MÉTODO Y DISPOSITIVO PARA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS BASADO EN CRIOCONCENTRACIÓN

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1 Clave: IBQ34JOS MÉTODO Y DISPOSITIVO PARA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS BASADO EN CRIOCONCENTRACIÓN José Juan, Virgen-Ortíz 1 ; Vrani, Ibarra-Junquera 1 ; Juan Alberto, Osuna-Castro 2 ; Pilar, Escalante-Minakata 3 ; Norma Alejandra, Mancilla-Margalli 4 ; José de Jesús, Ornelas-Paz 5. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES 1 Fac. Cs. Quím., 2 Lab. Biotecnología, 3 Lab. Bioingeniería Ambiental, Universidad de Colima. Km 9, Carretera Colima Coquimatlán, Col., México. 4 Div. de Estudios de Posgrado e Inv. Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jal., México. 5 CIAD, Unidad Cuauhtémoc. Chihuahua, México. CORREO ELECTRÓNICO vij@ucol.mx

2 INTRODUCCIÓN XVIII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica Cada vez más laboratorios en el mundo estudian la producción, a escala laboratorio, de macromoléculas bioactivas de alto valor comercial y/o biotecnológico en biorreactores. Entre las biomoléculas más estudiadas están los anticuerpos, enzimas y otras proteínas, cuya producción in vitro implica normalmente el empleo de microorganismos recombinantes que secretan estas macromoléculas al medio de cultivo (Cereghino y Cregg, 1999). La técnica más popular que se utiliza para concentrar y separar las moléculas de interés del medio de cultivo es la ultrafiltración por concentradores de membrana selectiva con diferente corte de peso molecular (Song et al., 2010). Sin embargo, esta técnica puede ser muy lenta e implicar mucho trabajo, además costosa por el tipo de membrana que utiliza y los problemas típicos de obturación o rotura de la misma, que se traducen en una corta vida útil de la membrana. También se utiliza la separación de las proteínas por precipitación con sulfato de amonio, resuspensión y diálisis (Scopes, 1998); con la desventaja de requerir hasta 80% de saturación con la sal, siendo un método costoso cuando se trata de una aplicación práctica, además puede afectar negativamente la actividad y funcionalidad de las biomoléculas. Por otra parte, la crioconcentración es una tecnología emergente utilizada para concentrar jugos de fruta, lactosuero, extractos de café y vino, entre otros (Aider y de Halleux, 2009). Esta técnica presenta gran interés debido a que la baja temperatura de procesamiento previene cambios químicos y bioquímicos indeseables (Raventós et al., 2007). Esta operación permite la separación del agua de la solución al congelarla lentamente (- 10 C) lo que propicia la formación de una red de cristales grandes de hielo de alta pureza y al eluir fuera de matriz de hielo la solución concentrada, permite obtener un líquido con una alta concentración de proteínas, enzimas, azúcares y/o macromoléculas de interés. La crioconcentración por congeladodescongelado es la más económica y fácil de aplicar, se usan de tres a cuatro ciclos para llegar a la concentración óptima (Nakagawa et al., 2010). El descongelado se efectúa a temperatura ambiente y por gravedad. OBJETIVOS En este trabajo se desarrolló un procedimiento y dispositivo, a nivel laboratorio, para concentrar soluciones acuosas de biomoléculas. El método de concentración se basa en la crioconcentración por la técnica congelado-descongelado, con nuestra variante novedosa de remover la solución concentrada de la matriz de hielo por centrifugación MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron reactivos de grado analítico adquiridos de Sigma-Aldrich, estándares

3 de carbohidratos de Fluka. Los reactivos, marcadores y materiales para SDS-PAGE y western-blot fueron de Bio-Rad. Para las pruebas de crioconcentración se utilizó suero de leche (obtenido por coagulación ácida), solución diluida de pectinasa comercial (Macerex PM; Enmex; Mexico) y, sobrenadante resultante de la expresión recombinante de la enzima 1-FFT (E.C ) producida por Pichia pastoris en biorreactor tipo lote. Se desarrolló e implementó el dispositivo de la Fig. 1 para concentrar soluciones acuosas por diálisis-congelacióncentrifugación. Se utilizó suero de leche como solución de proteínas modelo para las pruebas de crioconcentración. 20 ml Cargar la muestra Congelar a -10 C durante 8 h DESARROLLO Se optimizaron las condiciones de centrifugación para la elución y recuperación de solutos de la matriz de hielo. La temperatura y velocidad de centrifugación fueron las variables independientes, mientras que la concentración de proteínas fue la variable de repuesta. Las proteínas se cuantificaron por el método de Bradford (1976). Las condiciones óptimas se aplicaron en la concentración del sobrenadante resultante de la expresión heteróloga de la enzima 1-FFT producida en biorreactor tipo lote. La enzima 1-FFT producida y concentrada se detectó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 12 % de acuerdo al método Laemmli (1970); además, se identificó por western blot (Villanueva, 2008). La actividad de la 1- FFT se evaluó utilizando 1-kestosa como sustrato y se identificó por cromatografía en capa fina (TLC) de acuerdo al procedimiento reportado por Mancilla- Margalli y López (2006). Centrifugar 6000 rpm, 20 min, 4 C Figura 1: Dispositivo para la crioconcentración. Este dispositivo se desarrolló y utilizó para crioconcentrar soluciones acuosas de biomoléculas a escala laboratorio (20 ml). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se desarrolló un procedimiento de concentración de biomoléculas basado en crioconcentración que comprende 1) dializar la solución a concentrar, 2) congelar la muestra a -10 C durante 8 h, y 3) centrifugar la muestra congelada para

4 recuperar la fase crioconcentrada. Esto se muestra en la Figura 1. Se optimizó el proceso de elución por centrifugación para la separación de la solución concentrada. Para esto se utilizó suero de leche como solución modelo de estudio. Los datos experimentales se ajustaron al modelo no lineal que se representa gráficamente en la Figura 2; utilizando un análisis ANOVA (p < 0.05) se determinó como mejor condición de centrifugación: 6000 rpm, 4 C, 20 min, para maximizar la concentración y recuperación de las proteínas estudiadas. 100 Se estudió el efecto del tiempo empleado en dializar la solución de proteínas sobre el factor de concentración logrado (veces que se concentra la solución original) y también, su influencia en la eficiencia de recuperación de las proteínas; en la Figura 3 se muestra este comportamiento, como se puede apreciar la diálisis incrementa el factor de concentración de proteínas logrado por crioconcentración. Un tiempo largo de diálisis (8 h, por ejemplo) baja la eficiencia en la recuperación de proteínas. 25 P ro te in a s (m g /m L ) C Eficiencia (%) Factor de concentración Velocidad de centrifugación (rpm) 6000 Figura 2: Optimización de la centrifugación. Efecto de la temperatura ( C) y velocidad de centrifugación (rpm), en la concentración de proteínas eluídas (mg/ml). Se muestra la representación gráfica de una función polinomial ajustada a los datos experimentales (puntos azules) usando MatLab (coeficiente de determinación R 2 = ) Temperatura ( C) Tiempo de diálisis (h) Figura 3: Optimización del tiempo de diálisis. Efecto del tiempo empleado para la diálisis previa al proceso de crioconcentración. Las líneas negras corresponden a la solución de una pectinasa comercial; mientras que las líneas azules representan al sobrenadante con la 1-FFT recombinante. Las marcas corresponden al valor experimental con su desviación estándar. La diálisis fue contra agua destilada (1:100; muestra:agua) con membrana de 12 kda (corte de peso molecular).

5 La figura 4 muestra un análisis ANOVA donde se demuestra que el uso de una diálisis rápida (menor de 2 h) no afecta significativamente (p > 0.05) la eficiencia en la recuperación de proteínas. Por lo anterior se determinó la conveniencia de efectuar una diálisis rápida (2 h) previa a la crioconcentración de la solución de biomoléculas que nos interese concentrar. Tiempo de diálisis (h) Eficiencia (%) Figura 4: Optimización del tiempo de diálisis. Análisis ANOVA del tiempo de diálisis (0, 1 y 2 h) previa a la crioconcentración contra la eficiencia en la recuperación de proteínas. Se concentraron soluciones de suero de leche, solución diluida de pectinasa comercial y, sobrenadante del medio de cultivo conteniendo la enzima recombinante 1-FFT producida por la levadura P. pastoris en biorreactor tipo lote. En la Tabla I se muestra el nivel de concentración en proteínas logrado sin realizar una diálisis previa a la crioconcentración y, también el nivel de concentración alcanzado cuando se dializaron las soluciones de las biomoléculas estudiadas. El sobrenadante del medio de cultivo que contenía la enzima recombinante 1-FFT, se concentró independientemente por ultrafiltración (corte de 9 kda) y por diálisis-congelación-centrifugación. Esto con la finalidad de comparar la funcionalidad del método propuesto con la ultrafiltración. En la Figura 5(a) se muestra el patrón electroforético determinado por SDS-PAGE para el concentrado obtenido por ultrafiltración (carril 1) y para el crioconcentrado (carril 2 y 3); en el carril M están las proteínas utilizadas como marcadores de peso molecular. La enzima de interés (1-FFT) pesa alrededor de 75 kda. Como se puede apreciar en dicha imagen, el patrón electroforético es similar en ambos concentrados. La figura 5(b) muestra la identificación inmunoquímica de la 1- FFT determinada por western blot para ambos concentrados. El análisis de actividad enzimática de la 1-FFT se verificó por cromatografía en capa fina (TLC). La actividad de la 1-FFT se refiere a la transferencia de un residuo fructosil de una molécula de 1-kestosa (DP3) a otra molécula de 1-kestosa para formar

6 Tabla I. Concentración de proteínas de algunas soluciones estudiadas. Solución de proteínas Proteínas (mg/ml) Original Crioconcentrada Dialisada y crioconcentrada Suero de leche ± ± ± Pectinasa comercial ± ± ± FFT recombinante ± ± ± nistosa (DP4) (Fujishima et al., 2005). En la figura 5(c) se muestra que la actividad enzimática de la 1-FFT es similar en ambos concentrados. Los carriles 2 y 3 corresponden al concentrado obtenido por kda a) M FFT b) ultrafiltración y, los carriles 4 y 5 corresponden al concentrado enzimático obtenido por crioconcentración; el carril S corresponde a los estándares de carbohidratos con diferente grado de polimerización (DP). M DP1 DP2 DP3 DP4 DP5 c) S Figura 5. Identificación y actividad de la 1-FFT recombinante. a) Se muestra el perfil de proteínas por SDS-PAGE del sobrenadante de expresión concentrado por ultrafiltración (carril 1) o por crioconcentración (carril 2 y 3); carril M corresponde al marcador de peso molecular de referencia. b) Análisis por western blot. c) Análisis de la actividad enzimática de la 1-FFT por TLC, el carril S corresponde a estándares de carbohidratos de diferente grado de polimerización (DP), DP1: glucosa, DP2: sacarosa, DP3: 1-kestosa, DP4: nistosa, DP5: 1-fructosil nistosa; el carril 1es el blanco: mezcla de reacción sin la enzima; carriles 2 y 3: actividad de la 1-FFT concentrada por ultrafiltración; carriles 4 y 5: actividad de la 1-FFT crioconcentrada.

7 CONCLUSIONES Se desarrolló un dispositivo sencillo, económico y eficiente para concentrar biomoléculas, como proteínas, basado en un procedimiento de diálisiscongelación centrifugación. Además se preservó la actividad de las biomoléculas crioconcentradas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Aider, M.; and de Halleux, D. (2009): Cryoconcentration technology in the bio-food industry: principles and applications. LWT-Food Science and Technology, 42(3), Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, Cereghino, P.L.; and Cregg, J.M. (1999): Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis, Current Opinion in Biotechnology, 10(5), Fujishima, M.; Sakai, H.; Ueno, K.; Takahashi, N.; Onodera, S.; Benkeblia, N.; y Shiomi, N. (2005): Purification and characterization of a fructosyltransferase from onion bulbs and its key role in the synthesis of fructooligosaccharides in vivo. New Phytology, 165(2), Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, Mancilla-Margalli, N.A.; y López, M.G. (2006): Water-soluble carbohydrates and fructan structure patterns from Agave and Dasylirion species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(20), Nakagawa, K.; Maebashi, S.; and Maeda, K. (2010): Freeze-thawing as a path to concentrate aqueous solution. Separation and Purification Technology, 73(3), Raventós, M.; Hernández, E.; Auleda, J. M.; and Ibarz, A. (2007): Concentration of aqueous sugar solutions in a multi-plate cryoconcentrator, Journal of Food Engineering, 79(2), Scopes, R. (1998): Protein purification: principles and practice. New York: Springer-Verlag. 10. Song, W.; Su, Y.; Chen, X.; Ding, L.; and Wan, Y. (2010): Rapid concentration of protein solution by a crossflow electro-ultrafiltration process. Separation and Purification Technology, 73(2), Villanueva, M.A. (2008): Electrotransfer of proteins in an environmentally friendly methanolfree transfer buffer. Analytical Biochemistry, 373,