad innata La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa contra las infecciones. Comprende toda una serie de mecanismos de defensa constitutivos y listos para movilizarse cuando se produzca una infección, preparados para responder con gran rapidez. Se caracteriza por ser una respuesta no antígeno 3

24 Introducción específica que reacciona inicialmente del mismo modo frente a una amplia variedad de infecciones. Es una respuesta que no genera memoria inmunológica, es decir, que en encuentros posteriores con el mismo patógeno no se produce una respuesta mejorada y por lo tanto no es una respuesta inmunitaria duradera. Los mecanismos defensivos de la respuesta innata están formados por barreras físicas como la piel, las mucosas, el ácido estomacal, el reflejo de la tos entre otros y barreras químicas como la fiebre, la inflamación y el sistema del complemento. El sistema del complemento constituye el mayor componente humoral de la respuesta innata y actúa como mediador de varios mecanismos de la respuesta adaptativa, entre ellos la citotoxicidad mediada por anticuerpos. Además, la respuesta innata tiene un componente celular importante cuyo mecanismo defensivo es la fagocitosis y la citotoxicidad celular. Las poblaciones celulares responsables del desarrollo de una respuesta inmunitaria innata son las células fagocíticas (macrófagos, neutrófilos, células dendríticas), mastocitos, basófilos, eosinófilos y las células citotóxicas naturales o células NK (del inglés natural killer). Las células de la respuesta innata también son importantes mediadores en la activación del sistema inmune adaptativo. Un ejemplo es la secreción de interferón gamma (IFNγ) por parte de las células NK (Mandelboim et al. 1998; Arase et al. 1996; Young and Hardy 1995); otro ejemplo lo encontramos en las células dendríticas que presentan antígenos a las células T, uno de los tipos celulares clave del sistema inmunitario adaptativo (Guermonprez et al. 2002). Los determinantes reconocidos por los componentes de la respuesta innata (no específica) difieren de los reconocidos por la respuesta adaptativa (específica). Mientras que los componentes de la respuesta adaptativa reconocen y reaccionan frente a un patógeno en particular, los componentes del sistema inmunitario innato reconocen amplios patrones moleculares que se encuentran en grupos de patógenos relacionados, careciendo de un alto grado de especificidad. Los patrones moleculares comunes reconocidos por el sistema inmunitario innato han sido llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, del inglés pathogen 4

25 Introducción associated molecular patterns ), y sus receptores se llaman receptores de patrones de reconocimiento (PRR, del inglés pattern recognition receptors) (Medzhitov 2001; Janeway and Medzhitov 2002) Receptores Tolllike (TLR) y vías de señalización Los PRR se pueden dividir en tres clases dependiendo de su ubicación: secretables, de membrana o citosólicos. Los PRR transmembrana incluyen varios tipos de receptores, entre ellos destacamos la familia de los receptores TLR (del inglés Tolllike receptors). Los TLR son glicoproteínas transmembrana tipo I formadas por un dominio extracelular N terminal rico en leucinas, contiene entre 1530 LRR (del inglés leucinerich repeats) que media el reconocimiento de los PAMPs, un dominio transmembrana y el dominio intracelular C terminal, conocido como TIR (del inglés Toll/Interleukin1 receptor) que está implicado en la transducción de la señalización. El número de TLRs puede diferir en función de la especie, se han identificado entre 10 y 12 TLRs funcionales en humanos y ratones respectivamente. Los TLRs 19 están conservados en ambas especies. Los PAMPs reconocidos por los TLR son lípidos, lipoproteínas, proteínas y ácidos nucleicos derivados de una amplia gama de microbios, como bacterias, virus, parásitos y hongos. Se localizan principalmente en células presentadoras de antígeno profesionales (células mononucleares, dendríticas y macrófagos) y en diferentes células epiteliales (Takeda et al. 2003; Akira and Takeda 2004). Los TLRs se clasifican en dos tipos en función de su localización y sus respectivos ligandos PAMPs. Por un lado, los TLR 1, 2, 4, 5 y 6 reconocen principalmente productos bacterianos (lipoproteínas, lípidos y proteínas), por lo que se expresan en la membrana. Y por otro lado, los TLR 3, 7, 8 y 9 que se localizan en los endosomas, retículo endoplasmático, lisosomas y endolisosomas donde reconocen ácidos nucleicos virales (Tabla 1). Está descrita la existencia de una comunicación cruzada entre los TLRs y las moléculas adaptadoras, lo que aumenta la especificidad y amplía el patrón de PAMPs reconocidos por un mismo receptor (Latz et al. 2003; Martin et al. 5

26 Introducción 2005). Se ha observado que algunos de estos TLR forman heterodímeros (como los formados por TLR1TLR2) y homodímeros (TLR3TLR3) (Kumar et al. 2009). Tabla 1. Resumen de los diferentes TLR junto con sus principales características. Adaptado de Kumar, Kawai et al (Kumar et al. 2009) TLR Localización Principales PAMPs Vía de señalización Factor de transcripción Citocinas inducidas TLR1/2 Superficie celular Triacillipopéptidos TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF, IL6) TLR2 Superficie celular Peptidoglicano, Hemaglutinina TLR3 Endosomas virus RNAss, virus DNAds TLR4 Superficie celular LPS TIRAP/MyD88, TRAM/TRIF TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF, IL6) TRIF NFкB, IRF3,7 Cit. inflamatorias (TNF, IL6), IFN NFкB, IRF3,7 Cit. inflamatorias (TNF, IL6), IFN TLR5 Superficie celular Flagelina MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF, IL6) TLR6/2 Superficie celular Diacillipopéptidos TIRAP/MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF, IL6) TLR7 Endosomas virus RNAss MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF, IL6), IFN TLR8 Endosomas virus RNAss MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF, IL6), IFN TLR9 Endosomas virus DNAds, motivos CpG MyD88 NFкB, IRF7 Cit. inflamatorias (TNF, IL6), IFN TLR11 Superficie celular Profilin like protein MyD88 NFкB Cit. inflamatorias (TNF, IL6) Cada receptor TLR produce efectos biológicos específicos tras el reconocimiento de sus ligandos, debido al reclutamiento de moléculas adaptadoras con dominios de unión TIR, como MyD88, TIRAP, TRIF y TRAM. Las vías de señalización de los TLR se pueden clasificar en dos vías distintas. La vía dependiente de MyD88 que conlleva la activación de NFκB con la posterior inducción de citocinas proinflamatorias (TNF o IL6) o la vía dependiente de TRIF responsable de la inducción de interferón tipo I. La unión de TLR1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 y 11 con sus respectivos ligandos recluta MyD88. Además, TLR1, 2 y 6 lo hacen a través del adaptador TIRAP, que sirve de unión entre los dominios TIR de los TLR y la molécula MyD88. TLR3 por su parte recluta TRIF. El receptor TLR4 recluta a las cuatro moléculas adaptadoras siendo capaz de señalizar a través de ambas vías, ya sea mediante la unión a TIRAP que lleva al reclutamiento de MyD88, o a TRAM para activar la vía de 6

27 Introducción señalización de TRIF. Para la inducción de citocinas proinflamatorias a través de TLR4 es necesaria la activación de ambas vías de señalización (Figuras 1 y 2 ) (Kawai and Akira 2010). Figura 1. Esquema de las vías de señalización de los TLR de membrana (Kawai and Akira 2010). Figura 2. Esquema de las vías de señalización de los TLR intracelulares (Kawai and Akira 2010). 7

28 Introducción Hay una creciente evidencia de que los receptores TLR juegan un papel clave en la mediación de las respuestas sistémicas, a la invasión de patógenos durante la sepsis, así como también en otras enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En consecuencia, se ha sugerido que el bloqueo de la función de los TLR puede, en el futuro, traer nuevas posibilidades terapéuticas con el objetivo de suprimir estados de inflamación. Algunos de los inhibidores estudiados son variantes de las moléculas adaptadoras, ubiquitin ligasas, deubiquitinasas, micro RNAs y reguladores transcripcionales (O'Neill and Bowie 2007; Kawai and Akira 2010). Por otra parte, la señalización de los TLR podría utilizarse para potenciar el efecto terapéutico de las vacunas, puesto que la activación de la señalización TLR provoca una activación rápida de la inmunidad innata mediante la maduración de las células dendríticas (DC), producción de citocinas proinflamatorias y citocinas antivirales, así como la expresión de moléculas co estimuladoras y receptores de quimiocinas (Aderem and Ulevitch 2000; Kaisho and Akira 2002; Werling and Jungi 2003). Además, está descrita la importancia de la señalización TLR en células T efectoras y en células T reguladoras, asociándose dichas vías a la diferenciación de las células T memoria (Pasare and Medzhitov 2004; Salem et al. 2005), polarización de la respuesta Th1 (Schnare et al. 2001), pérdida temporal de la función supresora de las células T reguladoras (reduciendo la expresión de Foxp3) (Hackl et al. 2011; Liu et al. 2006; Sutmuller et al. 2006), la generación de células Th17 o el bloqueo de la conversión de las células T reguladoras promoviendo la respuesta autoinmune (Chen et al. 2007; AbdollahiRoodsaz et al. 2008). En definitiva, los TLR permiten modular la respuesta celular T a través de la respuesta innata y directamente por su acción en la respuesta adaptativa, permitiendo la inducción de una inmunidad adaptativa eficaz. En este sentido se pueden considerar receptores adyuvantes. 8

29 Introducción Sistema del complemento. Generalidades El complemento es un conjunto de proteínas termolábiles, la gran mayoría plasmáticas y algunas de membrana, cuya función principal es potenciar la inflamación, la fagocitosis y la lisis de los microorganismos. El hepatocito es el principal productor de factores del complemento, también los macrófagos activados en el foco inflamatorio, lo que es de gran importancia porque así se garantiza la presencia de estos factores del complemento en el foco inflamatorio. Las citocinas inflamatorias (IL1, IL6 y TNFα) y el IFNγ, incrementan la síntesis de algunos factores del complemento en el hígado. La gran mayoría de los factores del complemento son enzimas proteolíticas. Cuando una de estas enzimas actúa sobre su sustrato, este se escinde en dos fragmentos. Estos fragmentos se nombran igual que al sustrato pero añadiéndoles una letra minúscula. Por ejemplo, C3 se escinde en dos fragmentos, al mayor se le llama C3b y al menor C3a. Los dos fragmentos resultantes tienen actividad biológica, si bien dichas acciones son distintas para cada uno de ellos. Son un ejemplo, algunos pequeños péptidos con actividad de anafilotoxinas, liberados durante la activación del complemento. El más potente es el C5a, seguido por el C3a. Por lo tanto, durante la activación del complemento tienen lugar una serie de reacciones en cascada, en cada reacción se genera un producto activo, que además de determinar que la cadena prosiga hasta la reacción siguiente, puede tener funciones biológicas en la defensa frente a microorganismos. El complemento es activado por tres vías distintas, la clásica, la de las lectinas (MBL) y la alternativa (o properdina) (Vergani 1986) (Figura 3). Las tres tienen en común la activación del componente C3 y por lo tanto confluyen en una vía común de ataque a membrana, pero difieren en la naturaleza del reconocimiento. La vía clásica es activada por anticuerpos liberados tras una respuesta humoral. La vía de las lectinas es activada tras el reconocimiento e interacción de patrones asociados a patógenos (PAMP s) por proteínas lectinas. Y por último, la vía alternativa se diferencia del resto debido a una activación 9

30 Introducción espontánea de C3 con una tasa muy moderada (cuya activación y amplificación ocurren solamente en presencia de ciertos agentes, principalmente bacterias) y a su promiscuidad en interaccionar con un amplio rango de aceptores. Figura 3. Vías de activación del complemento (Kemper and Atkinson 2007) Activación del complemento Vía clásica del complemento Esta vía se activa tras la unión del componente C1q del factor C1, a la fracción constante de las inmunoglobulinas IgG (clases IgG1, IgG2, IgG3) o IgM (Holme and Whaley 1989). Estos anticuerpos deben formar el complejo antígeno anticuerpo para que se produzca tal activación, en el caso de la IgG que es una inmunoglobulina monomérica se necesitan al menos dos complejos antígeno anticuerpo, mientras que en el caso de la IgM al ser pentamérica sólo es necesario un complejo AgAc. Las inmunoglobulinas solubles no activarán al factor C1. También el C1q reconoce factores endógenos como células muertas, proteínas de la matriz extracelular, pentraxinas, priones, depósitos amiloides y DNA. El factor C1 forma un complejo C1qr 2 s 2 estabilizado por Ca 2. Tras la unión del factor C1 con la región constante de la cadena µ de IgM o de la 10

31 Introducción cadena γ de IgG, tendrá lugar una activación en secuencia de la actividad proteolítica de los componentes C1r y C1s. C1r activa a C1s. Por acción de C1s, con actividad serín proteasa, se escinde el fragmento C4, liberándose un pequeño fragmento C4a y un C4b. C4a tiene una actividad anafilotoxina leve, y C4b tiene actividad opsonina. En presencia de Mg 2, C2 forma un complejo con C4b y se transforma en un nuevo sustrato para C1s, formándose el complejo C4b2a con actividad C3 convertasa para escindir C3. La escisión de C3 implica que se agrega C3b al complejo C4b2a formando la C5 convertasa (C4b2a3b). La degradación de C4b2a es inducida por una proteína de unión a C4 (C4bp) o a un receptor de C3b (C1R) en presencia del factor I. C5 se escinde en C5a y C5b por la acción de la C5a convertasa. C5a es la anafilotoxina más potente. En este momento empieza la segunda fase de activación del complemento que consiste en el ensamblaje de los componentes terminales. C6 se une a C5b y luego a C7, se insertan en la membrana plasmática y posteriormente se une C8, causando una penetración en la membrana plasmática y la inducción de la polimerización de C9 en membrana. El resultado final es la formación del complejo de ataque a membrana (CAM) o componente terminal del complemento (CTC), con la generación de un poro de 100 Å en la membrana plasmática que causa la osmólisis celular (Morgan 1989; Bhakdi et al. 1990) Vía de las lectinas Es una vía análoga a la clásica que se activa por proteínas homólogas a C1q: ficolinas y lectina de unión a manosa (MBL). Su activación es independiente de anticuerpos. Estas proteínas reconocen específicamente carbohidratos en la superficie de patógenos o células apoptóticas, como la manosa y la Nacetilglucosamina (GlcNac). Tras su unión con los carbohidratos, la proteína de unión a manosa activa al complejo C1qrs. Otras proteínas, las serín proteasas asociadas a MBL (MASP1 y MASP2) funcionan de manera análoga a C1r y C1s, hidrolizando los componentes C4 y C2 para formar la C3 convertasa (C4bC2a), que es común para ambas vías, la clásica y la 11

32 Introducción de la lectina. Los fragmentos C3b generados presentan actividad opsónica, estimulando la opsonización para el aclaramiento de microorganismos y residuos celulares resultantes de la apoptosis Vía alternativa o sistema properdina La vía alternativa se inicia por la interacción del componente C3 con polisacáridos, su activación es independiente de anticuerpos, presenta un mecanismo de acción distinto a la vía clásica y a la lectina. Constituye una primera línea de defensa en la respuesta innata. Es la vía más primitiva. Constituye un estado de activación permanente del componente C3, se inicia tras la hidrólisis espontánea de C3 y en presencia de niveles bajos de C3. En ausencia de microorganismos, la cantidad de C3b producida es inactivada por el Factor H. En presencia de microorganismos, C3 se une a la superficie invasora evadiendo la acción del Factor H, se forma un complejo con el Factor B, el cual se fragmenta por acción del factor D en presencia de Mg 2. El complejo C3bBb es altamente inestable y la vía alternativa no continúa sin la presencia de una proteína circulante llamada properdina, que permite estabilizar el complejo C3bBb. Se forma la C3 convertasa de la vía alternativa (compuesta por C3bBb), que actuará enzimáticamente sobre moléculas de C3, amplificando la cascada. Parte de este C3b se puede unir a la C3 convertasa y formar la C5 convertasa de la vía alternativa (C3bBb3b) que activará a C6, convergiendo en los mismos pasos no enzimáticos y de ensamblaje finales de la vía clásica Rutas alternativas de la activación del complemento Además de los tres principales mecanismos de activación del complemento, hay varias rutas accesorias que permiten activar el sistema del complemento en respuesta a varios estados. La vía de la lectina ligadora de manosa (MBL) puede ser activada directamente por la unión de lectina de unión a manosa (MBL) a inmunoglobulina IgM que interacciona con antígenos isquémicos de células 12

33 Introducción endoteliales en situación de daño por isquemiareperfusión (McMullen et al. 2006). En ausencia de C2 y C4 pero en presencia de componentes de la vía alternativa es posible que complejos antígeno anticuerpo o oligonucleótidos activen a C1 o lectina de unión a manosa (MBL) respectivamente (Selander et al. 2006). Está descrito que las anafilotoxinas se pueden generar por la acción de ciertas proteasas extrínsecas, el componente C3 puede ser degradado y activado por proteasas como la trombina o la calicreína (Markiewski et al. 2007; Amara et al. 2008), además el componente C5 puede degradarse por la trombina sin la necesidad de la acción de C3 (HuberLang et al. 2006). Por lo tanto existe un nexo entre el sistema del complemento y la cascada de coagulación. Asimismo, las anafilotoxinas C3a y C5a se pueden generar directamente de los componentes C3 y C5 respectivamente por proteasas que se presentan en procesos alérgicos, en mecanismos que involucran la generación de radicales libres y en la activación de la calicreína debido a la presencia de fibras de amianto y de sílice (Maruo et al. 1997; Governa et al. 2000; Governa et al. 2005) Funciones efectoras del complemento El sistema de complemento funciona como una herramienta de vigilancia inmunológica. En un ambiente sano, hay una actividad constitutiva y ligera del complemento, asegurándose un sondeo que es llevado a cabo por la presencia de proteínas solubles que reconocen estructuras propias y proteínas de membrana reguladoras del complemento, de modo que se previene la amplificación de la señal de activación del complemento. Un ejemplo de estas proteínas de membrana es el factor DAF (factor acelerador de la degradación) que está ampliamente distribuído y cuya función es inhibir la unión y facilitar la disociación de C4b y C2a. De este modo, estos factores reguladores pueden prevenir la lisis de las células autólogas vivas. En presencia de células apoptóticas o de microorganismos bacterianos se produce un descenso de estos factores reguladores, al mismo tiempo que las proteínas que reconocen los 13

34 Introducción patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) amplifican la activación del complemento. Tiene lugar la opsonización de la célula apoptótica o del microorganismo por fragmentos del complemento y la posterior fagocitosis o la formación del complejo de ataque a membrana que conlleva la lisis celular, la señalización proinflamatoria mediada por la liberación de los fragmentos del complemento con actividad biológica llamados anafilotoxinas, y además, se induce una estimulación downstream de la respuesta inmune. Por lo tanto tiene lugar una acción de reconocimiento, activación y regulación del sistema del complemento, condicionada a la presencia de células sanas, apoptóticas o microorganismos bacterianos. Las proteínas reguladoras del complemento pueden ser solubles o de membrana y ayudan al control del sistema de ataque del complemento ajustando su severidad, propagación y destino en la célula diana. Ejercen su acción en distintos puntos, tanto en la vía clásica como en la alternativa o de las lectinas, centrándose fundamentalmente en la activación de C3. El sistema del complemento tiene una diversidad de funciones biológicas defensivas. Estas funciones se llevan a cabo por diferentes fracciones activas del complemento que interaccionan con sus respectivos receptores de membrana. Las acciones anafilotóxicas, quimiotáxicas y opsonizantes del complemento lo convierten en un factor fundamental en la potenciación de la inflamación, fenómeno básico en la defensa frente a la infección y a los procesos tumorales. Las principales acciones del complemento son las siguientes: Acción lítica: la lisis se produce como consecuencia de la formación del CAM (complejo de ataque a la membrana), este complejo puede lisar bacterias gramnegativas, parásitos, virus encapsulados, eritrocitos y células nucleadas. Las bacterias gram positivas son bastante resistentes a la acción lítica del complemento. Se conoce como citotoxicidad dependiente de complemento. Respuesta inflamatoria. Acción anafilotóxica: como consecuencia de la fragmentación de distintos componentes del complemento se generan unos fragmentos activos llamados anafilotoxinas, estos son el C3a, C4a y C5a. Estas 14

35 Introducción anafilotoxinas se unen a sus respectivos receptores induciendo la liberación de mediadores de la inflamación. Estas sustancias aumentan la vasodilatación y la permeabilidad de los vasos sanguíneos. Así mismo, inducen la extravasación de los leucocitos al endotelio. C3a y C5a son potentes quimiotácticos para neutrófilos, monocitos y macrófagos hacia el lugar de activación del complemento. Causan una fuerte señalización inflamatoria a través de sus receptores acoplados a proteínas G (Ames et al. 1996; Monk et al. 2007). C5a también coregula la fagocitosis mediada por inmunocomplejos, modulando la expresión de los receptores de activación FcγRI/II y de inhibición FcγRIIB (Shushakova et al. 2002; Kumar et al. 2006). La única regulación endógena de C3a y C5a, es la pérdida de un residuo de arginina terminal mediada por la actividad carboxipeptidasa, dando lugar a C5a desarg y C3a desarg (Bokisch and MullerEberhard 1970). Estos productos son activos pero con un diferente espectro de acción (Jalili et al. ; Ratajczak et al. 2006; MacLaren et al. 2008). Opsonización: C3b es la principal opsonina del complemento. Los antígenos recubiertos con C3b se unen a receptores específicos en células fagocíticas facilitando la fagocitosis. La neutralización de virus: C3b induce la agregación de partículas virales formando una capa gruesa que bloquea la fijación de los virus a la célula. Este agregado puede ser fagocitado mediante la interacción de receptores del complemento y C3b en las células fagocíticas. Eliminación de inmunocomplejos: Los inmunocomplejos (complejos antígenoanticuerpo circulantes) pueden ser eliminados de la circulación si el complejo se une a C3b. Los eritrocitos tienen receptores del complemento que interactúan con los complejos inmunes cubiertos por C3b y los lleva al hígado y al bazo para su destrucción. A continuación, mostramos una tabla resumen (Tabla 2) que muestra las principales funciones efectoras del complemento, en función de la interacción entre el fragmento del complemento y su receptor. 15

36 Introducción Tabla 2. Resumen de los diferentes receptores de los fragmentos del complemento junto con sus funciones y tipos celulares donde se expresan Interacción del complemento con los receptores Toll like (TLR) Tras una infección se activan rápidamente dos mecanismos de la respuesta innata, el sistema del complemento y la señalización a través de los receptores TLR. Ambos proporcionan una primera línea de defensa y constituyen un puente de unión entre la respuesta innata y la respuesta 16

37 Introducción humoral y celular (Dunkelberger and Song 2010; Bhakdi et al. 1990). Coordinan la respuesta innata en cooperación bidireccional, potenciando la respuesta innata con acciones sinérgicas o bien regulando un exceso de respuesta mediante acciones antagónicas (Hajishengallis and Lambris 2010). La producción de algunas citocinas proinflamatorias, inducidas in vivo por la señalización de los receptores TLR (principalmente TLR4, TLR2, TLR6 y TLR9), están reguladas por el complemento a través de los receptores C5aR y C3aR. Las vías de señalización de estos receptores TLR convergen con la señalización de las anafilotoxinas C3a y C5a a nivel de MAP quinasas, especialmente ERK1/2 y JNK (Zhang et al. 2007). La interacción de ambos sistemas, se observa cuando al inhibir la vía de señalización de C5a, se confiere protección frente a la sepsis que es inducida por altas dosis de LPS (Guo et al. 2004). Recíprocamente, la activación de los receptores TLR induce la expresión de componentes del complemento y de sus receptores (Kaczorowski et al. 2010). Como demostraron Zhang et al, los ratones knockout para el factor acelerador de la degradación DAF, cuando son tratados con LPS, zymosan o CpG, presentan aumentados los niveles en suero de citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNFα), las interleucinas 1β (IL1β) y 6 (IL6) pero también tienen disminuidos los niveles de la interleucina 12 (IL12) en comparación con ratones wildtype. Este fenotipo es mediado por las anafilotoxinas C5a (en el caso del receptor TLR4) y C3a (en el caso del receptor TLR9). También demostraron que tras la activación con LPS, estos ratones knockout para DAF presentan mayor inducción del factor de transcripción NFкB y se incrementa la fosforilación de MAP quinasas como ERK y JNK. La inmunización de estos ratones con distintos antígenos y en combinación con el adyuvante completo de Freund (CFA) presenta una mayor respuesta T efectora y de memoria. Además, estos ratones muestran susceptibilidad a procesos autoinmunes y de inflamación (Zhang et al. 2007). Este es un ejemplo en el que el complemento y los receptores TLR, promueven la inflamación y modulan la inmunidad adaptativa. 17

38 Introducción Sin embargo otros estudios afirman que el fragmento C5a inhibe la señalización del TLR4. Según el estudio de Hawlisch et al, el fragmento C5a regula negativamente la señalización mediada por TLR4 y por la molécula CD40, inhibiendo la síntesis de citocinas inducidas por la familia de la citocina IL12 (IL12, IL23 e IL27) en macrófagos activados. Esta disminución se traduce en una respuesta Th1 disminuida in vitro e in vivo, observándose una mayor respuesta Th1 en ratones deficientes del receptor C5aR, confiriéndose una protección contra la infección por Leishmania major (Hawlisch et al. 2005). Sin embargo, C5a no inhibe la producción de IL12 mediada por TLR y por la interacción entre la molécula CD40 y CD154 en células dendríticas humanas y murinas. De hecho, en las células dendríticas, la activación de los receptores C5aR y C3aR promueve la producción de las citocinas IL12 y IL23. Además, los ratones deficientes en ambos receptores presentan un déficit en la estimulación de la respuesta T in vivo e in vitro. La activación de los receptores C5aR y C3aR da lugar a la activación de las proteínas ERK1/2 y así, mientras en macrófagos se induce la inhibición de la producción de IL12, en las células dendríticas se produce el efecto opuesto. Una explicación del efecto producido por el factor C5a al receptor TLR4 en la producción de IL12 en las células dendríticas, es la capacidad de C5aR para inhibir la señalización de la proteína quinasa A (PKA) dependiente de AMPc, incrementando los niveles de TNFα y disminuyendo la producción de IL10 (Peng et al. 2009). El complemento también puede modular la acción de los ligandos para TLR9, como por ejemplo los oligodeoxinucleótidos CpG. Los CpG inducen la maduración de las células presentadoras de antígeno (APC) a través de su receptor TLR9. La inhibición del componente C3 del sistema del complemento inhibe la acción de los CpG en las células dendríticas, influyendo negativamente en la señalización TLR9. Es un ejemplo de una inmunomodulación de la función CpG dependiente del complemento y del receptor TLR9 (Mangsbo et al. 2009). El bloqueo de la molécula CD14, coreceptor de TLR4 y TLR2, inhibe algunas actividades del complemento, esto indica la existencia de un cierto 18

39 Introducción grado de cooperación entre el complemento y la molécula CD14 (Lappegard et al. 2009). Esta cooperación se podría atribuir a las interacciones extracelulares entre la molécula CD14 y los receptores del complemento o bien a fragmentos activos del complemento que podrían activar directamente la señalización de los receptores TLR. Hay evidencias de que la señalización de los TLR también puede afectar a la expresión de los receptores del complemento y por lo tanto a su actividad. Está descrito que la inducción de IL6 a través del TLR4 induce un aumento de la expresión de los receptores C5aR y C3aR (Koleva et al. 2002). En la Tabla 3 se resumen las interacciones descritas entre el complemento y los receptores TLR. Tabla 3. Interacción entre el complemento y la señalización TLR. Adaptada de Hajishengallis y Lambris (Hajishengallis and Lambris 2010). Receptores Función Puntos de interacción Sistema experimental C3aR C5aR TLR2 TLR4 TLR9 Inducción de TNFα, IL1β e IL6. Descenso de la respuesta Th1, aumento de la respuesta Th17. MAPK PI3K (ERK1/2,JNK), Macrófagos murinos, monocitos humanos. C3aR C5aR CD14/ TLR4 Aumento del estrés oxidativo, de la respuesta proinflamatoria y de la fagocitosis. No descrito. Sangre periférica humana. C3aR C5aR CR3 TLR9 Aumento de la expresión de marcadores de activación y maduración en APC. No descrito. Sangre periférica humana. C5aR TLR2 Inducción de AMPc. Adenilato ciclasa. Macrófagos murinos C3aR C5aR TLR4 Incremento de IL12 e IL23. ERK1/2 Dendríticas humanas y murinas, modelo in vivo. CR3 TLR2 TLR4 Inhibición IL12, reclutamiento de TIRAP y aumento de algunas citocinas proinflamatorias. ERK1/2 Macrófagos murinos y monocitos humanos. CR3 TLR2 Activación de la unión del ligando de CR3 a CR3. Rac1, PI3K y citoesina 1 Macrófagos murinos y monocitos humanos. C5L2 TLR4 Inducción de HMGB1. MAPK Macrófagos murinos y modelos de sepsis murina. 19

40 Introducción C5L2 TLR4 Inhibición de TNFα, aumento de IL6 y CR3. MAPK Neutrófilos murinos. C5L2 TLR4 Inhibición de TNFα, IL6 y CD86. ERK1/2 y Akt Macrófagos murinos. gc1qr TLR4 Inhibición IL12. PI3K Monocitos y células dendríticas humanas. cc1qr TLR4 Aumento de la expresión de moléculas de coestímulo, de las citocinas TNFα, IL12. Inducción de respuesta Th1. NFкB Células dendríticas humanas. CD46 TLR4 Descenso IL12. Mecanismo postranscripcional Monocitos y macrófagos humanos. CD46 TLR4 Aumento de respuesta Th17. Incremento de IL12p35, IL23p19, IL 12/ IL23p40. No descrito Células dendríticas humanas Inmunidad adaptativa o adquirida La inmunidad adaptativa constituye una respuesta inmunitaria que tiene lugar cuando la respuesta innata es evadida. Es una respuesta lenta pero muy eficaz y selectiva ya que requiere del contacto previo con el agente patógeno (sensibilización) y por lo tanto es antígeno específica. Es una respuesta que genera memoria inmunológica, es decir, hay un incremento en la intensidad de respuesta ante los subsiguientes contactos con el mismo antígeno y está mediada principalmente por linfocitos. Se caracteriza por presentar dos tipos de respuesta: la respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y la respuesta celular (mediada por linfocitos T citotóxicos y linfocitos T colaboradores) Respuesta humoral Es la respuesta basada en la acción de los anticuerpos secretados por activación antigénica con el objetivo de combatir patógenos extracelulares y sus toxinas. El linfocito B capta el antígeno a través de sus receptores y lo procesa para presentarlo vía MHC de clase II a los lifocitos T colaboradores (Th), estos linfocitos inducen la expansión clonal y diferenciación del linfocito B que producirá anticuerpos específicos frente al antígeno. Cuando los antígenos son 20

41 Introducción de naturaleza no proteica, no se requiere de la presencia de los linfocitos Th para la activación de las células B. Estos anticuerpos pueden tener efecto neutralizante del patógeno directamente o indirectamente a través de células fagocíticas, activación del complemento o por unión de las células NK a la fracción Fc de la inmunoglobulina Respuesta celular Los linfocitos T son los responsables de la respuesta inmunitaria celular permitiendo la destrucción de las células infectadas o células tumorales. Esta respuesta presenta una fase de activación (expansión de las células T citotóxicas), una fase efectora (encuentro y eliminación de la célula infectada o tumoral) y una fase de contracción (apoptosis y memoria). Los linfocitos T después de un proceso de selección tímica, donde forman un repertorio de linfocitos T con un receptor clonal (TCR) que les permite reconocer determinantes antigénicos presentados por moléculas MHC, migran a los órganos linfoides secundarios donde tendrá lugar la presentación antigénica mediante la interacción entre su receptor TCR (del inglés T Cell Receptor) y el complejo MHCantígeno (expresado en la superfície de las APC) (Germain et al. 1988; McMichael 1979; Townsend and Bodmer 1989). Dentro de esta población celular encontramos varias subpoblaciones, entre las que destacan los linfocitos T CD4 o colaboradores (Th), los linfocitos CD8 o citotóxicos (Tc), los linfocitos T CD4CD25 reguladores (Treg), los linfocitos Th17 y las NKT (del inglés natural killer T lymphocyte) Linfocitos Th Los linfocitos T colaboradores o helper (Th) fueron descritos por primera vez por Mossman y Coffman, observaron que las células T podían dividirse en dos subgrupos que llamaron las células Th1 y Th2 en función de su patrón de producción de citocinas, interferónγ, TNF e IL2 (células Th1) o interleucina 4 (IL4), IL5, IL6, IL10 e IL13 (células Th2) (Mosmann and Coffman 1989; Cherwinski et al. 1987). Pero la relevancia entre la distinción de ambos subtipos 21

42 Introducción fue descrita por Heinzel et al. (Heinzel et al. 1989), observaron que en ratones una respuesta predominantemente Th1 permitía superar la infección por Leishmania major mientras que una respuesta tipo Th2 no era capaz de combatir dicha infección. Estos linfocitos Th no presentan actividad citotóxica, pero controlan la respuesta inmunitaria dirigiendo a otras células para que realicen esas tareas, tienen efectos protectores y promotores de la función de las células B, T CD8 y macrófagos. Los linfocitos Th1 están asociados a respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T citotóxicos, macrófagos y neutrófilos. Los linfocitos Th2 están destinados a ayudar a las células B en la producción de anticuerpos y a activar a los eosinófilos. Además, los linfocitos Th pueden tener un papel antiviral directo a través de las citocinas que producen Linfocitos T citotóxicos Los linfocitos T CD8 (Tc) tienen su capacidad de actuación restringida por las moléculas MHCI por lo tanto se encargan de combatir las infecciones intracelulares destruyendo las células infectadas, de eliminar células tumorales o células dañadas por otras causas. El principal mecanismo efector utilizado es la inducción de la apoptosis segregando una serie de moléculas inductoras de la apoptosis (FasL, perforina, granzimas) (Harty et al. 2000; Pardoll 1993; Zinkernagel and Althage 1977). Son los principales causantes del rechazo de tejidos y órganos transplantados (Bothwell 1999; Onoe et al. 1997), estando también implicados en fenómenos de autoinmunidad (Billet et al. 2006). En virtud de un conjunto definido de receptores de homing como la molécula CD62L y receptores de quimiocinas, como el receptor CCR7, los linfocitos T CD8, del mismo modo que los linfocitos T CD4, circulan por el torrente circulatorio hasta llegar a los órganos linfoides secundarios, donde tiene lugar la presentación antigénica por las células dendríticas (DC) que actúan como células presentadoras de antígeno profesionales. Los linfocitos Tc tras este encuentro se expanden, proliferan y se diferencian a células efectoras. 22

43 Introducción La activación del linfocito Tc tiene unos controles muy estrictos y, por lo general, requiere una señal de activación muy fuerte por parte del complejo MHCI/DTc y de señales adicionales proporcionadas por las células T colaboradoras (Bourgeois et al. 2002; Freeman et al. 1993; Linsley and Ledbetter 1993). Sin embargo, no siempre la ayuda CD4 es indispensable, existiendo varios modelos de activación de linfocitos CD8 en donde las células CD4 no participan (Bachmann et al. 1998; Lasarte et al. 1995). Los linfocitos T CD8 ejercen su función antiviral mediante mecanismos no citolíticos con la producción de citocinas (IFN, TNF o IL2) y a través de mecanismos citolíticos que convergen en la inducción de apoptosis en la célula diana por activación de caspasas. Uno de los mecanismos consiste en la liberación de gránulos que contienen la molécula formadora de poros perforina y la serín esterasa granzima B. El otro mecanismo implica la expresión de Fas ligando (CD95L) y su interacción con la molécula Fas (CD95) expresada en la superficie de la célula diana. La gran mayoría de células efectoras tras cumplir con su cometido entrarán en apoptosis celular, el resto formarán un pool de células memoria. Estos linfocitos memoria tienen una vida larga pudiendo circular durante meses o años y están preparados para desencadenar una respuesta inmunitaria rápida y potente si se produce una nueva exposición con el mismo patógeno (Ahmed and Gray 1996). De hecho, éste es el principal objetivo de las vacunas, generar linfocitos memoria (T y B) de manera que el organismo responda de manera rápida y eficaz frente al patógeno activo (Ahmed and Gray 1996). Está descrito que se requiere la presencia de los linfocitos T CD4 para la generación de estos linfocitos T CD8 memoria en respuestas inmunitarias contra virus y bacterias (Shedlock and Shen 2003), así como en la erradicación de tumores (Marzo et al. 2000), aunque las células T CD8 memoria podrían generarse en su ausencia, siendo menos eficaces que las generadas con su ayuda (Janssen et al. 2003; Shedlock and Shen 2003). La población de los linfocitos T CD8 memoria se regula mediante mecanismos homeostáticos para 23

44 Introducción mantener a lo largo del tiempo una representación de la misma. Fundamentalmente dos citocinas son las responsables de la homeostasis de esta población celular: la IL7, que es esencial para su supervivencia, y la IL15, que se encarga principalmente de su proliferación para mantener una población mínima de reserva (Surh and Sprent 2008) Linfocitos T reguladores CD4CD25 A principios de los años 70 se describió por primera vez la presencia de unos linfocitos T capaces de suprimir las respuestas inmunitarias. En 1995, Sakaguchi y col. (Sakaguchi et al. 1995) encontraron que una población minoritaria de células CD4 (10%) que coexpresaban la cadena alfa del receptor para la interleuquina 2 (CD25) era crucial para el control de las células autorreactivas y la autoinmunidad in vivo. Desde entonces, muchos grupos han demostrado que esta subpoblación de células CD4CD25, también conocidas como células Treg o linfocitos Treg, son inmunosupresoras (Takahashi et al. 1998; Thornton and Shevach 1998). Estas células fueron identificadas primero en ratones pero después han sido ampliamente caracterizadas en humanos (Dieckmann et al. 2001; Jonuleit et al. 2001; Levings et al. 2001). Actualmente, la existencia de una subpoblación inmunosupresora específica es aceptada ampliamente por la comunidad científica y se busca la forma de manipular su actividad para su uso clínico. La principal cuestión es cómo podría modularse su actividad. Los linfocitos Treg son esenciales para la protección frente a las enfermedades autoinmunes y para la prevención del rechazo a los transplantes; por ello, la posibilidad de potenciar su actividad tiene un gran potencial en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes y en los transplantes de órganos. Sin embargo, debido a que los tumores expresan autoantígenos, los linfocitos Treg pueden ser capaces de inhibir la activación de respuestas inmunitarias frente al cáncer. Varios grupos, han demostrado que la simple eliminación de las células CD4CD25FOXP3 (Treg) por la administración in vivo de anticuerpos 24

45 Introducción deplecionantes facilita la inducción de inmunidad antitumoral y la protección frente al desarrollo del cáncer (Casares et al. 2003; Onizuka et al. 1999; Shimizu et al. 1999; Steitz et al. 2001; Sutmuller et al. 2001). Así, se cree que las células Treg están continuamente frenando la activación de los linfocitos T efectores para evitar procesos de autoinmunidad, pero dificultando a su vez la correcta activación de una respuesta antitumoral cuando ésta es necesaria Activación de una respuesta inmunitaria Presentación antigénica Para que tenga lugar una activación específica de la respuesta inmunitaria frente a un antígeno, es necesario que se de la presentación antigénica (Mellman 2005), un proceso de reconocimiento molecular entre el péptido expuesto por moléculas de MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) en las APC y el receptor TCR o BCR de linfocitos T y B respectivamente. Para ello, el antígeno debe ser previamente capturado por la APC y procesado hasta ser convertido en péptido. Además, se requieren señales de coestímulo (interacción de factores solubles y proteínas de membrana) para una activación eficaz del linfocito y por lo tanto de la respuesta inmunitaria (Koch et al. 1996; Vazeux et al. 1992; Zhang et al. 1999; Zuckerman et al. 1998). Esta interacción entre la APC y el linfocito se conoce como sinapsis inmunológica. Existen dos vías principales de presentación antigénica, la vía clase I y la vía clase II, en función del origen y la vía de entrada del antígeno (Jensen 2007; Villadangos and Schnorrer 2007) (Figura 4). La vía clase I consiste en la presentación de antígenos endógenos procedentes de proteínas propias, proteínas intracelulares derivadas de un patógeno que ha infectado la célula o proteínas inducidas durante el desarrollo de un tumor que son procesadas por el proteosoma. Tras la degradación de la proteína en el proteosoma, los fragmentos peptídicos generados (determinantes T citotóxicos) son transportados mediante un transportador dependiente de ATP llamado TAP (del inglés, transporter associated protein) desde el citoplasma 25

46 Introducción hasta el retículo endoplasmático, donde se unen a las moléculas MHC de clase I. El complejo MHCI/DTc pasa a través del Golgi antes de llegar a la superficie celular, donde será presentado a los linfocitos CD8 citotóxicos. Todas las células nucleadas pueden presentar determinantes antigénicos mediante esta ruta. En estos casos, la presentación de antígenos puede ocurrir en ausencia de otras señales inmunoestimuladoras (como moléculas de coestímulo situadas sobre las APC o señales emitidas por los LTh), por lo que este proceso puede terminar en tolerancia. La vía clase II es propia de las APC y consiste en la captación e internalización en endosomas de los antígenos exógenos. Los antígenos se procesan en el lisosoma por la acción de enzimas proteolíticas y los péptidos resultantes del procesamiento antigénico se unen a moléculas MHC de clase II. El complejo MHCII/determinante T helper es transportado a la superficie celular para ser presentado a los linfocitos T colaboradores (Th). Ciertos antígenos exógenos a pesar de ser fagocitados por las APC profesionales, son capaces de salir de los fagosomas y entrar en el citosol. De esta forma son procesados por la ruta citosólica mediante mecanismos que pueden ser tanto dependientes como independientes del proteasoma. Así, los antígenos son presentados a través del MHCI de la APC al LTc (GilTorregrosa et al. 1998; Heath and Carbone 2001; Rock and Shen 2005). Este proceso se conoce como crosspresentation (presentación cruzada). 26

47 Introducción Figura 4. Esquema del procesamiento y presentación de los péptidos (Heath and Carbone 2001) Células dendríticas Las DC son células que derivan de las células madre hematopoyéticas de médula ósea y han sido identificadas como las APC más eficaces. Actúan de enlace entre la inmunidad innata y adaptativa permitiendo el inicio y la modulación de la activación de ambas respuestas. Su papel principal es la captura, procesamiento y presentación de antígenos a través del MHC a los linfocitos T y, de este modo, activación de la respuesta inmunitaria mediante la producción de citocinas y la inducción de la activación de los linfocitos. Constituye una población celular heterogénea que controla tanto la inmunidad como la tolerancia inmunológica. En sangre se distinguen dos tipos de DC, en función de sus características fenotípicas (expresión diferencial de marcadores de superficie) y funcionales (patrón diferencial de citocinas). Estas células dendríticas son las DC mieloides y las DC plasmacitoides. Las DC convencionales o mieloides (DCm), provienen de la línea mieloide y su función principal es la presentación antigénica. Migran a los tejidos periféricos, donde interceptan y capturan los patógenos, antes de su migración a los ganglios linfáticos para activar la respuesta T (Belmonte et al. 27

48 Introducción 2007). Se caracterizan por su capacidad para producir citocinas como IL12 y TNFα, con el objetivo de promover una respuesta de tipo Th1 y desarrollo de linfocitos T citotóxicos. La segunda subpoblación de DC, de origen linfoide, se denomina DC plasmacitoide (DCp). Se distinguen de las DCm por no expresar CD11c y se caracterizan por su capacidad para producir grandes cantidades de IFNγ en respuesta a infecciones virales (Cella et al. 1999; Siegal et al. 1999; Sun et al. 1998), cumpliendo de esta forma un importante papel en la respuesta inmunitaria innata. Al contrario de las DCm, migran directamente de la sangre a los tejidos linfáticos secundarios. El IFN de tipo I inducido por las DCp puede activar las células NK y las células T CD8, regular la producción de IL12 mediada por las DCm, e intervenir en la diferenciación de células B en células plasmáticas (Liu 2005). Otra función de las DCp es el procesamiento de antígenos y su presentación a los linfocitos T. Sin embargo, las DCm son más eficaces en esta función (Krug et al. 2003). La capacidad de las DC para activar la repuesta inmunitaria depende de su estado de maduración. Se encuentran ampliamente distribuidas como células inmaduras en todos los tejidos, especialmente en los que interactúan con el medio ambiente (epitelios de la piel y mucosas). La internalización de antígenos extraños puede desencadenar su maduración y la migración desde los tejidos periféricos a los órganos linfoides donde tendrá lugar la activación linfocitaria. En estado inmaduro, poseen una gran capacidad fagocítica y expresan un amplio espectro de receptores (TLR, receptores de quemoquinas entre otros). Sin embargo, el nivel de expresión en la superficie celular de moléculas de MHC, coestímulo y adhesión es muy bajo. La principal función de estas células consiste en detectar la presencia de agentes extraños, capturarlos y transportarlos a los nódulos linfoides. Si la DC reconoce señales de peligro sufre un proceso de maduración que activa el proceso de migración a los nódulos linfoides. Durante la migración, las DC maduras, presentan un cambio en su morfología, aumentan su movilidad y se vuelven muy eficaces en la presentación antigénica y en la estimulación de los linfocitos T vírgenes. Los procesos de maduración y migración están íntimamente ligados y la completa 28

49 Introducción maduración finaliza después de la migración. Tras el reconocimiento antigénico, se produce un aumento en los niveles de expresión del ligando de CD40 en la superficie del linfocito Th. Este ligando interacciona con la molécula CD40 presente en la superficie de las DC, promoviendo su activación (Steinman and Young 1991; Bennett et al. 1998). Estas interacciones inducen la expresión de altos niveles de MHC y de moléculas de adhesión y coestímulo (CD40, CD54, CD80, CD86) en la superficie de las DC, así como la producción de citocinas proinflamatorias (IL12, TNFα) (Cella et al. 1999; Koch et al. 1996). Los linfocitos T, tras ser activados, van a migrar desde los nódulos linfoides a través de la circulación sanguínea hasta donde se encuentre el antígeno para eliminarlo (Figura 5). En resumen, la función efectora de las DC está influenciada por la etapa de maduración, la concentración de antígeno, la vía de entrada antigénica, y el microambiente de citocinas presente. Entrada de Ag Captura y procesamiento de Ag APC inmadura Eliminación del antígeno Maduración y migración Tejidos periféricos Vasos inflamados APC madura Expresión de moléculas de coestímulo y producción de citocinas Linfocitos T Ganglio linfático Presentación del Ag a los linfocitos T Figura 5. Esquema del proceso de activación de la respuesta inmunitaria adaptativa. 29

50 Introducción Señalización del calcio en la activación linfocitaria Los iones de Ca 2 funcionan como segundos mensajeros en todas las células eucariotas, incluyendo células del sistema inmunitario. La entrada de Ca 2 al interior celular es la señal crucial para la correcta activación de los linfocitos, la realización de sus funciones efectoras, de diferenciación, la correcta sinapsis entre células dendríticas y células T, así como, la exocitosis en células T citotóxicas. Un influjo de Ca 2 en el citosol ocurre después de la unión a inmunorreceptores de superficie celular, por ejemplo la unión al BCR (B cell receptor) o al TCR (T cell receptor) (van Leeuwen and Samelson 1999). En los linfocitos el principal mecanismo de incremento de las concentraciones celulares de calcio ocurre tras el vaciado de los depósitos intracelulares, mecanismo conocido como SOCE (store operated calcium entry), con la participación de la activación de los canales de liberación de calcio CRAC situados en la membrana plasmática (Feske 2007) (Figura 6). Figura 6. Mecanismo SOCE (store operated calcium entry) de Stefan Feske (Feske 2007). Cuando tiene lugar el reconocimiento antigénico a través del TCR, los reservorios de calcio en el retículo endoplasmático se vacían. Esto produce activación de CRAC generándose un incremento de calcio citosólico, que a su vez, permitirá la activación de enzimas dependientes de calcio, como la 30

51 Introducción calcineurina, factores de transcripción como NFAT (nuclear factor of activated T cells) o el NFκB (nuclear factor κb). Este mecanismo es necesario para la activación y expresión génica de citocinas por los linfocitos T y B. En ausencia del influjo de calcio, la activación celular, proliferación y funciones efectoras estarían comprometidas (Feske et al. 2001; Partiseti et al. 1994). Varios mecanismos influencian en la forma, duración y fuerza de la señal de Ca 2, entre otros están: la despolarización de la membrana plasmática que reduce la fuerza de entrada de calcio, los canales Kv1.3 que favorecen la hiperpolarización de la membrana plasmática y las bombas de Ca 2 dependientes de ATP que permiten la entrada de Ca 2 al RE inhibiendo indirectamente a los CRAC (Cahalan et al. 2001; Chandy et al. 2004). Por este motivo cualquier alteración en alguno de los mecanismos que afecten a la entrada de Ca 2 a la célula puede tener gran repercusión en la activación linfocitaria. 2. Estrategias de vacunación La activación de los linfocitos T está dirigida por células presentadoras de antígeno profesionales conocidas como células dendríticas (DCs). Estas células juegan un rol fundamental en la iniciación de la respuesta inmune celular contra patógenos. Las DCs actúan como centinelas en tejidos periféricos, linfa y órganos linfoides secundarios, todos ellos lugares que se encuentran constantemente expuestos a patógenos, cumpliendo la función estratégica de captura y presentación de antígenos propios y ajenos a linfocito T. Los antígenos son procesados hasta fragmentos peptídicos que se presentan unidos a moléculas MHC de clase I y II, para la activación de linfocitos T CD8 o CD4, respectivamente, necesarios para dar inicio a la inmunidad celular contra el agente patógeno. Este proceso de captación de antígeno, degradación y carga, se denomina presentación antigénica. Sin embargo, en ausencia de estimulación, las células dendríticas periféricas presentan los antígenos de modo ineficaz. Las señales exógenas provenientes de los patógenos (tales como el LPS, DNA, CpG, RNA), o las señales endógenas activadas en los procesos 31

52 Introducción inflamatorios (en conjunto denominadas señales de peligro), inducen a las células dendríticas para que inicien un proceso de desarrollo denominado maduración, que transforma a las células dendríticas. De este modo, las células dendríticas se convierten en las APC más potentes y las únicas capaces de activar a los linfocitos T no activados e iniciar la respuesta inmunológica. El reconocimiento de estos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) por medio de receptores específicos en la DC, así como, citocinas proinflamatorias (señales endógenas), produce una serie de cambios que conducen a la maduración de esta célula. Mientras las DCs inmaduras son tolerogénicas, las maduras son, por el contrario, inmunogénicas. Se han observado al menos seis tipos de receptores de superficie capaces de desencadenar la maduración de células dendríticas: (i) receptores tipo peaje tolllike receptors (TLR), (ii) receptores de citocinas, (iii) moléculas de la familia de receptores TNF (TNFR), (iv) FcR, (v) sensores de muerte celular y (vi) receptores del complemento. Algunos de los estímulos más eficaces de maduración están mediados por interacciones TLR (TLR110) con sus respectivos ligandos (Latz et al. 2003). El reconocimiento de ligandos por los TLR activa la vía del NFkB, conduciendo a la iniciación de la respuesta inmune adaptativa por la producción de citocinas inflamatorias tales como la interleucina IL1, IL8, TNFalfa, IL12 y la inducción de moléculas de coestimulación, tales como la CD80, CD86 y CD40. En nuestro laboratorio hemos mostrado que el dominio extra A de la fibronectina (EDA), es un ligando natural de la molécula TLR4 y que su unión a un antígenio viral o tumoral puede aumentar su inmunogenicidad, convirtiendo a EDA en un candidato para el desarrollo de vacunas (Aranda et al. 2011; Mansilla et al. 2009). La combinación de varias vías de activación de las DC podría derivar en el desarrollo de una estrategia de vacunación más eficaz. En este sentido, las proteínas del complemento podrían constituir una herramienta interesante. 32

53 Introducción Actualmente, una estrategia utilizada en la vacunación frente a infección es la utilización del fragmento C3d como molécula adyuvante en la vacunación. C3d conjugado a un antígeno mejora la respuesta inmune frente al antígeno. C3d se une al receptor del complemento 2 (CR2) que se encuentra en la superficie de las células dendríticas foliculares, las células B y células T, estimulando la presentación antigénica por las células dendríticas foliculares y ayudando a mantener la memoria inmunológica de las células B. En las células B, la interacción C3d y CR2 reagrupa algunas moléculas como CD19, desencadenando la activación y proliferación celular. Por otra parte, la unión simultánea de C3d, CR2 y del anticuerpo unido al antígeno de superficie, activa otra vía de señalización sinérgica. También está descrito que C3d sin presencia de CR2 induce la producción de anticuerpos, indicando un mecanismo de acción CR2 independiente (Dempsey et al. 1996; Watanabe et al. 2003; Bower et al. 2004; Wang et al. 2004; Kolla et al. 2007). Esta estrategia también es utilizada para la vacunación frente al crecimiento tumoral con resultados muy parecidos. Xu Gl et al. han diseñado una vacuna de DNA que expresa la región extracelular murina del VEGFR2 y 3 copias del fragmento C3d (C3d3). Estos autores describen que con esta proteína de fusión se puede inhibir de manera significativa el crecimiento del tumor y que la administración de C3d como adyuvante molecular aumenta los niveles de anticuerpos contra el VEGFR2, proporcionando una alternativa terapéutica a las terapias frente al cáncer (Xu et al. 2010). Otro fragmento del complemento descrito como posible vacuna es el C5a. Un ejemplo es la fusión entre anticuerpos dirigidos al antígeno tumoral HER/neu con el fragmento C5a y C5a desarg, que induce una mayor muerte celular en el tumor que aquellos anticuerpos sin la fusión con el fragmento C5a (Fuenmayor et al. 2010). Por otra parte la inmunosupresión ejercida por las células T reguladoras es un mecanismo de regulación de la respuesta inmunitaria, constituyendo una diana perfecta para bloquear con el fin de potenciar la respuesta inmunitaria. 33

54 Introducción Las vacunas son uno de los métodos más eficaces de control de enfermedades infecciosas. Actualmente, se requiere del desarrollo de alternativas terapéuticas, basadas en la optimización de las estrategias de vacunación para potenciar las respuestas inmunitarias celulares. De particular interés es una nueva oleada de vacunas que inducen respuesta de células T citotóxicas CD8, en contraste con el mecanismo tradicional de inducir una respuesta humoral, y cómo pueden ser utilizadas estas vacunas terapéuticamente. En este trabajo queremos abordar dos puntos clave para potenciar la respuesta inmunitaria; por una parte queremos potenciar la presentación antigénica con la utilización de la proteína EDA (ligando de TLR4), diferentes anafilotoxinas y el uso de adyuvantes como el poly(i:c); y por otra parte, nos parece interesante bloquear la función de las células T reguladoras, con el objetivo de mejorar la vacunación. La estrategia de vacunación planteada se muestra en la Figura 7. DC inmadura Inhibición de la función supresora de las células T reguladoras TLR4 (EDA) TLR3 (Poly (I:C)) C5aR (C5a) T reg DC madura IL10 TGFβ Potenciar la presentación antigénica Figura 7. Estrategia de vacunación planteada en este trabajo. 34

55 Introducción Como se refleja en la Tabla 4, se pueden utilizar distintas combinaciones de una gran variedad de inmunógenos, administrados en diferentes vehículos y utilizando distintos adyuvantes. Tabla 4. Estrategias de inducción de respuestas inmunitarias celulares. Antígenos Péptidos Lipop Proteínas éptidos Proteínas ADN desnudo ADN ARN mensajero desnudo ARNm Virus recomb. Virus Bacts recomb. Bacts... recomb. Vehículos Salino Emulsiones, Liposomas aceites Liposomas Virosomas Virosomas Virus like particles Virus Nanopartículas like particles Nanopartículas Proteínas Proteínas Anticuerpos Anticuerpos Células dendríticas Células... dendríticas Adyuvantes IFA, CFA, ISCOMS... ISCOMS,... Citoquinas, quemoquinas. Moléculas coestimuladoras: anti anti41bb, 41BB, anticd40, anticd28, anticd28 Estímulos maduración de células dendríticas. Ligandos de TLR. Estrategiasde Primeboost primeboost Inhibidores de Treg Polietilenimina (PEI) A continuación se enumeran las diferentes estrategias utilizadas en este trabajo DNA desnudo Son plásmidos que codifican para un antígeno tumoral o viral. Las células que han sido transfectadas expresan esa proteína y, una vez procesada, los determinantes antigénicos T citotóxicos (DTc) y los determinantes antigénicos T colaboradores (DTh) son presentados a los linfocitos T para la inducción de una respuesta inmunitaria. Además, estas células transfectadas expresan el antígeno con las modificaciones translacionales y conformacionales nativas, por lo tanto estimulan la producción de anticuerpos de alta especificidad para el antígeno. Su acción imita lo que ocurre en un proceso infeccioso o tumoral. Estos plásmidos pueden llevar genes que codifican las secuencias de proteínas completas (Ulmer et al. 1993), o secuencias cortas, que codifican únicamente las regiones de las proteínas con interés desde el punto de vista inmunológico, que corresponden a los DTc y/o DTh (Ishioka et al. 1999; Depla et al. 2008; Durantez et al. 2009). A pesar de que la cantidad de proteína sintetizada a partir del vector plasmídico es relativamente pequeña, es suficiente para desencadenar una respuesta inmunitaria eficaz, debido en parte a las características inmunopotenciadoras intrínsecas del DNA, como las 35

56 Introducción secuencias CpG (ligando de TLR9); (Klinman et al. 1996; Corr et al. 1997). La existencia de dichas secuencias induce la producción de diferentes citocinas proinflamatorias, como IFNγ. Esto hace que una de las propiedades generales de la vacunación con DNA desnudo sea la generación de respuestas inmunitarias tipo Th1. Esta estrategia de vacunación presenta la eficacia de las vacunas vivas convencionales con la seguridad de las vacunas inactivadas, aunque existen algunos riesgos asociados como la posible integración del plásmido en el genoma de la célula transfectada, inducción de anticuerpos contra el DNA del plásmido y la inducción de procesos autoinmunes, entre otros riesgos potenciales Proteínas recombinantes de fusión basadas en el dominio extra A de la fibronectina (EDA) El desarrollo de vectores o métodos de transporte y captación de antígenos en las DC in vivo, constituye una estrategia alternativa en el diseño de nuevas vacunas para potenciar la respuesta inmunitaria frente a tumores o agentes infecciosos. Un ejemplo es la incorporación de ligandos para los PRRs en las vacunas. Con ello se promueve por un lado, la activación de la respuesta innata con la producción de citocinas proinflamatorias y el aumento de moléculas de coestímulo que permite inducir una respuesta adaptativa efectiva, y por otro lado se induce el transporte y captación del antígeno a la DC, así como la maduración de la DC (Kaisho and Akira 2002; Guy 2007; Werling and Jungi 2003). Varios grupos ya han contrastado esta hipótesis y han descrito que la unión covalente de un antígeno a ligandos de TLR (por ejemplo, de TLR5 como la flagelina (Cuadros et al. 2004) o de TLR9 como los CpGs (Tighe et al. 2000)) o a otros receptores de las DC (como complejos peptídicos de las chaperonas a través de los receptores Hsp (Delneste et al. 2002; Binder and Srivastava 2005)), péptidos derivados de las modulinas de Staphylococcus epidermidis (Durantez et al. 2010), proteínas de fusión recombinantes basadas en la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis que se unen al complejo CD11b/CD18 (Fayolle et al. 1999; 36

57 Introducción Guermonprez et al. 2001), o anticuerpos monoclonales específicos de antígenos superficiales de las DC (Bonifaz et al. 2004; Sancho et al. 2008) son capaces de dirigir antígenos a las DC in vivo, de fomentar su presentación y, por tanto, de favorecer la iniciación de una respuesta inmunitaria específica frente a esos antígenos. Buscando el mismo objetivo, y aprovechando su unión al receptor TLR4 y su capacidad de inducir citocinas proinflamatorias, en esta tesis hemos seleccionado el domino extra A de la fibronectina (Okamura et al. 2001) El domino extra A de la fibronectina (EDA) La fibronectina es una glicoproteína presente en la matriz extracelular (en su forma insoluble) y en los fluidos corporales (en su forma soluble) de los vertebrados. Para ser funcional, forma dímeros consistentes en 2 subunidades similares unidas por dos puentes disulfuro. Cada monómero es una molécula larga y flexible con tres tipos de dominio homólogos repetidos conocidos como I, II, y III. La fibronectina juega un papel muy importante en el mantenimiento de la morfología normal de la célula, así como en la adhesión celular, migración, diferenciación y proliferación (Kaspar et al. 2006). La forma soluble incrementa la coagulación y la fagocitosis (Engvall and Ruoslahti 1977; Bohnsack et al. 1985). Esta proteína presenta distintas isoformas generadas por splicing alternativo del RNAm. En humanos se han detectado hasta 20 de estas isoformas. Estos splicing pueden ocurrir en tres regiones: el dominio extra A (EDA), el dominio extra B (EDB) y la región variable IIICS. Las dos primeras regiones o se incluyen o se excluyen totalmente. Sin embargo la tercera región tiene varios sitios de splicing, pudiendo dar lugar a 5 variantes distintas (Figura 8). 37

58 Introducción Figura 8. Representación de los dominios de la fibronectina (dominios extra A, B y IIICS). El dominio EDA se encuentra elevado durante el desarrollo embrionario, y disminuye sustancialmente tras el nacimiento y con la edad (Hynes 1990). Sin embargo se ha descrito un aumento en su producción en circunstancias concretas, como reparación tisular, fibrosis, angiogénesis, artritis reumatoide o inflamación. Así, se ha empezado a estudiar el papel de EDA como marcador en diversas enfermedades como tumores sólidos y metástasis (Rybak et al. 2007; Villa et al. 2008), artritis reumatoide (Przybysz et al. 2009) o fibrosis (Hackl et al. 2010). Por otro lado se ha descrito que tanto EDA como la fibronectina que contiene EDA inducen una respuesta inmunitaria parecida a la observada con LPS, en la que se observa una activación de TLR4, la inducción del factor de transcripción NFkB, la inducción de genes codificantes para citocinas proinflamatorias, la liberación de proteoglicanos y la producción de las metaloproteinasas de matriz 1, 2 y 9 (Saito et al. 1999). Todos estos resultados sugieren que la producción local de EDA en respuesta a daño tisular u otros daños podría inducir el reclutamiento de DC al sitio del daño y la posterior maduración de estas DC. Con el fin de dirigir el antígeno a las DC y así facilitar la inducción de respuestas celulares in vivo, en trabajos anteriores hemos unido covalentemente esta proteína a diferentes DTc bien caracterizados o a proteínas con varios determinantes, tanto DTc como DTh (Lasarte et al. 2007; Mansilla et al. 2009; Aranda et al. 2011) (Figura 9). 38

59 Introducción 3. Maduración de CD EDADTc 1. Unión TLR4 2. Activación de la señalización TLR MHCII CD54 MHCI CD80 CD86 Citoquinas 4. Presentación antigénica Célula T CD Inmadura CD Madura 5. Activación célula T Tejido Nódulo linfoide Figura 9. Esquema del proceso de activación de la respuesta inmunitaria adaptativa a través de las proteínas de fusión EDADTc o EDAproteína. En este trabajo, con la idea de potenciar el efecto inmunomodulador de EDA y aprovechar las propiedades proinflamatorias de las anafilotoxinas, hemos construido proteínas de fusión donde añadimos covalentemente el fragmento del complemento C5a al constructo EDADTc con el objetivo de mejorar la respuesta celular in vivo. Posteriormente hemos estudiado su potencial como adyuvante de vacunación Péptidos inhibidores de las células T reguladoras La activación del sistema inmunitario es el resultado de un proceso muy complejo de interacciones entre moléculas inmunoestimuladoras y moléculas inmunosupresoras. Estas últimas pueden afectar enormemente a la inmunogenicidad de una vacuna. Por este motivo, otro de los abordajes en el desarrollo de vacunas radica en el diseño de inhibidores de los mediadores de inmunosupresión. La inhibición de la función de las células Treguladoras CD4CD25 en pacientes con cáncer es un paso esencial para mejorar la eficacia de las terapias antitumorales, especialmente los enfoques basados en inmunoterapia (Colombo and Piconese 2007). Nuestro grupo ha desarrollado un péptido inhibidor de la molécula FOXP3 con capacidad para reducir la función supresora de las células Treg (Casares et al. 2010). En este trabajo pretendemos demostrar que la inhibición de canales de Cl mediante péptidos frente al intercambiador AE2, puede afectar a la función supresora de las Treg, sin que las células T efectoras vean 39

60 Introducción comprometidas sus funciones efectoras, nos basamos en los resultados descritos por el grupo del Dr Medina que observan que ratones knockout para AE2 presentan un reducido número de Treg y elevado número de linfocitos T CD8 (Salas et al. 2008) Anafilotoxinas. Generalidades Como se ha comentado anteriormente, durante la activación del sistema del complemento se generan unos pequeños péptidos con actividad de anafilotoxinas. El más potente es el fragmento C5a, seguido de C3a y con muy poca actividad el fragmento C4a. Sus principales funciones son la activación de células mieloides, quimiotaxis de los PMN, degranulación de mastocitos (contracción de la musculatura lisa e incremento de la permeabilidad capilar) y la potenciación de la vasodilatación que permite acelerar el paso del patógeno a los ganglios con lo que se iniciará la respuesta adaptativa. Las propiedades proinflamatorias de las anafilotoxinas, nos motivaron al estudio de su potencial como adyuvantes de vacunas. A continuación, nos referiremos principalmente al fragmento C5a Efecto biológico de C5a C5a es una glicoproteína de 74 aminoácidos ( 11 kda) con una estructura terciaria característica formada por un haz de cuatro hélices α, es una molécula bioactiva potente que puede actuar sobre una amplia variedad de tipos celulares. Expresa una alta afinidad por los receptores transmembrana C5aR/CD88 y C5L2 (anteriormente conocido como GPR77 o DST11). La interacción del fragmento C5a con su receptor C5aR sobre los neutrófilos, macrófagos y las células endoteliales da lugar a una serie de eventos que inducen una respuesta inflamatoria localizada y contenida. Estos eventos son estrictamente regulados y locales limitándose a una pequeña área del tejido. C5a induce distintos tipos de respuesta en función de los diferentes tipos celulares. Induce la vasodilatación y aumento del flujo sanguíneo a nivel local, la contracción del músculo liso, edema, el aumento de la temperatura en 40

61 Introducción el tejido y la acumulación de neutrófilos en los tejidos extravasculares (Marder et al. 1985; Schumacher et al. 1991). Además, C5a tiene importantes funciones de protección inmunológica al actuar en fagocitos como los neutrófilos y macrófagos, potenciando la respuesta fagocítica cuando entran en contacto con los PAMPs (patrones moleculares asociados a patógenos) y aumentando el ensamblaje del sistema enzimático NADPH oxidasa, cuya actividad constituye una de las fuentes endógenas más importantes de especies reactivas de oxígeno en el organismo. C5a también induce quimiotaxis, los fagocitos se acumulan en los sitios donde se da la producción local de C5a. En conjunto, C5a confiere una mayor protección contra la presencia local de agentes infecciosos. Otro efecto que hemos mencionado anteriormente es la capacidad que tiene el fragmento C5a para conferir resistencia a la apoptosis tanto en neutrófilos como en linfocitos T CD4 (Lalli et al. 2008; Strainic et al. 2008; Perianayagam et al. 2002). Cuando los neutrófilos son sometidos a una situación de estrés como la incubación in vitro a 37 ºC durante un tiempo prolongado se induce la apoptosis celular pero si son expuestos a C5a o a otros mediadores como el factor estimulante de colonias (GCSF) se vuelven resistentes a la apoptosis. C5a activa la vía de la fosfatidilinositol 3quinasa (PI3K). El bloqueo de esta vía con el inhibidor de PI3K elimina la resistencia de los neutrófilos a la apoptosis tras la exposición a C5a (Perianayagam et al. 2002). Por lo tanto, C5a prolonga la vida de los neutrófilos en los sitios de inflamación mejorando la protección frente a agentes infecciosos. Sin embargo, la apoptosis de los neutrófilos es un mecanismo importante para su eliminación y por lo tanto su regulación y en definitiva la regulación de la respuesta inmunitaria. Si el mecanismo de la apoptosis se ve disminuido, la vida útil de los neutrófilos se prolonga implicando una respuesta inflamatoria exagerada. Las células endoteliales también se ven influenciadas por la acción de la anafilotoxina C5a. Estas células tienen un papel clave en la respuesta inflamatoria, son activadas por los mediadores de la inflamación y tras su 41

62 Introducción activación expresan moléculas en sus membranas que favorecen la adhesión de los leucocitos y su posterior activación para la transmigración a tejidos extravasculares. C5a induce la expresión de moléculas de adhesión como la P selectina en la membrana de las células endoteliales, así como también induce la liberación del factor Von Willebrand (Schumacher et al. 1991). En la superficie celular de los neutrófilos la Pselectina interactúa con su ligando, el glicolípido Pselectina 1 (PSGL1), para iniciar el rodamiento de los leucocitos como los neutrófilos. Este es la primera de una serie de interacciones adhesivas que tienen lugar antes de que se produzca la transmigración de los leucocitos en los tejidos extravasculares. C5a también mejora la función de los agonistas de las células endoteliales, como el LPS, causando aumento en la producción de la interleucina IL8 y de interleucina IL6. Ambas citocinas pertenecen a la familia de las quimiocinas y por lo tanto con funciones quimiotácticas (Riedemann et al. 2002; Laudes et al. 2002; Hopken et al. 1996; Strieter et al. 1992). C5a también puede inducir la expresión de su propio receptor C5aR en las células endoteliales (Laudes et al. 2002). En la Figura 10 mostramos un ejemplo de la señalización mediada por C5a en los neutrófilos. Figura 10. Señalización de C5a en neutrófilos. Peter A. Ward (Ward 2004). 42

63 Introducción La unión C5a con su receptor da lugar a la activación de la enzima adenilato ciclasa que cataliza la conversión de ATP a AMPc. Posteriormente tiene lugar la activación de la fosfolipasa C (PLC), el AMPc activa la fosfoquinasa A (PKA), que tiene algunas acciones reguladoras, inhibiendo las moléculas efectoras de señalización mitogénica RAF1 y BRAF. La fosfolipasa C a su vez activa la proteína quinasa C y ésta activa fuertemente a RAF1 y BRAF. A continuación, tiene lugar la activación de MEK1, que induce la activación de la MAP quinasa ERK1/2, esta última causa la fosforilación de las subunidades citosólicas de la NADPH oxidasa. El resultado final de estos eventos es el ensamblaje de la NADPH oxidasa. El sistema de complemento puede modular la respuesta celular T durante las fases de inducción, efectora y de contracción. Algunos datos sugieren efectos pleomórficos y complejos del complemento en la producción de citocinas clave para la diferenciación y función de las células T, actuando no sólo en células T vírgenes sino también localmente en la sinapsis inmunológica entre las células dendríticas y células T determinando el resultado de dicha interacción. Es la señalización mediada por los receptores C3aR y C5aR la que proporciona una señal de coestimulación que permite aumentar la activación y la supervivencia de las células T. Los ratones deficientes en el componente DAF, tras ser inmunizados, presentan una mayor respuesta celular Th1 con una mayor secreción de interleuquina IL2 y de IFNγ y un descenso de los niveles de interleuquina IL 10 (Lalli et al. 2008). También presentan mayores efectos adversos en patologías autoinmunes como la esclerosis múltiple y la encefalomielitis autoinmune experimental (Li et al. 2009). Además, muestran una mejora de la respuesta de células T en un modelo de infección por la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (Fang et al. 2007). Mientras el mecanismo subyacente que contribuye a este fenotipo queda por determinar. Una hipótesis es que, en ausencia de DAF, la activación del complemento en las células presentadoras de antígeno y en las células T se aumenta debido a una mayor producción local de anafilotoxinas. 43

64 Introducción Otro efecto causado por fragmentos activados del complemento y mencionado anteriormente es la inducción de la expansión de las células T por inhibición de la apoptosis (Lalli et al. 2008; Strainic et al. 2008). Se ha descrito que las células dendríticas deficientes en los receptores C3aR o C5aR pierden su capacidad para inducir una potente respuesta celular T, ya que ambos receptores contribuyen en la regulación de la maduración de las células dendríticas y en la captación antigénica (Li et al. 2008; Peng et al. 2009). A través de la interacción del fragmento C5a y su receptor C5aR expresado en la membrana de las células dendríticas tiene lugar una modulación directa de la activación de las células dendríticas como células presentadoras de antígeno y activadoras de las células T. Los ratones deficientes en el receptor C5aR o tratados con antagonistas de C5aR, presentan un fenotipo de célula dendrítica menos activo con un aumento de la expresión de la citocina inmunosupresora IL10 y una disminución de la producción de la citocina proinflamatoria IL12p70 en respuesta a la estimulación con LPS. También se observa un descenso en la expresión de marcadores de maduración como las moléculas MHC de clase II y B7.2 y una capacidad reducida de estimular células T aloespecíficas. Por otra parte, la estimulación del receptor C5aR media la inhibición de la producción de AMPc y de la actividad de la proteína quinasa A participando en la activación de la señalización NFкB y PI3K/AKT. Por lo tanto, C5a actúa directamente sobre su receptor C5aR expresado en dendríticas potenciando la capacidad de las células dendríticas para estimular la respuesta celular T (Peng et al. 2009). El receptor C5aR es necesario para una respuesta antiviral CD8 (Kim et al. 2004). Se ha demostrado que los ratones tratados con antagonistas del receptor C5aR producen una menor respuesta de las células T CD8 antígeno específico frente a la infección por influenza tipo A (Kim et al. 2004). Esto concuerda con la conclusión de que los ratones con deficiencia del factor DAF presentan una mayor respuesta de las células T CD8 antígeno específico tanto 44

65 Introducción naїve como de memoria en respuesta a la infección por LCMV dependiendo de la presencia de los receptores C3aR o C5aR (Fang et al. 2007). Los efectos del complemento en las células T CD4 vienen determinados en función del entorno en el que se da la señalización. Un ejemplo es el caso del asma alérgica, donde los componentes C3a y C5a respectivamente se consideran mediadores proinflamatorios en el proceso de asma alérgica ya que permiten el reclutamiento de células inflamatorias, inducen edema y la bronco constricción. Sin embargo, una deficiencia en C5 produce una mayor susceptibilidad en ratones a padecer asma experimental. Esto es debido a una mayor sensibilización de las células Th2 en la primera exposición al alérgeno inhalado en ausencia de señalización C5aR y mediado por las células dendríticas. Por otro lado se ha descrito que un bloqueo de la señalización del receptor C5aR durante el proceso inflamatorio suprime la sintomatología del asma. Un tratamiento frente al asma mediante bloqueo del receptor C5aR puede ser beneficioso pero a su vez podría inducir una sensibilización a nuevos antígenos (Lambrecht 2006). Algunos estudios describen que el sistema del complemento, indirectamente y a través del componente C5a puede sinergizar con los receptores TLR4 para inducir una respuesta celular de tipo Th17, este podría ser uno de los mecanismos que explicarían la inducción de procesos autoinmunes por el complemento (Fang et al. 2009). Por lo tanto, podemos concluir que el sistema del complemento modula la intensidad y el fenotipo de la respuesta celular T Receptores del fragmento C5a Hay descrito dos receptores para la anafilotoxina C5a, el receptor clásico C5aR (CD88) que forma parte de la superfamilia de los receptores acoplados a proteína G (Figura 11) y un receptor no acoplado a proteína G y descrito posteriormente llamado C5L2 (GPR77). El receptor C5aR tiene una elevada afinidad para C5a sin embargo esta afinidad es del orden de 10 a 100 veces menor para el producto C5a desarg. Por otra parte, el receptor C5L2 45

66 Introducción interacciona con C5a con una afinidad parecida a C5aR pero unas 20 veces mayor con el producto C5a desarg. Asimismo, C5L2 también interacciona con C3a y C3a desarg (Cain and Monk 2002; Scola et al. 2007) Receptor C5aR (CD88) El receptor C5aR se localiza principalmente en células mieloides, incluyendo neutrófilos, monocitos, células dendríticas, macrófagos y eosinófilos. Pero también se ha demostrado que se expresa en las células del parénquima de varios órganos sólidos, incluyendo hepatocitos humanos, células del epitelio alveolar de bronquios y pulmón, en músculo liso vascular de pulmón y en las células endoteliales (Wetsel 1995). Los neutrófilos son las células con una mayor densidad de expresión de C5aR, y por este motivo son las células más sensibles al efecto de la anafilotoxina C5a. Últimamente se ha descrito la expresión de C5aR en los linfocitos T CD4. La señalización C5aR en los linfocitos T parece ser importante para inducir una correcta expansión de las células T efectoras, limitando la apoptosis inducida por activación antigénica regulando la expresión de Bcl2 y Fas (CD95) (Lalli et al. 2008; Strainic et al. 2008). También hay trabajos que describen la expresión de C5aR en células B. A través de la interacción con el receptor C5aR (Figura 11), la anafilotoxina C5a induce toda la señalización proinflamatoria descrita. 46

67 Introducción Figura 11. Estructura molecular e interacción entre C5a y su receptor C5aR humano. Peter A.Ward (Ward 2004) Receptor C5L2 (GPR77) Los estudios de bloqueo del receptor C5L2 así como en ratones knockout han sugerido que el receptor C5L2 es importante en la regulación de la función de C5a y C5a desarg, pudiendo actuar como receptor señuelo para la señalización de C5a permitiendo la eliminación en el ambiente extracelular de los fragmentos C5a (Okinaga et al. 2003; Scola et al. 2007). Otros estudios indican una función de señalización para C5a distinta a la mediada por el receptor C5aR (Gao et al. 2005; Gerard et al. 2005). Así mismo, está descrito que pacientes que sobreviven a la sepsis presentan mayores niveles de expresión del receptor C5L2 que aquellos que no sobreviven a la sepsis (HuberLang et al. 2005). Este es un ejemplo de función de señuelo del receptor C5L2. Sin embargo otros estudios de sepsis posicionan este receptor C5L2 como un receptor que promueve la inflamación en situación de sepsis ya que parece ser necesario para la inducción de la proteína HMGB1 (High mobility group box 1) a través del cual C5L2 sinergiza con C5aR para llevar a cabo un proceso de inflamación letal durante la sepsis. Además, se postula que C5L2 podría actuar como coreceptor en la activación del receptor TLR4 (Rittirsch et al. 2008). También está descrita la interacción de C5L2 con los 47

68 Introducción fragmentos C3a y C3a desarg mediando la síntesis de triglicéridos en los adipocitos (Kalant et al. 2005). Podemos concluir que el receptor C5L2 presenta ambas funciones, reguladoras como receptor señuelo de C5a y proinflamatorias sinergizando con el receptor C5aR Adyuvantes Las proteínas y los péptidos presentan en general una baja inmunogenicidad, por lo que es necesario combinarlos con diversos adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria más fuerte (Kim et al. 1998). Muchas de las propiedades inmunopotenciadoras de los adyuvantes radican en su capacidad de interactuar con las APC. Como adyuvante hemos seleccionado el poly(i:c) (ácido poliinosínico:policitidílico), que es un análogo sintético del RNA de doble cadena capaz de unirse al TLR3, un receptor para RNA de doble cadena que está expresado en células NK, macrófagos, DC (Banchereau and Steinman 1998) y células T CD4 (Gelman et al. 2004). Los mecanismos por los que el poly(i:c) es capaz de mejorar las respuestas celulares no están bien definidos, aunque parece ser que son parcialmente dependientes de las células NK, pero no NKT. Esta molécula está asociada con una rápida activación de las células NK, que contribuyen a la rápida inducción de citocinas proinflamatorias como IFN tipo I, TNF, IFN, IL12 e IL15, y al aumento de la proliferación de las células T CD8 (Salem et al. 2005). Además, el poly(i:c) puede madurar eficazmente las DC (que también contribuyen a la producción de citocinas proinflamatorias) al unirse a ellas a través de su TLR3 (Schwarz et al. 2003), y mejora las respuestas T CD8 memoria y antitumorales (Salem et al. 2005; Zhang et al. 1998). 48

69 Introducción En la Figura 12 mostramos la estrategia de inmunización utilizada en este trabajo, basada en la unión de la proteína EDAantígeno al fragmento del complemento C5a y en combinación con el adyuvante poly(i:c). poly(i:c) TLR3 C5aR EDAAgC5a APC TLR4 Figura 12. Estrategia de inmunización. 49

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71 OBJETIVOS

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73 Objetivos Una de las características del sistema inmunitario es su sofisticación en el control de la activación de una respuesta inmunitaria celular T. Así, existen una serie de células y moléculas inmunopotenciadoras que pueden a su vez ser controladas por células y moléculas inmunosupresoras. Las células dendríticas son las células presentadoras de antígeno encargadas de la activación de los LT, mientras que las células T reguladoras (Treg) presentan una actividad inmunosupresora que, aunque es esencial para la protección frente a las enfermedades autoinmunes, puede dificultar la activación de una respuesta antiviral o antitumoral. Por lo tanto, planteamos dos estrategias para la optimización de las estrategias de vacunación. La primera de ellas es el desarrollo de inhibidores de las células T reguladoras que hacen de freno del sistema inmunitario y la segunda es el desarrollo de moléculas que faciliten la captura del antígeno por las células dendríticas y por tanto su inmunogenicidad. En este trabajo nos planteamos el abordaje de estas dos estrategias con los siguientes objetivos: 1. Conocer la implicación de los canales de Cl y Ca 2 en la activación celular de los linfocitos T, así como en la función supresora de las células T reguladoras. Diseñar péptidos inhibidores de los canales de Cl AE2, a fin de revertir la función supresora de las células T reguladoras. 2. Estudiar el potencial inmunomodulador in vivo de proteínas de fusión formadas por las anafilotoxinas derivadas del complemento y el dominio EDA de la fibronectina, unidos a un antígeno. 53

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75 MATERIAL Y MÉTODOS

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77 Material y métodos 2. Células Todas las líneas celulares descritas en este apartado se cultivaron en estufas incubadoras estándar a 37 ºC y con un 5% de CO 2. Las células tumorales E.G7OVA (ATCC CRL2113) derivan de la transfección de la línea celular de timoma EL4 con el DNA complementario de la proteína ovoalbúmina (OVA) de la clara de huevo del pollo. Presentan la restricción H2 b y se cultivan en medio RPMI1640 (BioWhittaker, Bélgica) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Scotland, UK), antibióticos (penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 g/ml) y M 2mercaptoetanol. A partir de ahora nos referiremos a esta formulación como medio completo (MC). El medio fue suplementado con 400 μg/ml del antibiótico geneticina (G418, Invitrogen) para seleccionar únicamente las células transfectadas con el plásmido que expresa la proteína ovoalbúmina. Estas células se usaron en experimentos in vivo de protección y tratamiento de tumores con EDASIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKL C5a. Las células THP1 (ATCC TIB202), derivadas de monocitos humanos, se cultivan en MC y se utilizaron para estudiar la capacidad de las proteínas EDA SIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a para inducir la producción de citocinas proinflamatorias. La línea celular B3Z (cedida por la Dra. C. Leclerc, Institute Pasteur, Paris, Francia) proviene de un hibridoma de células T CD8 específico de SIINFEKL. Se utilizaron para estudiar la presentación antigénica de EDASIINFEKL, EDA SIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a. Las células CTLL2 (ATCC TIB214) son una línea de células T citotóxicas de ratón. Son dependientes de IL2, por lo que se cultivan en MC suplementado con esta citocina a una concentración de 10 U/mL. Se utilizaron para estudiar la presentación antigénica de EDASIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a. Las células YAC1 (ATCC TIB160) (Manassas, UA) se utilizaron para estudiar la actividad de las células NK. 57

78 Material y métodos Las células HEK293 (Invitrogen, CA, EE.UU.) derivan de riñón embrionario humano y están transfectadas establemente con la región E1 del adenovirus tipo 5 humano (Ad5). Se cultivaron en medio DMEM (BioWhittaker, Bélgica) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Scotland, UK), antibióticos (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 g/ml), 2 mm glutamina y M 2mercaptoetanol. Se utilizaron para comprobar la expresión de las formas secretables de los plásmidos de expresión. 2. Ratones Se utilizaron ratones de distintas cepas en función del antígeno inoculado en la inmunización o del ensayo realizado. Todos ellos se mantuvieron con los cuidados y condiciones adecuadas, siguiendo las normas institucionales requeridas para la experimentación con animales. Hembras de 6 semanas de edad de la cepa BALB/c (Harlan, Barcelona), restricción H2 d. Hembras de 6 semanas de edad de la cepa C57BL/6 (Harlan), restricción H2 b. Ratones hembras TLR4KO con fondo C57BL/6. Fueron cedidas por el Dr. M. Chingard (Institute Pasteur, Paris, Francia). Ratones macho C5aRKO con fondo C57BL/6. Fueron cedidos por Rubén Pío (Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona, España). 3. Antígenos 3.1. Péptidos Síntesis de péptidos La síntesis de péptidos se realizó en un sintetizador manual múltiple de 9 pocillos diseñado en nuestro laboratorio (BorrasCuesta et al. 1991), así como en uno automático (Apex 396 Aapptec LLC; Louisville, KY, EE.UU.). En ambos casos se usó el método de síntesis en fase sólida de Merrifield (Merrifield 1964), utilizando como grupo protector temporal el fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Los péptidos se 58

79 Material y métodos sintetizaron unidos a una resina de poliestirenodivinilbenceno (palkoxybenzyl Alcohol resin, Sigma Chemical Co., St Louis, EE.UU.). El primer aminoácido estaba unido directamente a la resina, cuyo grado de sustitución era diferente en función de cual fuese ese aminoácido (en nuestros péptidos varió entre meq/g). Dicha resina se colocó en los pocillos del sintetizador y los solventes (que generalmente fueron dimetilformamida), se eliminaron mediante filtración y con ayuda de una bomba de vacío. La síntesis se realizó desde el extremo carboxi terminal hasta el extremo amino terminal, añadiendo aminoácidos acetilados (en el sintetizador automático) o ésteres activos de los distintos aminoácidos (en el sintetizador manual), con el extremo amino terminal protegido por el grupo temporal base lábil Fmoc y las cadenas laterales protegidas por grupos ácidos lábiles (Bachem, Suiza). En este proceso de síntesis peptídica, la adición de cada aminoácido a la cadena peptídica supone tres pasos: la escisión del grupo protector Fmoc del último aminoácido, la adición de un aminoácido activado y finalmente la monitorización de la eficacia de unión mediante el ensayo de Kaiser o test de ninhidrina, que detecta grupos amino libres. Este proceso de escisión del grupo Fmoc, adición de aminoácido y monitorización, se repite tantas veces como aminoácidos forman la secuencia del péptido. Tras la desprotección del último aminoácido, el péptido es escindido del soporte sólido mediante un tratamiento ácido, que permite cortar selectivamente el péptido del agente de unión a la resina, manteniendo estable el enlace peptídico. Además, el medio ácido también escinde los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos. Al final de la síntesis, los péptidos desecados se disolvieron en agua MilliQ para su liofilización (Benchtop, The Virtis Company Inc., NY, EE.UU.). Una vez liofilizados, los péptidos se conservaron a 20 ºC. Los péptidos sintetizados se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC), utilizando el sistema Agilent G1311A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) y una columna Zorbax Eclipse XDBC18, 5 µm, 4,6x150 59

80 Material y métodos mm (Agilent Technologies). Sólo se utilizaron aquellos péptidos con una pureza superior al 80%. Los péptidos se disolvieron en PBS (Invitrogen, Paisley, Inglaterra) o medio RPMI1640 (BioWhittaker, Bélgica). Si la solubilidad del péptido no era muy alta, se disolvió en dimetilsulfóxido (nunca superando el 20% p/v) y se llevó al volumen final con PBS o RPMI1640. En la Tabla 5 se muestran las secuencias aminoacídicas de los diferentes péptidos sintetizados frente al intercambiador AE2, diseñados en función de posibles interacciones entre aminoácidos afines, utilizando matrices de complementariedad y teniendo en cuenta el volumen de cada aminoácido. Asimismo, nos basamos en la estructura del intercambiador AE2 y en la presencia de bucles extracelulares que están implicados en su función. Tabla 5. Secuencia aminoacídica de los diferentes péptidos sintetizados frente AE2. Abreviatura péptido Proteína Secuencia Mouse AE213 Bucle 3 del intercambiador AE2 KKKAGKKKKKKFFWA Mouse AE214 Bucle 3 del intercambiador AE2 DSEAGSSSSSNMTVA Mouse AE215 Bucle 3 del intercambiador AE2 RRRAGRRRRRRFFWA Mouse AE216 Bucle 3 del intercambiador AE2 RRRAGRRRRRRFFVA Mouse AE217 Bucle 3 del intercambiador AE2 KKKKKKFFWAFFILF Mouse AE218 Bucle 3 del intercambiador AE2 SSSSSNMTVAFFILF Mouse AE219 Bucle 3 del intercambiador AE2 KFFWAFFILFGKKKK Mouse AE220 Bucle 3 del intercambiador AE2 NMTVAFFILFGRRRR Mouse AE221 Bucle 3 del intercambiador AE2 FFILFGKKKKAKGKK Mouse AE222 Bucle 3 del intercambiador AE2 FFILFGRRRRARGRR Mouse AE223 Bucle 3 del intercambiador AE2 KKKKAKGKKGKKEGE Mouse AE224 Bucle 3 del intercambiador AE2 RRRRARGRRGRRDGD Mouse AE225 Bucle 4 del intercambiador AE2 KKFLFKELKFGKGLK Mouse AE226 Bucle 4 del intercambiador AE2 RRFLFRELRFGRGLR Mouse AE227 Bucle 4 del intercambiador AE2 KELKFGKGLKFFAGK Mouse AE228 Bucle 4 del intercambiador AE2 RELRFGRGLRFFAGR Mouse AE229 Bucle 4 del intercambiador AE2 GKGLKFFAGKEEGWL Mouse AE230 Bucle 4 del intercambiador AE2 FFAGKEEGWLIDGLG 60

81 Material y métodos Mouse AE231 Bucle 1 del intercambiador AE2 DFDKLIGL Mouse AE232 Bucle 1 del intercambiador AE2 DTDKLIGL Mouse AE233 Bucle 1 del intercambiador AE2 ETEKLIGL Péptidos comerciales El péptido SIINFEKL, determinante T citotóxico de la proteína ovoalbúmina (OVA) que corresponde a la secuencia , fue sintetizado por la empresa Neomps (Estrasburgo, Francia). Su pureza fue analizada por HPLC y fue superior al 90% Análisis de interacción biomolecular Se confirmó la interacción del péptido AE217 con AE2, por el método de resonancia de plasmones utilizando el ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System (Biorad). El bucle 3 extracelular de AE2 (secuencia DSEAGSSSSSNMTWATTILVPDNSSASGQSGQEKPR) biotinilado se inmovilizó a la superficie de un chip NLC funcionalizado con neutravidina (Biorad). Como controles negativos usamos PBS y un péptido biotinilado del factor de transcripción NFAT. El péptido (5 μm) fue inyectado con PBS Tween % ph 7.4 a un flujo de 50 μl/min. Los resultados obtenidos son normalizados con la señal obtenida en la interacción con el péptido biotinilado de NFAT Plásmidos de expresión Construcción Los plásmidos pshuttleedasiinfekl, pshuttlec3dedasiinfekl, pshuttlec5aedasiinfekl, pshuttlec3aedasiinfekl y pshuttlec4aeda SIINFEKL que expresan versiones secretables de EDASIINFEKL, C3dEDA SIINFEKL, C5aEDASIINFEKL, C3aEDASIINFEKL y C4aEDASIINFEKL respectivamente, se construyeron previo clonaje de los insertos diseñados en el vector TOPOTA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Los insertos se sintetizaron por PCR añadiendo la secuencia del péptido señal de la preprotripsina (HPPTLP) en el extremo N terminal. 61

82 Material y métodos Inicialmente, se amplificaron por transcripción inversapcr o RTPCR los distintos fragmentos del complemento utilizando cebadores específicos (Tabla 6) y partiendo de muestras de RNA de hepatocito de ratón tratado con ConA. Las muestras de RNA se extrajeron según el método Chomczynski y Sacchi (Chomczynski and Sacchi 1987), partiendo de tejido hepático homogeneizado y lisado en Ultraspec (Biotech, Houston, TX, EE.UU.) empleando Ultra Turrax Driver T.25 (Jankel and Kunkel, Ika Labortechnik, Staufen,Alemania). Paralelamente amplificamos por PCR la secuencia EDASIINFEKL utilizando cebadores específicos y partiendo del plásmido pet20bedasiinfekl que expresa la secuencia EDASIINFEKL (Tabla 6). Los productos amplificados por PCR se clonaron en el vector pcr2.1topo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), utilizando el kit de clonaje TOPO TA (Invitrogen) (Tabla 8). Posteriormente se subclonó la secuencia EDASIINFEKL del vector pcr2.1 TOPO en el plásmido de expresión pshuttle (Clontech, BD Biosciences, NJ, EE.UU.) (Tabla 8). Para ello, se realizó la digestión del vector con las enzimas de restricción NheI y Afl II (BioLabs) para extraer la secuencia EDASIINFEKL y poder hacer la ligación de este inserto con el vector pshuttle previamente digerido con las mismas enzimas NheI y Afl II (BioLabs). Los distintos fragmentos del complemento clonados en el vector TOPOTA se subclonaron en el plásmido pshuttleedasiinfekl, para ello se realizó la digestión de los plásmidos pcr2.1topo y el plásmido pshuttleedasiinfekl con la enzima de restricción Kpn1 (New England BioLabs), posteriormente se llevó a cabo la ligación de los insertos en el plásmido digerido pshuttleedasiinfekl. Todas las secuencias obtenidas fueron verificadas por secuenciación de DNA, por el servicio de secuenciación del Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA). 62

83 Material y métodos Tabla 6. Secuencia de cebadores utilizados para amplificar los fragmentos del complemento y EDASIINFEKL. Nombre Secuencia 5 3 Diana Tªm ( ºC) Orientación Sense C3d GGTACCACCCCCGCAGGCTGT Kpn sentido AntiSense C3d GGTACCGCTACGGCTGGGGAGGTG Kpn antisentido Sense C3a GGTACCTCAGTACAGTTGATGGAAAG Kpn sentido AntiSense C3a GGTACCTAGTCCTACGGTCCTGGCCAGGC CCAGCACGTG Kpn antisentido Sense C5a GGTACCAACCTGCATCTCCTAAGGCAG Kpn sentido AntiSense C5a GGTACCTAGTCCTACGGTGATATCTGCCTT CATCACTGG Kpn antisentido Sense C4a GGTACCGGAAACAGCAAAGGCA Kpn sentido AntiSense C4a Sense Nhe PS Nde1 Kpn EDA SIINF Sal Hind 3 His stop Alf2 GGTACCTAGTCCTACGGTCACCTGGCACC CCCGGCTGCTGA GCTAGCATGTCGGCCCTGCTGATCCTGGC CCTGGTCGGAGCCGCCGTCGCCCATATGG GTACCAACATTGATCGCCCTAA CTTAAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAA GCTTGTCGACCCATTCAGTCAGTTTTTC Kpn antisentido Nhe I 99.3 sentido Alf2 88 antisentido Transfección en células adherentes Para comprobar la correcta expresión de las proteínas por los plásmidos, realizamos la transfección in vitro en células adherentes HEK293 (Invitrogen) utilizando el kit Superfect Transfection Reagent (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas antes de realizar la transfección, sembramos 0.3 x 10 6 células por pocillo en placa de 12 pocillos, de modo que conseguimos realizar la transfección cuando las células estaban confluentes (60 80%). Se realizaron triplicados por cada plásmido. Las células fueron incubadas con el medio de transfección (1.5 μg de plásmido 7.5 μl superfect DMEM) durante 3 horas, se lavaron con PBS y se incubaron en medio de cultivo DMEM en presencia de 10% de FBS, permitiendo la expresión del DNA transfectado. A las 48 horas recogimos el sobrenadante y las células. Las células se lavaron y se resuspendieron en solución RIPA (TrisHCl 50 63

84 Material y métodos mm ph 7.4, Igepal CA %, EDTA 5 mm, NaCl 250 mm, NaF 50 mm, Na 3 VO mm) suplementado con PMSF 1 mm (SIGMA) y una dilución 1:100 de inhibidor de proteasas (SIGMA). Las células se incubaron durante 30 minutos a 4ºC, posteriormente fueron sometidas a un proceso de sonicación y finalmente se centrifugaron durante 10 minutos a rpm y 4ºC y se recogió los sobrenadantes para cuantificar las proteínas por el método BCA y congelarlas a 20ºC Western blot Para comprobar la expresión de los plásmidos en las células HEK293 se realizó la detección de las proteínas secretables mediante la técnica de Western blot. Los extractos celulares se sometieron a electroforesis en un gel de acrilamida SDS al 15% (véase el apartado ). Posteriormente se realizó la transferencia de las proteínas separadas en la electroforesis en un soporte de nitrocelulosa (BioRad, Alemania) a partir del gel de acrilamida. El tampón de transferencia utilizado fue TrisHCl 0.25 M, glicina 1.92 M y metanol al 20%(v/v), ph 8.3. La transferencia se realizó a un voltaje fijo de 100V y a una intensidad variable de ma durante 40 minutos. Posteriormente realizamos el inmunoblot que consiste en cuatro pasos. El primero es bloquear la membrana de nitrocelulosa (PBS con 5% de leche y 0.05% Tween20) durante 1 hora a temperatura ambiente, permitiendo el bloqueo de las uniones inespecíficas. Posteriormente incubamos el anticuerpo primario antieda (dilución 1/2000 en PBS 1X con 5% leche) durante 2 horas, seguido de 5 lavados de 10 minutos con PBS Tween % (v/v) para eliminar el exceso de anticuerpo. El siguiente paso es la incubación del anticuerpo secundario unido a peroxidasa antirabbit IgG HRPlinked (Cell Signaling) durante 1 hora. Tras 5 lavados de 10 minutos con PBS y Tween % (v/v) para eliminar el exceso de anticuerpo, se incuba la membrana durante 5 minutos con la solución que contiene los sustratos de la reacción enzimática (ECL PLUS WesternBlot KIT, Amersham) y se pone en contacto con la película fotográfica. Después de una exposición se procede al revelado utilizando el revelador Curix60, AGFA. 64

85 Material y métodos 3.3. Proteínas recombinantes de fusión Construcción Para la obtención de la proteína C5aEDASIINFEKL, el inserto C5aEDA SIINFEKL del plásmido pshuttlec5aedasiinfekl fue subclonado en el plásmido pet20b (Novagen, Darmstadt, Alemania), que permite la expresión de proteínas de fusión con una cola de 6 histidinas en el extremo Cterminal (Tabla 8). Ambos plásmidos fueron digeridos con las enzimas de restricción NdeI y HindIII. Para obtener la proteína EDASIINFEKLC5a, inicialmente se amplificó la secuencia de C5a flanqueada con la enzima SalI partiendo del clon C5apCR2.1 TOPO que previamente habíamos clonado. Para realizar esta amplificación utilizamos cebadores que contienen la secuencia de SalI, así como una secuencia espaciadora (GS(G 4 S) 2 GS) en el cebador antisentido (Tabla 7). Esta secuencia espaciadora permite mayor flexibilidad en el plegado de la proteína. Posteriormente se realizó la digestión del vector pshuttle EDASIINFEKL con la enzima SalI para realizar la clonación. Una vez confirmada la clonación, el fragmento EDA SIINFEKLC5a se subclonó en el plásmido pet20b. La proteína SIINFEKLC5a se obtuvo amplificando la secuencia SIINFEKLC5a, utilizando el vector C5a pcr2.1topo obtenido previamente y la secuencia SIINFEKL presente en el cebador sentido. Utilizando como cebador antisentido un fragmento de la secuencia de C5a (Tabla 7). El inserto amplificado SIINFEKLC5a se clonó en el vector TOPO TA, para posteriormente insertar el fragmento SIINFEKLC5a en el vector pshuttle EDASIINFEKL que previamente digerimos con los mismos enzimas de restricción NdeI y AflII para extraer la secuencia EDASIINFEKL y sustituirla por la secuencia SIINFEKLC5a. Una vez obtuvimos el vector pshuttle SIINFEKLC5a el inserto se subclonó en el vector de expresión pet20b. Para construir la proteína EDASIINFEKL se amplificó el cdna resultante de la RTPCR de muestras de RNA de hepatocito de ratones tratados con ConA, utilizando los cebadores EDAs y EDASIINFEKLas (Tabla 7). Los productos resultantes se clonaron en pcr2.1 TOPO usando el mismo kit de clonado. Estos 65

86 Material y métodos plásmidos fueron digeridos con NdeI y NotI, los fragmentos obtenidos fueron subclonados en el plásmido pet20b. Todos los constructos fueron verificados por secuenciación de DNA. Una vez obtenidos y confirmados todos los plásmidos, fueron transfectados en bacterias BL21(DE3) para la expresión de la proteína recombinante. Tabla 7. Secuencias de los cebadores utilizados para la construcción de las diferentes proteínas de fusión. Nombre Secuencia 5 3 Diana Tªm ( ºC) Orientación NdeI SIINFEKLC5a CATATGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTT TGAAAAACTGAATGGAACCTGCATCTCCT AAGGCAG NdeI 85.2 sentido C5a Stop AflII CTTAAGTCATATATCTGCCTTCATCACTGG AflII 67.0 antisentido Sense SalI C5a Antisense C5a linker XbaiI SalI GTCGACGGGTCGAACCTGCATCTCCTAAG GCAG GTCGACTCTAGACGACCCTGATCCTCCTCC TCCTGATCCTCCTCCTCCCGACCCGATATCT GCCTTCATCACTGG SalI 82.5 sentido SalI 94.1 antisentido EDAs EDASIINFEKLas CCATATGAACATTGATCGCCCTAAAGGAC T AGCGGCCGCCCATTCAGTCAGTTTTTCAA AGTTGATTATACTCTCAAGCTGTGTGGACT GGATTCCAATCAGGGG KpnI 85 sentido AlfI 93 antisentido Tabla 8. Mapa de los vectores utilizados. Nombre Características Mapa Vector de clonaje para productos de PCR por el método TA. Plásmido lineal con los extremos activados pcr 2.1TOPO para la unión covalente de la Topoisomerasa I. Contiene múltiples lugares de restricción para facilitar el clonaje. Posee resistencia a ampicilina y a kanamicina para su selección en bacterias. 66

87 Material y métodos Nombre Características Mapa Vector de expresión con promotor de CMV, que permite niveles altos de expresión y de pshuttle2 manera constitutiva del gen de interés. Expresión en gran variedad de células eucariotas. Posee resistencia a kanamicina para su selección en bacterias. Nombre Características Mapa Vector de expresión en células procariotas. Contiene múltiples lugares de restricción. Contine el Tag CTerminal con His. Para pet20b facilitar la purificación de la proteína en resinas de níquel (purificación por afinidad). Posee resistencia a ampicilina para su selección en bacterias Purificación Las bacterias transformadas se crecieron a 37ºC en medio LB. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica de 0.5, se indujo la expresión de las proteínas agregando al medio 4 ml/l de IPTG (SIGMA, Alemania) a una concentración de 100 mm (400 μm, concentración final de IPTG). En el caso de las proteínas purificadas de fracción soluble se hizo una incubación de 16 horas a temperatura ambiente en agitación. En el caso de las obtenidas a partir de cuerpos de inclusión la incubación fue de 3 horas a 37 ºC. Posteriormente se centrifugó el cultivo a 8000 rpm. El precipitado se resuspendió en 8 ml de TrisHCl 0.1 N. A la hora de lisar las bacterias, se trató el extracto bacteriano con antiproteasas (Complete Protease Inhibitor Cocktail de Roche, Alemania) y 1.2 L/L de lisozima (Novagen). Se incubó durante 15 minutos a 30 ºC, se pasó por la prensa de French a 2000 psi de presión y se centrifugó el extracto a rpm. Las proteínas de fracción soluble se purificaron a partir del sobrenadante y las proteínas de cuerpos 67

88 Material y métodos de inclusión del precipitado, que se resuspendió en una solución de urea a una concentración 8 M, a la que se la añadió HEPESNa a una concentración de 20 mm. En todo el proceso de purificación de las proteínas de fracción soluble se utilizó el PBS como base de las soluciones requeridas en las diferentes técnicas. Sin embargo, en la purificación de las proteínas extraídas de cuerpos de inclusión, la base de todas las soluciones fue urea 8 M, HEPESNa 20 mm. A la hora de purificar las proteínas se utilizaron diversas técnicas. Todas estas técnicas, a excepción del isoelectroenfoque y el detoxificado manual, se realizaron en una plataforma FPLC Äkta (Pharmacia, GE Healthcare, EE.UU.). Esta plataforma cuenta con dos bombas para la inyección de soluciones. Además tiene un sistema de inyección de muestra que permite cargar desde 100 μl hasta 50 ml. La plataforma cuenta con diferentes columnas intercambiables, dependiendo del tipo de purificación que se vaya a realizar. Este equipo tiene además un lector de UV (280 nm) que monitoriza a cada momento la absorbancia de la muestra a la salida de la columna. Finalmente el equipo cuenta con un recolector de muestras. El aparato se puede obstruir fácilmente, por lo que todas las soluciones y las muestras que se utilizan en las purificaciones fueron previamente filtradas con un filtro Millex de 0.8 m de tamaño de poro (Millipore, MA, EE.UU.) en el caso de las muestras, o un filtro Express PLUS de tamaño de poro 0.22 m (Millipore) para las soluciones. Las diferentes técnicas utilizadas fueron: Purificación por afinidad Dado que las proteínas diseñadas poseen una cola de histidinas en su extremo Cterminal, utilizamos las columnas Histrap HP (GE Healthcare) para su purificación por cromatografía de afinidad. Las columnas Histrap HP (GE Healthcare) están empaquetadas con una resina de Ni 2 (Ni Sepharose High Performance), el níquel es un metal con gran afinidad por el aminoácido histidina, al igual que por el imidazol. Por lo tanto las 68

89 Material y métodos proteínas con una cola de histidinas son capaces de quedarse unidas a la columna Histrap HP. El imidazol se utiliza para competir en la unión de la proteína a la columna, en presencia de imidazol en la solución, la unión níquelproteína está desfavorecida. A mayor concentración de imidazol, menor cantidad de proteína se une al níquel. Con el fin de evitar uniones inespecíficas de proteínas en las columnas, las muestras se inyectaron con una pequeña cantidad de imidazol, en un rango entre 0 y 100 mm de imidazol en función de la afinidad de la proteína por el níquel. La proteína se recuperó mediante la elución con una solución con 500 mm imidazol Intercambio iónico Esta técnica permite separar y por lo tanto purificar proteínas en función de su carga neta. Las proteínas dependiendo del ph en el que se encuentran tienen diferente carga, por lo que se unen con diferente afinidad a una columna cargada. Esta columna puede contener aniones o cationes. El pi de la proteína a purificar es lo que determina el tipo de intercambio: si el ph utilizado es mayor que el pi se realiza un intercambio aniónico y si es menor, uno catiónico. Por otro lado, la diferencia entre el ph y el pi debe ser como mínimo de 1.52 unidades. Para eluir las proteínas retenidas en la columna se sube la fuerza iónica de la fase móvil, aumentando la concentración de sal (NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas más débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas. En nuestro caso, realizamos un intercambio aniónico para purificar EDA SIINFEKL y un intercambio catiónico para purificar SIINFEKLC5a. Para purificar la proteína SIINFEKLC5a recogimos la fracción no retenida en columna. En ambos casos usamos la columna HI TRAP DEAE FF (GE Healthcare). Para eluir la muestra se utilizó una solución con NaCl 0.5 M Replegado y detoxificado Las proteínas extraídas a partir de cuerpos de inclusión deben ser replegadas para recuperar su actividad biológica. 69

90 Material y métodos El replegado se realiza en columna cromatográfica mediante la realización de un gradiente decreciente en concentración de urea. Las columnas utilizadas fueron HiTrap Desalting Column (GE Healthcare). El fundamento de esta técnica, es que la proteína avanza a través de una columna equilibrada con el tampón de replegado consistente en 50 mm TrisHCl con 1 mm glutatión reducido y 1 mm glutatión oxidado, en la que previamente se ha hecho un gradiente decreciente de urea (desde 8 M a 0 M) en la cabeza de la columna. Al atravesar el gradiente, la proteína va pasando lentamente de una solución de urea, a una solución Tris, favoreciendo el replegado de la proteína. Con estas columnas se realizó además del replegado de la proteína el desalado de la misma. La proteína procedente de fracción soluble, EDASIINFEKL, se desaló utilizando las columnas PD10 (GE Healthcare). En los casos en los que se necesitó concentrar la proteína antes de proceder al siguiente paso de purificación, se utilizaron tubos de concentración por centrifugación Amicon Ultra MWCO (Millipore). Para finalizar la purificación de las proteínas, se procedió al detoxificado. Para ello se emplearon las columnas Endotrap (Profos, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para comprobar que realmente se habían eliminado las endotoxinas de las proteínas se realizó un ensayo con el kit Quantitative Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (Cambrex, IA, EE.UU.). Se consideró un nivel de endotoxinas aceptable cuando las muestras no superaron 0.1 unidades de endotoxina por μg de proteína. Dependiendo de las características de cada proteína se utilizó un protocolo distinto. En la Tabla 9 se resumen los diferentes protocolos. 70

91 Material y métodos Tabla 9. Resumen de los protocolos seguidos para la purificación de las diferentes proteínas. Proteína Tipo de purificación Soluciones utilizadas EDASIINFEKL Fracción soluble Afinidad Intercambio aniónico Desalado y detoxificado BA: PBS 20 mm imidazol (ph 7,2) BB: PBS 500 mm imidazol (ph 7,2) BA: Tris 20 mm imidazol 0,1 M NaCl (ph 8,28) BB: Tris 20 mm imidazol 0,5 M NaCl (ph 8,28) C5aEDASIINFEKL Cuerpos de inclusión Afinidad Replegado BA: PBS 60 mm imidazol (ph 7,2) BB: PBS 500 mm imidazol (ph 7,2) 50 mm TrisHCl 1 mm glutatión oxidado 1 mm glutatión reducido Detoxificado EDASIINFEKLC5a Cuerpos de inclusión Afinidad Replegado BA: Urea 60 mm imidazol (ph 7,2) BB: Urea 500 mm imidazol (ph 7,2) 50 mm TrisHCl 1 mm glutatión oxidado 1 mm glutatión reducido Detoxificado SIINFEKLC5a Cuerpos de inclusión Afinidad Intercambio catiónico Replegado BA: Urea 60 mm imidazol (ph 7,2) 8 M urea20 mm HEPES 0.4 % TritonX 0.4% Tween 20 BB: Urea 500 mm imidazol (ph 7,2) BA: Urea 20 mm Hepes (ph 5) BB: Urea 20 mm Hepes 0.5 M NaCl (ph 8) 50 mm TrisHCl 1 mm glutatión oxidado 1 mm glutatión reducido Detoxificado El rendimiento de cada una de las producciones dependió de la proteína, aunque en términos generales osciló entre 110 mg por litro de cultivo bacteriano Análisis de la pureza Después de cada paso de purificación y también al final de la misma se realizaron análisis de la pureza de la proteína mediante SDSPAGE y tinción con Azul de Coomassie Geles SDSPAGE y tinción con Azul de Coomassie Las muestras de proteínas se sometieron a electroforesis en un gel de acrilamidasds al 15%, en el que también se cargó un marcador de peso molecular, el RainbowTM Coloured Protein Molecular Weight Marker (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). El tampón utilizado fue TrisHCl 25 mm, glicina 192 mm, SDS 71

92 Material y métodos 0.1%, ph 8.3. La electroforesis se realizó a un voltaje fijo de 90 V y a una intensidad variable de 2030 ma, durante 2 horas aproximadamente. A continuación se lavó el gel 3 veces con H 2 O destilada, y se procedió a su tinción con BioSafe Coomassie (BioRad) durante 30 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se lavó el gel con H 2 O destilada. Los geles teñidos fueron desecados en un desecador (BioRad) Ensayos de actividad Análisis de activación de monocitos Para comprobar que las proteínas purificadas eran capaces de activar a células TLR4 para la producción de citocinas proinflamatorias, se utilizó la línea celular THP1. Se incubaron las células THP1 (2x10 5 células/pocillo) con las diferentes proteínas a una concentración de 1 μm, 0.1 g/ml de LPS (Sigma) como control positivo o MC como control negativo. A las 16 horas de cultivo, se recogieron los sobrenadantes y se midió la producción de TNFα humano mediante un ensayo de ELISA comercial (OptEIA ELISA Set, BD Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante Análisis de maduración de células dendríticas Diferenciación DC Para la generación de DC de ratón a partir de precursores de médula ósea, se extrajeron las médulas del fémur y la tibia, y se lisaron los eritrocitos utilizando una solución de lisis ACK (NH 4 Cl 0,15 M, KHCO 3 10 mm, Na 2 EDTA 0,1 mm) durante 1 minuto. A continuación, se realizó un lavado con RPMI 1640 y se procedió a eliminar los linfocitos y granulocitos mediante lisis por complemento. Para ello, las células se incubaron con una mezcla de anticuerpos frente a las distintas poblaciones celulares y complemento de conejo: Anticuerpo anticd4. Se obtuvo a partir del hibridoma GK1.5 (ATCC). El anticuerpo así obtenido se añadió a una concentración de 100 μg/ml. 72

93 Material y métodos Anticuerpo anticd8. Se obtuvo a partir del hibridoma de rata H (ATCC)(Pierres et al. 1982). También se utilizó a 100 μg/ml. Anticuerpo Ly6G/Gr1 (BD Biosciences). Se usó a 10 μl/ml. Este anticuerpo se utilizó para eliminar los neutrófilos y granulocitos. Anticuerpo anticd45r/b220 (BD Biosciences). Empleado a 50 μl/ml. Este anticuerpo se utilizó para eliminar los linfocitos B Complemento de conejo (SIGMA). Se utilizó a 50 μg/ml. Esta mezcla se incubó en una estufa a 37 C durante 50 minutos, agitando cada 20 minutos. Tras la depleción se realizó un lavado, y las células que quedan se cultivaron a una concentración de 10 6 células/ml en placas de 12 o 96 pocillos (Iwaki, Japón) en MC suplementado con 20 ng/ml de GMCSF e IL4 (ambos de Peprotech, Londres, Reino Unido) en estufas incubadoras estándar a 37 ºC y con un 5% de CO 2. Los días 2 y 5 se reemplazaron dos terceras partes del medio por MC fresco suplementado con las citocinas en la misma concentración. A día 6 se añadieron los estímulos de maduración, 0.1 μg/ml de lipopolisacárido (LPS de Escherichia coli 0111:B4; SIGMA) ó 500 nm de las proteínas. Pasadas 24 horas, se recogieron las células para analizar por citometría de flujo el nivel de expresión de marcadores de maduración, medir la producción de citoquinas, o hacer ensayos de presentación antigénica Análisis in vitro de la maduración de las células dendríticas Las células dendríticas se crecieron a partir de células de médula ósea. Tal y como está descrito en el apartado anterior ( ). Las células dendríticas resultantes se cultivaron en presencia o ausencia de las proteínas EDASIINFEKL (500 nm), EDASIINFEKL C5a (1 μm), SIINFEKL C5a (1 μm), LPS (0.1 μg/ml) como control positivo y medio de cultivo como control negativo. Tras 24 h de cultivo se analizó la expresión de moléculas de coestímulo por citometría de flujo y la producción de citocinas mediante el uso de una matriz comercial que contenía anticuerpos (Raybio mouse citokine antibody array (RayBiotech)), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 73

94 Material y métodos Expresión de marcadores de maduración Al tratarse de una población homogénea donde la mayoría de las células son CD11c, se realizó un marcaje simple con el marcador que se quiere analizar. Los anticuerpos que se utilizaron fueron: anticd40 (clon 3/23), anticd54 (clon 3E2), anticd80 (clon 1610A1), anticd86 (clon GL1), antiia b (clon AF ) antih2k b (clon AF688.5), anticd11c (clon HL3) marcados en verde con fluorescein isothiocyanate (FITC) (todos de BD Biosciences). Además se incubaron las células con un isotipo marcado con FITC (también de BD Biosciences) como control para eliminar la unión inespecífica de los anticuerpos. El marcaje se realizó a 4ºC en PBS con 2% de FBS. Tras 15 minutos, las células se lavaron y se analizó la expresión de los distintos marcadores de superficie mediante citometría de flujo (BD, FACSCalibur TM) Producción de citocinas Transcurridas 24h de incubación con los diferentes estímulos se recogió el sobrenadante y se midieron distintas citoquinas mediante un Array comercial (RayBiotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como unidades relativas cuantificando la señal por densitometria Presentación antigénica Para estudiar la capacidad de la proteína EDASIINFEKLC5a de ser procesada y presentada por la vía de señalización del MHC de clase I, quisimos estudiar si la expresión de TLR4 y C5aR en las DC podía favorecer la presentación de EDASIINFEKLC5a en mayor medida que con la proteína EDASIINFEKL. Se incubaron las células B3Z (específicas de SIINFEKL) a una concentración de 10 5 células por pocillo con diferentes concentraciones de EDASIINFEKL y EDA SIINFEKLC5a en presencia de 10 5 esplenocitos por pocillo de ratones C57/BL6. La activación de las células B3Z se midió mediante la producción de la citocina IL2, para lo que se utilizó la línea celular CTLL2, cuyo crecimiento es dependiente de esta citocina. Para realizar el ensayo, se cultivaron 50 L de los sobrenadantes con células CTLL2 por pocillo, diluidos hasta un volumen final de 100 L. 74

95 Material y métodos Tras 24 horas de cultivo, se añadieron 0.5 Ci (25 Ci/mmol) de timidina tritiada (Amersham) por pocillo y 20 horas después se cosecharon las células, con un cosechador (Harvester, Filtermate 196, Packard). La timidina incorporada al DNA se cuantificó en un contador de centelleo (Topcount, Packard) (Lai et al. 1987) Migración celular Para estudiar el efecto quimiotáctico directo de las proteínas de fusión o por la activación de la liberación de agentes quimiotácticos, realizamos ensayos de transmigración celular en transwell. Se usaron cámaras transwell con filtro de poro de 5 µm de diámetro (Costar, Corning Incorporated). En la cámara superior se añadieron esplenocitos de ratón (10 6 ) C57BL/6 en medio libre de suero (100 µl). En la parte inferior se añadieron 50 µm de la proteína en un volumen final de 500 µl de medio sin suero o bien 500 μl de sobrenadante de esplenocitos de ratón (10 6 ) C57BL/6 (Harlan) incubados con 50 µm de proteína en medio libre de suero durante 3 horas. Tras 3 horas de incubación a 37 ºC, retiramos la cámara superior donde se situaban las células que no habían migrado. Se añadió 10 5 bolitas CalibriteTM3 (BD, Biosciences) por pocillo en un volumen de 50 µl. Se recogieron las células y tras realizar tres lavados con PBS, se procedió a la cuantificación celular mediante citometría de flujo (BD, FACSCalibur ) adquiriendo 4000 bolitas Calibrite por muestra. Los esplenocitos se marcaron con antily6g FITC y anticd11b PE (BD Biosciences) para diferenciar los macrófagos (Ly6G CD11b). También se cuantificó por ELISA (BD, Biosciences), la expresión de la quimiocina MIP1α presente en el sobrenadante utilizado como quimiotáctico. 4. Estudio in vitro de los intercambiadores de iones cloruro, calcio y potasio en la activación linfocitaria 4.1. Análisis de la expresión de mrna por PCR quantitativa La extracción de RNA de las células T efectoras CD4CD25 (Tefect) y de las células T reguladoras CD4CD25 (Treg), se realizó usando una solución de lisis para la purificación de ácidos nucleicos (Applied Biosystems) y el sistema ABI PRISM 6100 nucleic acid Prepstation (Applied Biosystems). Las muestras fueron 75

96 Material y métodos sometidas a un tratamiento con DNasa, transcripción reversa y PCR cuantitativa a tiempo real utilizando cebadores específicos para diferentes moléculas. Los valores de mrna se representan por la fórmula 2 ΔCt donde ACt indica la diferencia en el umbral del ciclo entre el gen control (betaactina) y el gen diana Purificación de células T reguladoras La purificación de las células Tefect y de las células Treg se realizó partiendo de esplenocitos de ratón BALB/c utilizando un kit de separación de células Treg (Milteny Biotec, Bergish Gladbach, Germany) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se confirmó una pureza de las poblaciones purificadas superior al 95% por citometría de flujo Ensayos de proliferación celular Cultivamos esplenocitos CD4CD25 (Tefect) de ratones hembras BALBc 10 5 cels/pocillo con 0.5 μg/ml de anticuerpo anti mouse CD3 (BD Pharmigen, San Diego CA), con los distintos inhibidores de canales de Cl, péptidos frente AE2 y las proteínas recombinantes en presencia o ausencia de células T reguladoras CD4CD25 (10 4 /pocillo). La proliferación celular se midió por incorporación de 0.5 μci/pocillo de timidina tritiada (Amersham, Pharmacia) al transcurrir tres días y tras 16 horas, se procedió al cosechado de las placas de cultivo utilizando un cosechador (Filtermate 96 harvester; Packard Instrument, Meriden, CT). El contaje de la radioactividad incorporada al DNA celular (como medida de proliferación celular) se realizó mediante un contador de centelleo (Topcount; Packard Instrument). Para inducir un cultivo mixto leucocitario (CML) también usamos células dendríticas 10 3 cels /pocillo de ratones C57BL/6. Dependiendo del ensayo se utilizó 100 U/mL de la citocina IL2 (Roche) para inducir la proliferación celular de las células Treg Cinéticas de calcio intracelular Medimos la cinética del aumento del Ca 2 intracelular por citometría de flujo y por un lector de luminiscencia en microplacas NOVOstar (BMG Labtech, Alemania). Las células (Tefect o Treg) fueron marcadas con el quelante fluorescente 76

97 Material y métodos de Ca 2 Fluo4 AM (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la adquisición de la línea base, las células fueron activadas con distintos estímulos según el ensayo, en presencia o ausencia de DIDS (100 μm). Entre los estímulos destacamos la concanavalina A (40 μg/ml), la tapsigargina (0.5 μg/ml) o el anti CD3 IL2 (0.5 μg/ml y 100 U/mL respectivamente). El análisis del flujo de entrada Ca 2 intracelular para las muestras medidas por citometría de flujo, se realizó con el programa Flow jo (Tree Star, EE.UU.). Las muestras medidas por el lector de luminiscencia se analizaron con el software de análisis del mismo lector. 5. Estudio de la apoptosis linfocitaria in vitro 5.1. Técnica de Tunel Para detectar la rotura del DNA celular inducido por el péptido p17ae2 en las células Treg, hemos utilizado el kit, In situ cell death detection POD (Roche Molecular Biochemicals). Con este objetivo, purificamos las células T efectoras (CD4CD25) y las células T reguladoras (CD4CD25) partiendo de esplenocitos de ratones BALB/c. Posteriormente incubamos las dos subpoblaciones celulares overnight con o sin el péptido p17ae2 (50 μg/ml), utilizando como péptido control el péptido P301, que comprende los aminoácidos de la proteína gp120 del VIH1, y en presencia de 0.5 μg/ml de anti CD3 (BD Pharmigen, San Diego CA) y 100 U/mL de IL2 (Roche Molecular Biochemicals, Alemania). Tras la incubación, añadimos 10 3 células en un porta para cada condición, con su control positivo y negativo. Adherimos las células por citospin y las fijamos con una solución de fijación (4% paraformaldehído en PBS, ph 7.4), tras hacer el lavado con PBS en cubeta, incubamos los portas con la solución de bloqueo (3% H 2 O 2 en metanol) durante 10 minutos a 1525ºC. Seguido de un lavado con PBS incubamos los portas con una solución de permeabilización (0.1% triton X100 en 0.1% de citrato sódico) durante 2 minutos a 4ºC, posteriormente realizamos dos lavados con PBS y añadimos la mezcla de reacción Tunel (marcaje de las roturas de DNA con transferasa terminal desoxinucleotídica), los controles positivos previamente fueron tratados con DNasa I (3 U/mL en 50 mm TrisHCl, ph 7.5, 10 mm MgCl 2 1 mg/ml BSA, durante 10 minutos a 1525 C) y a los controles negativos añadimos sólo la 77

98 Material y métodos solución de marcado (sin la enzima transferasa terminal), dejamos 60 minutos a 37 ºC en estufa húmeda y en oscuridad. La reacción se detuvo con tres lavados con PBS y analizamos las muestras por microscopía de fluorescencia (IRE2; Leica, equipado con una cámara DC300F; Leica), previo marcaje con DAPI (marcaje de núcleo celular de color azul). Las células en apoptosis y por lo tanto con roturas en el DNA se marcaron de color verde. Calculamos el porcentaje de apoptosis celular tras la cuantificación de núcleos apoptóticos (marcaje Tunel) respecto al total de núcleos celulares (marcaje DAPI). Para realizar este análisis, utilizamos el software ImageJ (NIH, Bethesda, EE.UU.). 6. Estudio de la respuesta inmunitaria en ratones 6.1. Inmunización Plásmido Los ratones C57BL/6 recibieron una inyección intramuscular de 50 L de cardiotoxina (10 nm) en el músculo tibial anterior. Cuatro días después recibieron una inyección de 100 g de pshuttleedasiinfekl, pshuttlec3dedasiinfekl, pshuttlec5aedasiinfekl, pshuttlec3aedasiinfekl o pshuttlec4aeda SIINFEKL en el mismo lugar. Dos semanas después recibieron una segunda dosis del plásmido correspondiente Proteína Las diferentes proteínas recombinantes se administraron por vía intravenosa con o sin el adyuvante poly(i:c) (50 g/ratón) en un volumen final de 200 L de solución salina. La cantidad de proteína administrada por ratón fue de 3 nmol, en algunos ensayos fue de 1.5 nmol (como se indica en el apartado de resultados) Estudio in vitro e in vivo de las respuestas inmunitarias inducidas Aislamiento de esplenocitos Entre 6 y 15 días después de la última inmunización, se sacrificaron los animales y se extrajeron los bazos. A continuación, estos órganos se 78

99 Material y métodos homogeneizaron con la base del émbolo de una jeringa o utilizando 2 portas esmerilados, y los eritrocitos se lisaron utilizando solución de lisis ACK (1 ml/bazo) durante 1 minuto. Tras un lavado con RPMI 1640, las células se resuspendieron en medio de cultivo y se utilizaron en los diferentes ensayos que se citan a continuación ELISPOT La cuantificación de células productoras de IFNγ se midió mediante un ensayo de ELISPOT utilizando un kit comercial (BDBiosciences.). Las placas (Multiscreen HTS, Millipore) se incubaron con el anticuerpo purificado antiifnγ (5 μg/ml) durante 16 horas a 4 ºC. Al día siguiente, las placas se bloquearon con MC durante 2 horas y, a continuación, se cultivaron en MC entre 5x10 5 y 10 6 esplenocitos a 37 ºC y 5% de CO 2, en ausencia o presencia del péptido SIINFEKL (1 g/ml) para la estimulación de la respuesta celular T, o utilizando células YAC1 irradiadas (3000 células por pocillo) como estímulo de la respuesta mediada por las células NK. Un día después, las placas se lavaron y se incubaron con el anticuerpo biotinilado anti IFNγ (2 μg/ml). Tras 2 horas, se lavaron y se incubaron con una dilución 1:100 de estreptavidinaperoxidasa. Una hora más tarde, se lavaron las placas y se revelaron con el sustrato AEC (BD Biosciences). La reacción colorimétrica se paró con agua destilada, y el número de puntos se cuantificó utilizando un contador de ELISPOT (CTL, Aale, Alemania) In vivo killing Los ensayos de lisis in vivo o in vivo killing consistieron en inyectar esplenocitos de ratones no inmunizados a ratones previamente inmunizados (tras 7 días de la inmunización). Estos esplenocitos se extrajeron de ratones, de la misma cepa que los inmunizados, el día anterior a la realización del ensayo. La mitad de los esplenocitos se incubó con el DTc SIINFEKL (10 g/ml) durante 30 minutos a 37ºC, la otra mitad se incubó en las mismas condiciones, pero sin DTc. Posteriormente se marcaron los esplenocitos, durante 5 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad, con 2,5 μm de CFSE (Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.) en el caso de los esplenocitos incubados con DTc y 0, 25 μm CFSE en el caso de los incubados sin 79

100 Material y métodos DTc. A los ratones inmunizados se les administró, por vía intravenosa, una mezcla de 1x10 7 de ambos tipos de esplenocitos marcados en una proporción 1:1. A las 16 horas se sacrificaron los ratones y se extrajeron los bazos, que se homogenizaron como se ha descrito en el apartado Los esplenocitos de cada uno de los ratones se analizaron por citometría de flujo para cuantificar la lisis de aquellos esplenocitos pulsados con el DTc. Así, a mayor eficacia de la inmunización, habría una mayor lisis de los esplenocitos marcados con 2,5 μm CFSE y el DTc. Sin embargo, los esplenocitos marcados únicamente con 0,25 μm CFSE, no se lisarían. Como control negativo, se usaron ratones a los que también se les inyectó la mezcla de esplenocitos marcados, pero que previamente no habían sido inmunizados, por lo que no se observaría lisis en ninguna de las dos poblaciones celulares. El porcentaje de lisis específica se calculó según la siguiente fórmula: % esplenocitos CFSE alto (ratón inmunizado) % esplenocitos CFSE bajo (ratón inmunizado) % Lisis específica = 100 x 100 % esplenocitos CFSE alto (ratón no inmunizado) % esplenocitos CFSE bajo (ratón no inmunizado) Inducción de la respuesta inmunitaria en ausencia de señalización C5aR Se inmunizaron por vía intravenosa ratones C57BL/6 con 1.5 nmol de las proteínas EDASIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a suplementado con 50 g de poly(i:c) por ratón en combinación con 100 g de anticuerpo bloqueante para el receptor C5aR, clon 20/70 (AbD Serotec, Oxford, UK). Siete días después de las inmunizaciones, los ratones fueron sacrificados y la respuesta de células T específicas para el péptido SIINFEKL se midió in vivo Depleción in vivo de células NK1.1 Se inmunizaron por vía intravenosa ratones C57BL/6 con 3 nmol de las proteínas EDASIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a suplementado con 50 g de poly(i:c) por ratón. En algunos casos los ratones recibieron un tratamiento de depleción de células NK1.1 que consistió en la administración de 200 g de anticuerpo antink1.1, clon PK136 (BioXCell, West Lebanon, NH.) o del 80

101 Material y métodos correspondiente isotipo control a los días 1, 0 y 3 de la inmunización. La eficiencia de la depleción de las células NK1.1 se analizó por citometría de flujo y en todos los casos fue superior al 95%. Para estudiar el efecto de la actividad NK se realizó el ensayo de in vivo killing a día 7 tras la inmunización. Además, se llevó a cabo un ensayo de ELISPOT para medir la cantidad de células productoras de IFNγ, utilizando como células diana, la línea celular YAC1 (3000 por pocillo) sensitiva a las células NK Estudios in vivo de protección tumoral Modelo tumoral Se estudió la protección conferida por la inmunización frente al crecimiento de una línea tumoral de timoma (E.G7OVA) establemente transfectada con un plásmido que codifica para la proteína OVA, capaz de desarrollar tumores en ratones C57BL/ Estudios de protección de tumores Los ratones se inmunizaron por vía venosa con 3 nmol de EDASIINFEKL, EDASIINFEKLC5a, SIINFEKLC5a o SIINFEKL junto con el adyuvante poly(i:c) (50 μg/ratón), a día 0. Siete días después de la inmunización se inocularon, por vía subcutánea (en el flanco derecho de la espalda), las células E.G7OVA (5 x 10 5 células/ratón) en un volumen final de 200 μl en los ratones que previamente habían sido tratados. En todos los experimentos se incluyó también un grupo de ratones que no recibió ningún tratamiento, y que permitió observar que el tumor se había establecido correctamente. Una semana después se comenzó a tomar la medida de los tumores y se estudió la progresión del volumen tumoral: V= (longitud x anchura 2 )/2, así como la supervivencia de los animales. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen tumoral alcanzó un diámetro de 20 mm. 81

102 Material y métodos Estudios de tratamiento de tumores Se inocularon por vía subcutánea (en la base de la espalda), 5 x 10 5 células E.G7OVA por ratón en un volumen de 200 L. Una vez que los tumores alcanzaron un diámetro de 6 mm se trataron los ratones con las diferentes proteínas; EDA SIINFEKL, EDASIINFEKLC5a y SIINFEKLC5a (3 nmol/ratón) junto con el adyuvante poly(i:c) (50 μg/ml) por vía intratumoral. Se monitorizó el crecimiento tumoral dos veces por semana con un calibre. El tamaño tumoral medio se expresó en milímetros cúbicos, usando la formula V= (longitud x anchura 2 )/2. Al igual que en el estudio de protección, los ratones fueron sacrificados cuando el volumen tumoral alcanzó un diámetro de 20 mm. 7. Estadística La normalidad se estudió con un test ShapiroWilk. Los análisis estadísticos de los resultados se realizaron utilizando test paramétricos (t de Student y ANOVA de una vía) y no paramétricos (KruskalWallis y U de MannWhitney). La supervivencia de los ratones en los experimentos de tumor se analizó mediante el método KaplanMeier y el test logrank. Se consideraron significativos aquellos valores de p < Los análisis estadísticos se realizaron con la ayuda del programa SPSS v.013 para Windows y el programa GraphPad Prism

103 RESULTADOS

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105 Resultados 1. Implicación de los intercambiadores de Cl y canales de Ca 2 en la activación celular de los linfocitos T efectores y T reguladores (CD4CD25FOXP3) 1.1. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la acción de las células T reguladoras (CD4CD25FOXP3) Partiendo de la hipótesis de que la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro puede afectar al flujo de entrada de calcio y por lo tanto a la activación de los linfocitos (Wang et al. 2006), quisimos ver como afectaba un bloqueante inespecífico de los intercambiadores de aniones cloruro en la activación y proliferación celular. Así mismo, quisimos estudiar si la función supresora de las células T reguladoras podría ser revertida con bloqueantes de los intercambiadores de aniones cloruro, ya que está descrito que ratones Knockout para AE2 (intercambiador de aniones cloruro/bicarbonato) presentan un elevado número de linfocitos T CD8, un descenso de células T reguladoras CD4CD25FOXP3 y un patrón de expresión de anticuerpos autoinmunes (Salas et al. 2008). En nuestra primera aproximación a este estudio utilizamos el DIDS (Ácido 4,4'Diisotiocianostilbeno2,2'Disulfónico), por ser un inhibidor de la conductancia aniónica, incluyendo el transporte de aniones cloruro mediados por el intercambiador de Cl /HCO 3 AE13 y otros intercambiadores de HCO 3 como los intercambiadores de Na /HCO 3 (NBCe1, NBCe2, NBCn1, NDCBE, NCBE) (Romero et al. 2004). Se incubaron esplenocitos de ratones BALB/c (10 5 cel/pocillo) junto con células dendríticas de ratones C57BL/6 (10 6 cel/primeros pocillos) a distintas diluciones, en presencia o ausencia de células T reguladoras (10 4 cel/pocillo) obtenidas de ratones C57BL/6 en presencia o ausencia de DIDS (50 μm). Tras 72 horas de cultivo, la proliferación celular se midió por incorporación de timidina tritiada empleando un contador de centelleo. 85

106 Resultados cpm * * CML CML Treg CML Treg DIDS Nº de células dendríticas Figura 13. Cultivo mixto leucocitario (CML) en presencia de células T reguladoras y del inhibidor DIDS. *p<0.05. Observamos que el DIDS produce una inhibición ligera de la función supresora de las células T reguladoras CD4CD25 sobre la respuesta mixta leucocitaria, que se traduce en este ensayo como una proliferación de los esplenocitos en presencia de las células T CD4CD25 (Figura 13). Para descartar que esta reversión de la supresión no era causada por una inducción de la proliferación celular en los esplenocitos CD4CD25 (Tefect), realizamos un cultivo mixto leucocitario (CML) con y sin DIDS (50 μm) en presencia y ausencia de células T reguladoras CD4CD25. También realizamos un ensayo de proliferación de linfocitos Tefect enfrentados o no a células T reguladoras con y sin DIDS (50 μm). Observamos que DIDS no induce proliferación celular en los esplenocitos y si revierte significativamente la actividad supresora de las células T reguladoras murinas CD4CD25 (Figura 14). 86

107 Resultados A B cpm x ns * cpm x ns * 0 0 T efectoras Céls dendríticas T reguladoras DIDS T efectoras AntiCD3 T reguladoras DIDS Figura 14. (A) Cultivo mixto leucocitario en presencia o ausencia de DIDS y en presencia o ausencia de las células T reguladoras. (B) Ensayo de proliferación celular de células T efectoras enfrentadas o no a células T reguladoras en presencia o ausencia de DIDS. *p<0.05. A parte del DIDS hay otros inhibidores inespecíficos de los intercambiadores de aniones cloruro, como por ejemplo el NPPB (ácido benzoico 5nitro1(3fenilpropilamino) y el NFA (ácido niflúmico). Quisimos comparar los tres inhibidores para determinar cual presentaba una mayor inhibición de la función supresora de las células T CD4CD25. Llevamos a cabo un ensayo de proliferación de esplenocitos estimulados con anticd3 y enfrentados con células T reguladoras CD4CD25 en presencia o ausencia de los inhibidores NFA y NPPB (50 μm). 87

108 Resultados cpm x * * ns 0 Esplenocitos AntiCD3 T reguladoras NFA NPPB Figura 15. Ensayos de proliferación celular por incorporación de timidina tritiada con dos inhibidores inespecíficos de los intercambiadores de aniones cloruro. *p<0.05. Observamos que ambos inhibidores revierten significativamente la supresión de las células T reguladoras, pero entre los dos no vemos diferencias significativas (Figura 15). De todos modos, queríamos saber qué rango de concentraciones eran las que revertían esta supresión, por lo tanto, llevamos a cabo otro ensayo de proliferación de esplenocitos estimulados con anticd3 (0.5 μg/ml) y enfrentados con células T reguladoras CD4CD25 pero con distintas concentraciones de inhibidor (de 400 µm a 3,12 µm) (Figura 16). 88

109 Resultados 50 NFA 60 NPPB 40 cpm x cpm x Tefect CD3 Tefect CD3 Treg NFA ( M) 12,5 6,25 3,125 0 Tefect CD3 Tefect CD3 Treg NPPB ( M) 12,5 6,25 3,125 DIDS 60 cpm x Tefect CD3 Tefect CD3 Treg DIDS ( M) 12,5 6,25 3,125 Figura 16. Ensayos de proliferación celular por incorporación de timidina tritiada con un gradiente de concentración de los tres inhibidores del intercambio aniónico (DIDS, NFA y NPPB). Con DIDS abarcamos un rango de inhibición a unas concentraciones que van de 400 µm a 50 µm del inhibidor. El NFA de 100 a 50 µm y el NPPB al igual que el DIDS de 400 a 50 µm, pero en este caso, la inhibición máxima se produce a la mayor concentración de inhibidor, a 400 µm, produciéndose una correlación entre la inhibición de la función supresora y el gradiente de concentración del inhibidor NPPB (Figura 16). 89

110 Resultados 1.2. Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre la expresión de mrnas en los linfocitos T Incubamos esplenocitos CD4CD25 (Tefect) en presencia y ausencia de células T reguladoras con y sin DIDS (50 µm), tras 72 horas de incubación medimos la cantidad de mrna de interleucina IL2, interleucina IL10, CTLA4 y Foxp3 como medidas de activación y proliferación celular de las células T efectoras y de actividad supresora de las células T reguladoras. Podemos observar que en los esplenocitos estimulados con anticd3 (0.5 μg/ml), cuando se cocultivan con las células CD4CD25, el mrna de la interleucina IL2 desciende, siendo un reflejo de la supresión en la proliferación celular ejercida por la población Treg. Sin embargo, este descenso se revierte con la presencia en el cocultivo del inhibidor DIDS a una concentración de 50 μm. También observamos el efecto supresor de las Treg en el aumento de mrna de la interleucina IL10 en el cocultivo, que a su vez, desciende por el efecto de DIDS (50 μm) (Figura 17). Con respecto a CTLA4 y Foxp3 mrna, como era de esperar se observa un aumento de sus niveles en el cocultivo en presencia de Treg, ya que son las células Treg las que expresan mayores niveles de ambas moléculas. El inhibidor DIDS no produce descenso de sus valores (Figura 17). En conclusión, podemos decir que tras 72 h con 50 µm DIDS se restaura la activación y proliferación de las células T efectoras y la producción de IL2, en presencia de células T reguladoras CD4CD25, además de un descenso de los niveles de producción de la citocina inmunosupresora IL10. 90

111 Resultados IL2/actina IL10/actina *** * 2 CT CT T efectoras AntiCD3 T reguladoras DIDS T efectoras AntiCD3 T reguladoras DIDS CTLA4/act Foxp3/actina ns ns CT CT T efectoras AntiCD3 T reguladoras DIDS T efectoras AntiCD3 T reguladoras DIDS Figura 17. Cuantificación de mrna de IL2, IL10, Foxp3 y CTLA4 en esplenocitos (efectoras) y en células T reguladoras (CD4CD25). La medición fue realizada tras 72 horas de incubación a 37 ºC. *p<0.05; ***p< Aunque en el cocultivo no observamos diferencias en la expresión de mrna de CTLA4 y Foxp3, volvemos a medir mrna pero esta vez en las células T reguladoras incubadas durante 72h con IL2 (100 U/mL). Medimos la expresión de mrna de las interleucinas IL2 e IL10, observando un descenso de la expresión de ambas moléculas en presencia de DIDS (50 µm) (Figura 18). 91

112 Resultados IL2/actina IL10/actina * * 2 CT / CT / T reguladoras IL2 DIDS T reguladoras IL2 DIDS Figura 18. Cuantificación de mrna de IL2 e IL10 en células T reguladoras (CD4CD25). La medición fue realizada tras 72 horas de incubación a 37 ºC. *p<0.05. Estos datos nos sugieren que DIDS podría tener un efecto supresor de la activación de las células Treg aunque no se traduce en cambios de expresión de moléculas inmunosupresoras como el CTLA4 y FOXP Efecto de la inhibición de los intercambiadores de aniones cloruro sobre el flujo de entrada de calcio en los linfocitos Está descrito que los canales de calcio en membrana implicados en la activación de los linfocitos T son los CRAC (Ca 2 releaseactivated Ca 2 channel). La activación del linfocito T vía TCR conlleva el vaciado de Ca 2 en el retículo endoplasmático (RE), que a su vez induce la agregación de una proteína en la membrana del RE llamada STIM, ésta interacciona con CRAC permitiendo que entre Ca 2 al citoplasma. Posteriormente el Ca 2 podrá activar distintas funciones celulares, como la defosforilación del factor de transcripción NFAT, para su posterior translocación nuclear y la activación de la expresión génica (Figura 19). 92

113 Resultados Figura 19. Señalización del flujo de entrada de calcio en la activación celular. (Winslow et al. 2003). Se ha descrito que el potencial de membrana podría afectar a la activación de CRAC. Por este motivo, quisimos comprobar si un bloqueante de los intercambiadores de aniones cloruro, podría afectar a los canales de calcio en la membrana de los esplenocitos y detectar diferencias entre las células T efectoras y las células T reguladoras. Estudiamos de forma basal las diferencias entre células T efectoras (CD4CD25) o células T reguladoras (CD4CD25) en la entrada de calcio tras la estimulación con un mitógeno como la concanavalina A. Observamos que la afluencia de Ca 2 en las células Treg era muy inferior a la que encontrábamos en las células T efectoras tras el mismo estímulo (Figura 20). Esto nos hace pensar que las células T reguladoras presentan mecanismos de activación vía señalización de Ca 2 distintos o con diferencias al resto de los linfocitos. 93