Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial República de Colombia

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1 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 1 de OBJETIVOS Establecer una guía para la validación de métodos microbiológicos, con especial énfasis en métodos cuantitativos selectivos en los cuales el cálculo cuantitativo se basa en el recuento de partículas, ya sea directamente, con la ayuda de un microscopio, o indirectamente, sobre la base del crecimiento (multiplicación) en colonias o turbidez. Los principios y procedimientos dentro de este objeto se conocen comúnmente como el recuento de colonias, presencia/ausencia (P/A), el número más probable (NMP), y recuento directo (microscópico). 2. ALCANCE DE LA APLICACIÓN La presente guía es tomada de la ISO Water Quality - Guidance on Validation of Methods. Geneva y adoptada por el Icontec como GTC 84. Guía para la orientación acerca de la validación de métodos microbiológicos y de Política de Selección y Validación de Métodos de Ensayo OGA-GEC-016, de la oficina de Acreditación de Guatemala, 29 enero de 2007 Aunque los conceptos son básicos para la validación de un método microbiológico cuantitativo y cualitativo, cada laboratorio de ensayos para su aplicación debe realizar las adaptaciones necesarias a las matrices a validar 3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES La siguiente terminología es aplicable y práctica para ser utilizada en cualquier tipo de validación microbiológica: Exactitud de la medición: grado de correspondencia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado. Analito: cantidad particular sometida a medición Porción analítica: volumen de suspensión de partículas inoculado en una unidad detectora Coeficiente de variación: CV desviación estándar relativa para una característica no-negativa, es la proporción de la desviación estándar al promedio Detector de partículas: placa de matriz sólida o tubo de líquido que contiene un medio nutriente para el recuento o detección de partículas microbianas vivas. Límite de detección: número de partículas x (por porción analítica) donde la probabilidad p0 de un resultado negativo es igual al 5 %. Límite de determinación: concentración de partículas mínima promedio x por porción analítica, donde la incertidumbre estándar relativa esperada es igual a un valor (RSD) 18/09/2008

2 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 2 de 12 Linealidad: dependencia lineal de la señal en la concentración del analito Distribución binomial negativa: distribución estadística particular "sobre dispersa" de recuentos Precisión: grado de concordancia entre resultados de ensayo independientes bajo condiciones estipuladas. Validación primaria o validación completa: establecimiento de las especificaciones para el desempeño de un nuevo método y/o verificación experimental de que un método cumple criterios de calidad derivados teóricamente Validación secundaria: demostración, mediante experimentos, de que un método establecido funciona de acuerdo con sus especificaciones, cuando lo emplea el usuario. Repetibilidad: grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo elemento mensurado realizadas bajo las mismas condiciones de medición. Reproducibilidad: grado de concordia entre los resultados de las mediciones en el mismo elemento mensurado realizadas bajo condiciones de medición alteradas. Robustez: intensidad de un método analítico frente a pequeños cambios en procedimiento Especificidad: fracción del número total de culturas o colonias negativas asignadas correctamente en la presunta inspección. Incertidumbre estándar: incertidumbre del resultado de una medición expresada como desviación estándar 4. GENERALIDADES SOBRE VALIDACIÓN 4.1. Definición La validación significa un proceso que ofrece evidencia de que un método es capaz de servir para su propósito planeado, es decir, para detectar o cuantificar un grupo microbiano especificado con adecuada precisión y exactitud. Los métodos de recuento total no tienen un grupo objeto definible y sólo pueden validarse en relación con otros métodos o contra expectativas teóricas de precisión. La validación se clasifica como primaria o secundaria de acuerdo con su propósito Tipos de Validación Validación primaria 18/09/2008

3 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 3 de 12 La validación primaria es un proceso exploratorio con la meta de establecer los límites operacionales y características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debería originar especificaciones numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de interés (colonia positiva, tubo o placa) Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayo especialmente diseñados. Los laboratorios que desarrollan un método "en casa" o una variante de una norma existente deben realizar los pasos de validación primaria Validación secundaria La validación secundaria (también llamada verificación) tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un método desarrollado en otra parte. La validación secundaria se centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está en capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación primaria. Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo sólo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales establecidos por la validación primaria Métodos equivalentes Es necesario aplicar dos métodos en forma paralela sobre las mismas muestras al desarrollar un método en casa y también al reunir información para justificar el uso de un método alternativo. El desempeño del método consta de muchos aspectos. No existe un único ensayo de equivalencia de método, ni criterios numéricos para él. Un método puede ser superior en especificidad, pero inferior en recuperación Detectores Con frecuencia resulta conveniente denominar detector al medio nutriente en su contenedor. Se emplean dos tipos de detectores: sólidos y líquidos, en diferentes variantes de métodos microbiológicos. Además, en la mayoría de los casos, se asocian con diferentes principios de enumeración o detección: líquido con P/A y NMP, y sólido con recuentos de colonia. Todas las formas de validación en microbiología se centran en el desempeño de los detectores. El conjunto de tubos (NMP) o la serie de placas (contables) empleadas para análisis se denomina conjunto de detección o conjunto detector. Cada NMP de tubo individual es un detector P/A Comparaciones de detectores 18/09/2008

4 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 4 de 12 Para la mayoría de métodos de recuento de colonia se puede producir una contraparte líquida con la misma composición química pero con la matriz sólida (agar, filtro de membrana). El efecto del ambiente sólido puede evaluarse comparando recuentos de colonia con el cálculo NMP equivalente siempre a que la reacción para reconocimiento de objeto sea la misma en ambos tipos de detectores y el número de tubos paralelos sea lo suficientemente grande para la precisión adecuada. Además se puede evaluar la sensibilidad de los detectores de P/A mediante comparaciones de líquidos-sólidos similares Características de Desempeño Las características de desempeño deberían ser cuantificables y susceptibles de ensayo para usarse en validación. La terminología sobre características de desempeño en esta norma, en su mayor parte, sigue el uso quimiométrico. Puesto que las definiciones originales de los términos no siempre encajan con los métodos microbiológicos a la perfección, éstas han sido modificadas y adaptadas, de acuerdo con las necesidades. Las características de desempeño tratadas en esta norma se relacionan con el objeto (lista de situaciones y tipos de muestras donde el método es aplicable), la precisión, linealidad, recuperación, límites de trabajo en términos del más bajo y más alto número de colonias recomendable por placa, selectividad, especificidad y estabilidad (rugosidad) Especificaciones Las especificaciones son expresiones numéricas o cualitativas de características de desempeño o de límites de trabajo derivados de ellas. La validación primaria debe ofrecer lo siguiente: a) Identificación morfológica del (presunto) objeto b) Declaraciones con respecto a las condiciones de incubación (temperatura, tiempo, gas, atmósfera, humedad) y características de los medios (ph, estabilidad) c) Una declaración en cuanto a los límites de trabajo confiables en términos de colonia o números de placa por detector (placa, número más probable, filtro de membrana) d) Expresiones de incertidumbre dentro de límites confiables especificados e) Objeto y limitaciones 5. PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIÓN La validación casi necesariamente ocurre en pasos. Las investigaciones de desempeño real del método deberían estar precedidas por una búsqueda del intervalo de trabajo confiable en la que el desempeño del método es pertinente. Cualquier comparación de recuperación entre dos métodos debería limitarse a casos para los cuales son confiables ambos métodos Validación Primaria 18/09/2008

5 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 5 de Identificación de objeto Los estudios de cultivos puros durante el desarrollo inicial del método proporcionan la descripción básica de las colonias objeto o tubos P/A. Obviamente, se debe ensayar más de una cepa de cultivo puro del objeto. Se debe probar la validez de la descripción básica empleando el método candidato en una selección representativa de muestras naturales. Se ensayan las presuntas colonias objeto, placas o cultivos aislando los cultivos y realizando ensayos de confirmación apropiados. Las presuntas colonias noobjeto o tubos negativos se ensayan de la misma manera. Se deben calcular los valores numéricos de sensibilidad, selectividad, tasas de falsos positivos y falsos negativos y eficiencia. Se corrige la descripción del objeto, si es necesario Incertidumbre del recuento y sensibilidad al tiempo Después de que se ha definido adecuadamente la morfología del objeto, el método se emplea tentativamente sobre una colección de muestras naturales. Se estudia la confiabilidad de línea de base de los recuentos mediante recuento repetido de las colonias de las placas de muestras dentro de un corto tiempo. Si va a trabajar más de una persona en el laboratorio con el método, todos deben participar Otras características de robustez Si existen dudas acerca de los efectos de la temperatura de incubación, la humedad o la atmósfera de gas, éstas deberían estudiarse mediante ensayos especiales que involucren la incubación de submuestras paralelas bajo las condiciones alternativas Límite superior de trabajo Habiendo establecido las condiciones "ambientales" y las características del objeto, el siguiente paso es explorar las limitaciones cuantitativas del detector en cuestión. Esto puede realizarse con un único tipo de experimento: una serie finamente graduada de diluciones o volúmenes, con paralelos. El ejercicio ofrece los datos para evaluar el límite superior sobre la base de proporcionalidad y repetibilidad Precisión El laboratorio responsable de introducir un nuevo método debería también ser el responsable de ofrecer los valores iniciales de sus cálculos de precisión. Estos deberían incluir cálculos de incertidumbre de recuento y repetibilidad básica y cálculos de reproducibilidad de diferentes repeticiones (placas paralelas, series de dilución paralela, matrices). 18/09/2008

6 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 6 de 12 Otros laboratorios requieren esta información para su validación secundaria del método y subsecuentemente para establecer los sistemas de control de calidad analítico Veracidad y recuperación relativa La recuperación absoluta (veracidad) del analito microbiológico es inmensurable, lo cual representa un problema en la validación primaria de un nuevo método Validación Secundaria Se deben obtener numerosas muestras naturales. Las muestras divididas o series de dilución duplicadas se estudian con estriado paralelo. Se practica el recuento duplicado con el fin de verificar el desempeño de recuento esperado. Se debe aislar y verificar numerosos presuntos positivos (por lo menos 100). Las características de desempeño categóricas se calculan y comparan con los valores especificados, si se encuentran disponibles. 6. ESQUEMA DE UNA VALIDACIÓN 6.1. Caso 1 - Método Normalizado El laboratorio que va a utilizar un método normalizado debe verificarlo contra sus especificaciones de validación, atendiendo los requisitos para el aseguramiento de la calidad, y no necesita validarlo. Esta verificación permite demostrar que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente (el uso corresponde al propósito para el que fue desarrollado, con respecto a la propiedad medida, matriz, rango, equipos utilizados, repetibilidad, etc.). En la mayoría de los casos se puede considerar que en el desarrollo de los métodos normalizados se han tenido en cuenta todos los aspectos necesarios relativos a la validación. Al presentarse el caso de no haber evidencia suficiente para deducir que se ha llevado a cabo una correcta validación, el laboratorio usuario deberá definir un procedimiento para calcular y evaluar los parámetros de desempeño que considere necesarios para asegurar la confiabilidad del método Caso 2 - Método No Normalizado: El laboratorio que va a modificar un método normalizado debe revalidarlo para demostrar que las especificaciones del método original no se ven afectadas por la modificación introducida. El nivel de revalidación requerido aumenta conforme la magnitud de los cambios realizados. Se consideran cambios menores, por ejemplo, la modificación del tamaño de la muestra y sustitución de reactivos. 18/09/2008

7 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 7 de 12 Se considera cambio mayor, por ejemplo, el cambio de procedimiento o equipo y cambios en el alcance (aplicación a matrices que no se especifican). Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismas especificaciones que el método original, se deben realizar comparaciones utilizando réplicas. El diseño experimental y el análisis de los resultados deben ser estadísticamente válidos. El laboratorio usuario de un método normalizado modificado debe verificarlo contra sus especificaciones originales, o de revalidación, y así demostrar que domina el ensayo y lo utiliza correctamente. En el caso de métodos no normalizados, los terceros que los desarrollan son responsables de incluir en dicho proceso la etapa de validación, para demostrar que el método cumple con los criterios de aceptación adecuados para el propósito de aplicación; el laboratorio usuario debe verificar el desempeño del método contra sus especificaciones de validación y así demostrar que domina el ensayo y lo realiza correctamente Caso 3 - Método desarrollado por el laboratorio: El laboratorio que desarrolla y utiliza sus propios métodos debe validarlos, para demostrar que cumplen con los criterios de aceptación adecuados para el propósito de aplicación. Una vez está en uso el método, el laboratorio debe verificar su desempeño contra los parámetros de validación, para demostrar que sigue dominando el ensayo y lo realiza correctamente Revisión de los métodos de ensayo incluidos en el alcance Como parte de la revisión se debe incluir, pero no circunscribirse a, lo indicado a continuación: Para confirmar que el método se ajusta al uso previsto en el laboratorio es necesario determinar su desempeño (verificar) conforme una o una combinación de las siguientes técnicas, según lo establecido en la nota NTC/ISO/IEC 17025, adoptada como un criterio de acreditación para laboratorios de ensayo y calibración: La calibración utilizando patrones de referencia o materiales de referencia La comparación con resultados obtenidos por otros métodos Las comparaciones interlaboratorios La evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado La evaluación de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento científico de los principios teóricos del método y en la experiencia práctica. Aún cuando se haya realizado la validación del método, el laboratorio tendrá que verificar periódicamente que se cumplen los parámetros de desempeño documentados por parte de la organización que lo desarrolló, modificó y/o publicó. Para esta verificación el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más representativas. También tiene que tomar en cuenta los 18/09/2008

8 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 8 de 12 resultados obtenidos de las auditorías internas y externas de sus sistemas de gestión, dejando registro de las verificaciones. La documentación de la modificación, actualización, validación y verificación del método debe incluir registros de la determinación de los parámetros de desempeño, limitaciones de su aplicabilidad, procedimientos para control de calidad, calibración y control de documentos. Estos registros deben estar disponibles a solicitud de los miembros del equipo evaluador durante las visitas en sitio, ya sea de evaluación para la acreditación, seguimiento o reevaluación. Los procedimientos y responsabilidades para el desarrollo, validación, verificación e implementación de los métodos deben ser descritos en detalle dentro de la documentación del sistema de calidad del laboratorio. Los diagramas de flujo son una herramienta para describir el procedimiento; para métodos complejos también se pueden utilizar programas informáticos de gestión de procesos. El personal responsable debe dejar establecidos los requisitos mínimos de calidad antes de empezar el proceso de validación e implementación del método, o mejor aún establecerlos antes de comenzar todo el proceso de desarrollo Validación de análisis microbiológicos De acuerdo con ENAC los métodos de análisis microbiológicos cualitativos y cuantitativos deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, los parámetros de desempeño que se indican en el cuadro siguiente, utilizando métodos estadísticos apropiados. Propósito del Ensayo/ Análisis Cuantitativo Análisis Cualitativo Parámetros del Método Exactitud relativa + + Repetibilidad + + Reproducibilidad + + Sensibilidad No se valida + Desviación positiva + + Desviación negativa + + Especificidad + + Límite de detección + No se valida Límite de cuantificación No se valida + Efecto matricial + + NOTA: (-) Significa que este parámetro normalmente no se evalúa. (+) Significa que este parámetro normalmente se evalúa Para las pruebas rápidas Para los análisis cualitativos que detectan metabolitos, drogas, microorganismos, hormonas y otros, en fluidos corporales, aguas, alimentos, etc., por medio de pruebas rápidas (tales como ensayos inmunocromatográficos tipo cassette, aglutinación, etc.), se debe aplicar los mismos criterios de validación que los especificados en las pruebas convencionales. 18/09/2008

9 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 9 de 12 Para la verificación del desempeño del método en uso, como mínimo se debe determinar la sensibilidad (límite de detección), especificidad (detección inequívoca) y los otros parámetros de desempeño declarados por el fabricante de la prueba y los requeridos por las normas. Es importante mencionar que entre las pruebas rápidas, algunas son empleadas exclusivamente para tamizaje o discriminación, por lo que los resultados positivos requieren de un análisis confirmatorio posterior, cuyo principio metodológico sea diferente Para los análisis automatizados En el caso de utilizar pruebas normalizadas o validadas por el fabricante del equipo automatizado, el laboratorio deberá proceder a una verificación de la metodología. El laboratorio que emplee equipo automatizado deberá comprobar la calibración del mismo al momento de su instalación y que ésta cumpla con los requerimientos de la casa comercial. Así mismo, periódicamente deben emplearse controles comerciales (negativos y positivos) y correrlos como muestras en la rutina del laboratorio; adicionalmente debe comprobarse que los resultados de los controles analizados se encuentren dentro del rango permisible para el análisis, con el objeto de verificar el buen funcionamiento del equipo. Como parte de la verificación continua del desempeño de los métodos analíticos automatizados, es especialmente recomendable que el laboratorio participe en programas de comparación entre laboratorios. Según los criterios internacionalmente vigentes para el aseguramiento de la calidad de los resultados de los laboratorios analíticos planteados por ICH (Chan et al), la validación de un método que usa equipo automatizado requiere cualificar el sistema de hardware y software correspondiente y así establecer su capacidad y confiabilidad de funcionamiento bajo las condiciones adecuadas de uso. La cualificación del sistema se simplifica si los fabricantes y proveedores de los equipos cumplen con la norma ISO 9001; el proceso de cualificación debe abarcar las etapas de instalación, operación y desempeño del sistema. El laboratorio debe contar con un procedimiento documentado de cualificación que contenga, entre otros componentes, las pruebas a realizar, los correspondientes criterios de aceptación y los formatos para el registro de datos y resultados. La cualificación de instalación permite establecer si el sistema recibido cumple con las especificaciones de fabricación y fue debidamente instalado. La cualificación de operación permite establecer si, al quedar instalado el sistema integrado, o sus módulos, están funcionando de acuerdo con las especificaciones operacionales del caso; se lleva a cabo haciendo pruebas con analitos en muestras específicas para ello. Y, por último, la cualificación de desempeño permite demostrar si el sistema cumple con los requisitos definidos acorde a las necesidades del usuario; ésta se puede llevar a cabo corriendo las aplicaciones analíticas de particular interés para el usuario. 18/09/2008

10 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 10 de DIAGRAMA DE UNA VALIDACIÓN 18/09/2008

11 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 11 de 12 18/09/2008

12 Código: XXXXXX 18/09/2008 Versión: 01 Página 12 de BIBLIOGRAFÍA APHA/AWWA/WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20th Edition. American Public Health Association, American Waterworks Association, Water Environment Federation. USA Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y. C., Zhang, X.M. (Eds.). Analytical Method Validation and Instrumentation Performance Verification. Wiley-Interscience. USA CITAC/EURACHEM. Guide to Quality in Analytical Chemistry. An Aid to Accreditation ENAC. CGA-ENAC-LEC:2001 Criterios generales para la acreditación de laboratorios de ensayo y calibración. ENAC. G-ENAC-04:2002 Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos. EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Web Edition EURACHEM/CITAC. Traceability in Chemical Measurement, A guide to achieving comparable results in chemical measurement Garfield, F. M. Principios de Garantía de Calidad para Laboratorios Analíticos. AOAC Internacional. EUA, ICH. Harmonised Tripartite Guideline Q2A Text on Validation of Analytical Procedures. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use ICH. Harmonised Tripartite Guideline Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use ILAC. ILAC-G18:2002 The Scope of Accreditation and Consideration of Methods and Criteria for the Assessments of the Scope in Testing. ISO. Standard ISO/TR 13843:2000 Water quality Guidance on Validation of Microbiological Methods. GTC 84. CALIDAD DEL AGUA. GUÍA PARA LA ORIENTACIÓN ACERCA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 18/09/2008