Validación de Métodos Analíticos
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- Ángel del Río Contreras
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1 Validación de Métodos Analíticos Nilka M.G. de Solís, M.Phil. Validación y Desarrollo de Métodos Instituto Especializado de Análisis 2125 Nov 25 ICSUNIDO 1 Validación Según la norma ISO 842:1994, validación es: Confirmación por examinación y provisión de evidencia objetiva que los requerimientos particulares para un uso específico se cumplen 2125 Nov 25 ICSUNIDO 2 1
2 Por qué Validar? Virtualmente, casi todos los aspectos en la sociedad están fundamentados en mediciones analíticas Nov 25 ICSUNIDO 3 Qué requiere la Validación? Instrumentos calificados y calibrados. Métodos documentados. Estándares de Referencia confiables. Analistas calificados. Integridad de la muestra Nov 25 ICSUNIDO 4 2
3 Calificación del Instrumento Fabricante, modelo y manuales. Modificaciones. Instalación y calificación operativa. Programas de calibración. Programas de mantenimiento Nov 25 ICSUNIDO 5 Equipos para Análisis Balanzas UltravioletaVisible Cromatógrafo Líquido phmetros Cromatógrafos de Gas 2125 Nov 25 ICSUNIDO 6 3
4 Balanzas La balanza es un equipo fundamental en todo laboratorio. Calibración. Fluctuación Nov 25 ICSUNIDO 7 Balanzas Asegúrese que la balanza está encendida y que la burbuja del nivel está en el centro del indicador. La primera persona que utilice la balanza cada día, debe anotar el peso del pesopatrón en la bitácora de la misma para comparar con datos previos. Si ocurre una desviación mayor que la indicada la balanza debe ser reportada Nov 25 ICSUNIDO 8 4
5 UltravioletaVisible Calibración con: Dicromato de Potasio Luz Reflejada Resolución Precisión de la Longitud de Onda (Vidrio de Holmio) 2125 Nov 25 ICSUNIDO 9 Calibración con K 2 Cr 2 O 7 Las soluciones de dicromato de potasio son utilizadas para calibrar la escala fotométrica del equipo y es otro paso importante para determinar el buen funcionamiento del mismo. Solución Madre: K 2 Cr 2 O 7 al.2% en H 2 SO 4.5N Soluciones a preparar:.2,.6 y.1% 2125 Nov 25 ICSUNIDO 1 5
6 Calibración con K 2 Cr 2 O 7 Procedimiento: Determinar las absorbancias de cada una de las diferentes concentraciones a las siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313 y 35nm. Grafique los datos obtenidos y calcule el A 1% 1cm para determinar si coincide con los valores teóricos. Calcule también la Absortividad 2125 Nov 25 ICSUNIDO 11 Calibración con K 2 Cr 2 O 7 Control de Absorbancias 4Abr5 Absorbancia λ y = 144.3x. y = 124.1x y = 16.8x y = 48.4x Concentración (%) Abs 235 Abs 257 Abs 313 Abs 35 Lineal (Abs 257) Lineal (Abs 235) Lineal (Abs 35) Lineal (Abs 313) A 1% 1cm ε Nov 25 ICSUNIDO 12 6
7 Vidrio de Holmio Ho, es un metal perteneciente a las tierras raras en la tabla periódica. El filtro de óxido de Holmio provee discretas y exactas bandas de absorción que son útiles para revisar la precisión de los espectrofotómetros. Las bandas ayudan a detectar la luz visible reflejada y determinar la resolución Nov 25 ICSUNIDO 13 Vidrio de Holmio El uso del filtro para obtener un registro, es recomendado una vez instalado, durante la operación y, durante tiempos posteriores. Esta práctica permite la comparación de las características de operación del instrumento, cuando se sabe que está en buenas condiciones. Revisiones ocasionales de los registros ayudarán a detectar cualquier deterioro en el funcionamiento del instrumento Nov 25 ICSUNIDO 14 7
8 Precisión de la Longitud de Onda λ teórica ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Nov 25 ICSUNIDO 15 Cromatógrafo Líquido Equipo indispensable para la cuantificación de los componentes de una muestra. Calibración inicial. Revisiones programadas. Bitácoras Nov 25 ICSUNIDO 16 8
9 phmetros El ph se define como el valor dado por una unidad adecuada, apropiadamente estandarizada capaz de reproducir valores de.2 unidades, utilizando un electrodo indicador sensible al ión hidrógeno (electrodo de vidrio) y un electrodo de referencia Nov 25 ICSUNIDO 17 Disolución Equipo para determinar in vitro la biodisponibilidad de una formulación. El tamaño de los ejes de paleta y canasta está especificados en la farmacopea. Las distancias de los ejes al fondo del vaso también están especificadas Nov 25 ICSUNIDO 18 9
10 Disolución Para asegurar que el equipo de disolución está trabajando óptimamente se debe realizar una prueba de adecuación del sistema Nov 25 ICSUNIDO 19 Disolución Una vez calibrado el equipo, no debe moverse del lugar en que está Nov 25 ICSUNIDO 2 1
11 Absorción Atómica 2125 Nov 25 ICSUNIDO 21 Cromatografía de Gas 2125 Nov 25 ICSUNIDO 22 11
12 Metodología de Validación de Pruebas La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) es nuestro principal libro de consulta. Procedimientos analíticos para determinar los niveles de calidad de los productos farmacéuticos. Éstos deben reunir ciertos estándares de precisión y veracidad Nov 25 ICSUNIDO 23 Metodología de Validación de Pruebas Los usuarios de los métodos farmacopéicos no requieren la validación de la precisión y veracidad. Los métodos farmacopéicos sólo requieren verificación de son adecuados en las condiciones de uso (Suitability Tests) Nov 25 ICSUNIDO 24 12
13 Adecuación del Sistema Detección de Ibuprofén en tabletas: Resolución Platos teóricos Coleo RSD 2125 Nov 25 ICSUNIDO 25 Adecuación del Sistema mau 7 Detección de Clindamicina fosfato en tabletas: Resolución Platos teóricos Coleo RSD VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\6451.D) Clindamicina fosfato min 2125 Nov 25 ICSUNIDO 26 13
14 concentration: ug/ml Adecuación del Sistema Amoxicilina patrón before test retention Theoretical Peak Injection peak area time Plates Tailing average : 1831 average : average : 4126 average : stdev: 6 stdev:.2 stdev: 3 stdev:.7 RSD %:.33 RSD %:.34 RSD %:.7 RSD %:.47 summary: The relative standard deviation of the Standard Preparation was.33% (required: not more than 2.%) Peak tailing of the Standard Preparation was (required: not more than 2.5) Theoretical plates of the Standard Preparation was 4126 (required: not less than 17) 2125 Nov 25 ICSUNIDO 27 Validación La validación de un método analítico es el proceso por medio del cual se establece, por estudios de laboratorio, que las características del mismo cumplen con los requerimientos para los que se propone la aplicación Nov 25 ICSUNIDO 28 14
15 Validación Validar un método requiere la determinación de los siguientes puntos: Exactitud Precisión Especificidad Límite de Detección Límite de Cuantificación Linearidad y Rango Reproducibilidad (Ruggedness) Robustez 2125 Nov 25 ICSUNIDO 29 Validación Diferentes tipos de Pruebas Analíticas. Categoría I: Cuantificación de componente mayoritario. Categoría II: Detección y cuantificación de impurezas. Categoría III: Determinación de desempeño. Categoría IV: Identificación Nov 25 ICSUNIDO 3 15
16 Parámetros necesarios para Validación de Ensayos PARAMETRO I II cuant. II límite III IV Exactitud Precisión Especificidad X X X X X X * X X X Límite de Detección X Límite de Cuantificación X Linearidad Rango X X X X * 2125 Nov 25 ICSUNIDO 31 Exactitud Definición: La exactitud de un método analítico es la cercanía de los resultados obtenidos por el método al valor real. Determinación: Se lleva a cabo utilizando un patrón de pureza conocida o, comparando los resultados del método con aquellos de otro bien caracterizado, cuya exactitud esté definida o, añadiendo cantidades del analito a una mezcla sintética del producto Nov 25 ICSUNIDO 32 16
17 Exactitud VWD1 A, Wavelength=22 nm (NDES\USPIBU1.D) Norm Muestra de Levonorgestrel e Ibuprofén Levonorgestrel Área: Ibuprofén Área: mi 2125 Nov 25 ICSUNIDO 33 Exactitud C1 = Concentración determinada en la muestra fortificada. C2 = Concentración determinada en la muestra no fortificada. C3 = Concentración utilizada para fortificar. Recuperación(%) = ( C C2) / C3 1 x Nov 25 ICSUNIDO 34 17
18 Precisión Definición: Es el grado de congruencia entre resultados de pruebas individuales cuando el método es aplicado repetidamente a muestreos múltiples de una muestra homogénea. Se puede medir por el grado de reproducibilidad o repetibilidad del método analítico. Determinación: Es necesario ensayar un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea (al menos 9) Nov 25 ICSUNIDO 35 Reproducibilidad Definición: Es el grado de congruencia de los resultados obtenidos del análisis de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones (diferentes laboratorios, diferentes lotes de reactivos, diferentes temperaturas de ensayo, diferentes analistas, diferentes días, etc.) 2125 Nov 25 ICSUNIDO 36 18
19 Precisión VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\33B1424.D) mau VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\33B1425.D) mau VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\33B1426.D) 1 mau min VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\33B1427.D) mau VWD1 A, Wavelength=21 2 nm (NDES\33B1428.D) Candesartán cilexetilo 6.33 Candesartán cilexetilo Candesartán cilexetilo min min mau VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\33B1429.D) 125 mau min Candesartán cilexetilo Candesartán cilexetilo Candesartán cilexetilo min min 2125 Nov 25 ICSUNIDO 37 Precisión: valor real 14.6 Réplica analista 1 Analista 2 Analista Promedios s V Repetibilidad.11 Promedio de Promedios Sesgo.57 Reproducibilidad (s) Nov 25 ICSUNIDO 38 19
20 Relación entre Exactitud y Precisión Inaccurate & imprecise Inaccurate but precise Accurate but imprecise Exacto y Preciso 2125 Nov 25 ICSUNIDO 39 Especificidad Definición: Es la habilidad de determinar sin ninguna equivocación, al analito, en presencia de otros componentes que se espera estén presentes, tales como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz Nov 25 ICSUNIDO 4 2
21 Perfil de Anamú Especificidad Detector A19 nm Anamu 2 anamu11 Retention Time 36,5 2 mau 11, 12, 13,7 14,8 17,5 24,5 38,9 41,9 48,2 49,7 mau 2 31,1 33, Minutes Perfil de Anamú mau ,9 4,6 5,6 6,9 Detector A19 nm Anamu anamu12 Retention Time 9,1 11,5 13,3 14,1 15,3 17,8 19,3 21,3 22,6 25,1 24,1 26,2 33,9 29,8 31,4 32,7 36,8 39,1 4,5 42, 44,9 44,2 46,4 48,1 49,7 51,5 53, 55, mau Minutes 2125 Nov 25 ICSUNIDO 41 Límite de Detección Definición: Es la cantidad más baja de analito en una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada (2:1 ó 3:1). Determinación: Análisis de muestras con concentraciones conocidas del analito, para establecer el mínimo nivel al cual éste puede ser verazmente detectado Nov 25 ICSUNIDO 42 21
22 Límite de Cuantificación Definición: Es característico de los ensayos cuantitativos para compuestos de bajos niveles en matrices de muestras, tales como impurezas y productos de degradación. Es la cantidad más baja de analito que puede ser determinada con precisión aceptable (1:1) Nov 25 ICSUNIDO 43 Límites de Detección y Cuantificación Límite de Detección Límite de Cuantificación Razón Señal/Ruido Pico B LOQ Pico A LOD Línea Base Ruido 2125 Nov 25 ICSUNIDO 44 22
23 Límite de Detección Réplicas Conc % positivos Resultados / / / / / /1 Límite de Detección % datos positivos Conc. (mcg/ml) 2125 Nov 25 ICSUNIDO 45 Linearidad y Rango Linearidad: Es la habilidad para producir resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en muestras dentro de un rango dado. Rango: Es el intervalo entre los niveles inferior y superior del analito, que han demostrado pueden ser determinados con un apropiado nivel de precisión Nov 25 ICSUNIDO 46 23
24 Curva de RingbomMétodo UV 294 nmmoxifloxacino HCl Solvente: água 1 %T log concentração (µg/ml) Nov 25 ICSUNIDO 47 Linearidad y Rango Fusafungina 1, VWD1 A Area = *Amt Area Rel. Res%(2): Cuantificación de Fusafungina en inhaladores: El rango lineal está entre los 2 y 45ppm. Correlation: Amount[mg/vial] 2125 Nov 25 ICSUNIDO 48 24
25 Linearidad y Rango Area Candesartán cilexetilo, VWD1 A Area = *Amt Rel. Res%(3): Rango lineal para el Candesartán cilexetilo: 3 a 18ppm Correlation: Amount[% disuelto] 2125 Nov 25 ICSUNIDO 49 Robustez Definición: Es la medida de la capacidad para no ser afectado por pequeñas, pero deliberadas variaciones en los parámetros del método, lo cual provee una indicadión de su veracidad durante el uso cotidiano Nov 25 ICSUNIDO 5 25
26 Robustez VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\631.D) Norm mau VWD1 A, Wavelength=21 nm (NDES\33B1424.D) m Candesartán cilexetilo VWD1 A, Wavelength=22 nm (NDES\63B14.D) mau Fusafungina m Fusafungina Fusafungina Fusafungina mi 2125 Nov 25 ICSUNIDO 51 Robustez Se puede hacer de dos maneras: Variando una a una las variables o factores que se consideran sospechosos (estudio incompleto). Realizando variaciones sistemáticas para determinar cómo varía el resultado del ensayo (estudio completo) Nov 25 ICSUNIDO 52 26
27 Determinación de ph con electrodos de vidrio: A, temperatura A: 3º A: 25º B, agitación B: No B: Si C, dilución de la solución C: N C: Si 2125 Nov 25 ICSUNIDO 53 Diseño de PlackettBurman No. A B C Factor D E F G Resultado Ensayo Promedio Nov 25 ICSUNIDO 54 27
28 ( ) = A A Efecto A = Robustez Si realizamos la estimación del efecto del factor A ( ) = A A Efecto A = Nov 25 ICSUNIDO 55 ReValidación La Farmacopea establece que se debe hacer una revalidación si: Existe un cambio en la composición del producto farmacéutico. Se realiza un cambio en la síntesis de un principio activo. Cuando hay cambios en el procedimiento analítico Nov 25 ICSUNIDO 56 28
29 Bibliografía USP 28 Artículo <1225> Validation of Compendial Methods, 25. Validación de Métodos para Análisis Químico, Celia Puglisi y Fernando Kornblit, Buenos Aires, Marzo, 25. Manual de Calibración de la Instrumentación Analítica, Laboratorio de Disolución, I.E.A Nov 25 ICSUNIDO 57 Bibliografía Supplementary Training Modules on Good Manufacturing Practice. Validation Part 4: QC Related Validation, WHOEDM, 1/22. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Eurachem, Teddington Ltd., Nov 25 ICSUNIDO 58 29
30 A Todos los Presentes Gracias por su atención! 2125 Nov 25 ICSUNIDO 59 3
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