La comunidad de hongos micorrícicos en un bosque de quercíneas Mediterráneo

Transcripción

1 2/12 La comunidad de hongos micorrícicos en un bosque de quercíneas Mediterráneo APONTE PERALES, C. 1, MARAÑÓN, T. 1, GARCÍA FERNÁNDEZ, L.V. 1 y GARDES, M. 2 1 Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNASE) CSIC. Avda Reina Mercedes 10, Sevilla, España 2 UMR 5174 Evolution et Diversité Biologique, Université Toulouse III Paul Sabatier, 118 Route de Narbonne, Toulouse Cedex 4, France Resumen La supervivencia de las quercíneas en condiciones naturales depende de la micorrización, una asociación simbiótica establecida entre plantas y hongos. A través de esta relación los hongos proveen a la planta de agua, nutrientes y beneficios tales como una mayor protección ante el estrés hídrico, los contaminantes o los agentes patógenos. Cambios en la cubierta vegetal, en las condiciones de humedad o la aplicación de fertilizantes y pesticidas pueden reducir las poblaciones de hongos micorrícicos, afectando a las interacciones entre plantas y llegando a alterar la composición de la comunidad vegetal. Este trabajo se realizó en los bosques de quercíneas del sur de la península ibérica. Nuestro objetivo fue estudiar, mediante el uso de métodos moleculares, la diversidad y estructura de la comunidad de hongos micorrícicos asociados a las raíces de dos especies coexistentes en estos bosques, el alcornoque (Q. suber L.) y el quejigo moruno (Q. canariensis Willd.), y describir la relación entre la especie huésped, las condiciones ambientales y la composición de la comunidad fúngica. Entre los resultados, destaca la gran diversidad de especies micorrícicas encontradas, resultado de un elevado número de taxones raros, rasgo característico de las comunidades de micorrizas. Las familias Thelephoraceae y Russulaceae se mostraron como las más abundantes, taxonómicamente diversas y con mayor dispersión espacial. Un número limitado de especies presentaron especificidad por la especie huésped mientras que el efecto de las condiciones del medio en la composición de la comunidad de hongos micorrícicos fue notable. La coexistencia de especies vegetales huéspedes y la heterogeneidad del medio parecen ser factores clave para sostener la diversidad de la comunidad micorrícica. Palabras clave Ectomicorriza, secuenciación de ADN, especie huésped, heterogeneidad ambiental, diversidad 1. Introducción La simbiosis micorrícica es una relación mutualista establecida entre plantas vasculares y hongos a través de la cual ambos organismos obtienen un beneficio principalmente alimentario: el hongo simbionte aumenta el área de exploración de las raíces y provee a la planta de recursos inorgánicos, como agua y nutrientes, a la vez que obtiene de esta última energía en forma de productos fotosintetizados (SMITH & READ, 1997). La simbiosis con hongos micorrícicos permite la captación de nutrientes desde minerales meteorizados y sustratos orgánicos y confiere a la planta una mayor protección frente el estrés hídrico, los contaminantes o los agentes patógenos (PÉREZ-MORENO & READ, 2001; VAN SCHOLL et al., 2006), pudiendo llegar a generar cambios en las comunidades de plantas (PERRY et al., 1989). En la actualidad, esta relación, desarrollada hace aproximadamente 400 millones

2 3/12 de años como una adaptación a situaciones con limitación de nutrientes, está presente en la mayoría de las plantas de los ecosistemas terrestres y es esencial para la nutrición y supervivencia de muchas de ellas (SMITH & READ, 1997). Entre las especies fúngicas que forman esta relación, los hongos ectomicorrícicos (ECM) se caracterizan por sus estructuras de intercambio, llamadas micorrizas, formadas por una cubierta miceliar que rodea las raíces cortas de la planta huésped (SMITH & READ, 1997). Se estima que alrededor de especies de hongos, principalmente Basidiomycota y Ascomycota, y 8000 especies de plantas, pertenecientes a familias como las betuláceas, fagáceas o pinaceas, participan en esta relación (TAYLOR & ALEXANDER, 2005), en la que las especies de hongos ECM pueden asociarse con huéspedes de diferente especie, género o familia a la vez que una misma planta puede ser colonizada por distintos taxones de hongos (ROY et al., 2008). Las condiciones ambientales y la composición de la comunidad de huéspedes afectan a la composición de la comunidad de hongos ECM. Las condiciones abióticas del suelo como la humedad, la acidez o la disponibilidad de nutrientes afectan al comportamiento y asociación de las especies simbiontes (BAUM & MAKESCHIN, 2000). Los árboles huéspedes afectan a la composición de la comunidad de ECM al ejercer una selección directa sobre las especies de hongos con las que establecen la simbiosis aunque, en general, la mayoría de las especies ECM muestra una baja especificidad (MOLINA et al., 1992). Por otra parte, los árboles también pueden influir en la comunidad de ECM mediante su capacidad para alterar las condiciones abióticas del suelo, a través de la calidad y cantidad de hojarasca que aportan (BOETTCHER & KALISZ, 1990). Las interacciones entre la especie huésped, las condiciones ambientales y la comunidad de hongos ECM son complejas y todavía se conoce poco sobre la importancia de los distintos efectos en el ensamblaje de especies (NANTEL & NEUMANN, 1992). Los bosques de quercíneas del sur de la península ibérica están relativamente bien conservados, albergando un gran numero de endemismos y una alta diversidad de especies (OJEDA et al., 2000), compatible con el uso sostenible de sus recursos (ANÓNIMO, 2005). A pesar de que la micorrización sea esencial para la nutrición y supervivencia de los Quercus en condiciones naturales (SMITH & READ, 1997) el número de estudios sobre comunidades de ECM llevados a cabo en bosques de quercíneas es limitado (VALENTINE et al., 2004; AVIS et al., 2008) y pocos de ellos se refieren a ambientes mediterráneos (RICHARD et al., 2005). 2. Objetivos En este trabajo se estudia la comunidad de hongos ectomicorrícicos (ECM) asociada a las raíces de dos especies de árboles que coexisten, la perennifolia esclerófila Q. suber (alcornoque) y la marcescente Q. canariensis (Quejigo moruno), empleando métodos moleculares. En particular se persigue:

3 4/12 1º. Describir la diversidad y estructura de la comunidad de hongos ECM en un bosque mixto mediterráneo. 2º. Evaluar las diferencias en la composición específica de las comunidades de hongos asociadas a las raíces de Q. suber y Q. canariensis en dos rodales forestales. 3º. Analizar la relación entre la especie huésped, las condiciones ambientales y la distribución de la comunidad ectomicorrícica, partiendo de la hipótesis de que la diferencia en la calidad de la hojarasca de las dos especies induce cambios en la composición de las comunidades de hongos ECM. 3. Metodología El área de estudio se sitúa en el Parque Natural de los Alcornocales al sur de la península ibérica. El clima es mediterráneo subhúmedo con precipitaciones entre 600mm y 2100mm, una temperatura media anual alrededor de los 15.7º C y temperaturas estivales moderadas que varían entre los 22º C y 26º C. El sustrato corresponde a areniscas silíceas con afloramientos calizos sobre el que se desarrollan suelos heterogéneos aunque mayormente ácidos o neutros y pobres en nutrientes (ANÓNIMO, 2005). El bosque de alcornocal (Q. suber) domina la vegetación del parque y mezclándose con el quejigo moruno (Q. canariensis) en los fondos de valle donde es localmente abundante. El sotobosque es diverso y con abundancia de especies arbustivas como Phillyrea latifolia, Erica spp. y Pistacia lentiscus (OJEDA et al., 2000). En este trabajo, se han estudiado dos rodales de bosque (1ha) distantes entre sí aproximadamente 40km. El primero, situado en la zona norte del parque, muestra una estructura de bosque abierto (Ba) con una densidad de 219 árboles. ha -1 y un área basal de 22.1 m 2. ha -1, mientras que el segundo, situado en el área sur del parque, es un bosque cerrado (Bc) con mayor densidad (769 árboles. ha -1 ) y área basal (47.4 m 2. ha -1 ) (PÉREZ-RAMOS, 2007). El rodal de bosque abierto se localiza en una zona más elevada e interior del parque y presenta temperaturas más extremas y mayores precipitaciones que el bosque cerrado. Los suelos muestran un mayor contenido en nutrientes y materia orgánica en el bosque abierto (QUILCHANO et al., 2007). En cada rodal se seleccionaron 6 individuos de Q. suber y 6 de Q. canariensis, bajo los que se tomaron muestras de hojarasca (cuadrados de 30x30cm) y de suelo superficial (0-25 cm). Las muestras de hojarasca se secaron (70º), pesaron, molieron y sometieron a digestión (ácido nítrico concentrado, en horno de microondas), tras lo que se determinaron varios macronutrientes (Ca, K, P) empleando un ICP/OES. En el suelo, el ph se determinó en suspensiones 1:2.5, el porcentaje de carbono mediante un analizador elemental, el Ca y K asimilables en acetato amónico 1M, mediante ICP-OES, el P disponible mediante el método Bray y Kurtz (BRAY & KURTZ, 1945) y el contenido total de P mediante digestión ácida (agua regia) e ICP/OES. El nitrógeno en la hojarasca y el suelo se determinó por el método Kjeldahl (SPARKS, 1996). Para estudiar la comunidad de hongos ECM se muestrearon raíces secundarias superficiales (0-15cm) en los 24 individuos seleccionados. Las muestras fueron cuidadosamente lavadas y de cada una se seleccionaron ectomicorrizas al azar, empleando una lupa binocular. El ADN de cada micorriza se extrajo mediante un kit de purificación PROMEGA y posteriormente las regiones ITS I y II, incluidas en la subunidad 5.8S del ARNr, se amplificaron mediante la reacción de polimerización en cadena (PCR)

4 5/12 empleando los cebadores específicos para hongos ITS 1F/ITS4 (GARDES & BRUNS, 1993) e ITS 1F/ITS4b (WHITE et al., 1990). Finalmente, los productos de la amplificación fueron verificados mediante electroforesis, secuenciados y corregidos manualmente. La identificación de las especies simbiontes como unidades taxonómicas operacionales (OTUs) se realizó en dos fases: primero las secuencias de nucleótidos obtenidas para cada micorriza se cotejaron con las almacenadas en la base de datos genéticos internacional Genbank permitiendo su identificación a nivel de género y/o familia y en algunos casos de especie. En una segunda fase, se analizaron los porcentajes de variación entre secuencias pertenecientes a una misma familia/género (NEI & KUMAR, 2000). Las secuencias con una similitud superior al 97% fueron adscritas a una misma OTU, considerada como especie genética (BLAXTER et al., 2005). Para corroborar la correcta agrupación e identificación de las OTUs se generaron diversos árboles filogenéticos incluyendo secuencias del Genbank como referencias externas. Las OTUs se clasificaron en función de distintas categorías taxonómicas (división, orden, familia y género) y del tipo de fructificación (epigea, hipogea, resupinada y asexual). La abundancia relativa de cada categoría se calculó como el número de micorrizas pertenecientes a cada clase con respecto al total de micorrizas identificadas. La riqueza de especies y el índice de diversidad de Simpson se emplearon como parámetros indicadores de la diversidad (MAGURRAN, 1988). La relación entre las variables ambientales y la distribución de las especies simbiontes se evaluó mediante análisis de componentes principales (PCA) y análisis de correspondencias canónicas (CCA) (TER BRAAK & SMILAUER, 2002). 4. Resultados Para el conjunto de 24 árboles se identificaron un total de 69 especies (OTUs) de hongos simbiontes pertenecientes a 24 géneros y 18 familias (Tabla 1). El número de especies raras fue muy elevado, con dos tercios de los taxones identificados presentes en un solo árbol y el 46% de las especies formando sólo una micorriza. De las familias identificadas Telephoraceae se mostró como el grupo más diverso con un 28% de las especies, seguida de Russulaceae (22%) y Cortinariaceae (17%). Más de la mitad de los 24 géneros muestreados se componían de sólo dos especies. La diversidad de especies ectomicorrícicas fue similar en las dos quercíneas (Tabla 1), contando ambas con 18 familias y 14 géneros. Sólo 13 de las OTUs identificadas fueron encontradas en ambas quercíneas, 29 fueron observadas exclusivamente en Q. canariensis y 27 lo fueron en Q. suber (Figura 1). Las comunidades de hongos ECM asociados a las raíces de ambas quercíneas estuvieron dominadas por Basidiomicetes (>90% de las micorrizas identificadas), identificándose sólo 10 micorrizas formadas por Ascomycetes. Thelephoraceae y Russulaceae fueron las familias más abundantes y extendidas, encontrándose en 18 y 17 árboles, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en la abundancia de sus poblaciones tanto entre las dos especies hospedadores, como entre los dos rodales estudiados (Tabla 1). Más de la mitad de las especies identificadas (56%) se clasificaron como especies con cuerpos fructíferos epigeos mientras que el 44% de los taxones tenían carpóforos inconspicuos (resupinados, hipogeos o asexuales). En general las poblaciones de hongos epígeos y resupinados fueron las más abundantes aunque mostraron diferencias entre quercíneas y rodales (Tabla 1).

5 6/12 Tabla 1. Descripción de la comunidad de hongos ECM asociados a las raíces de Q. canariensis (Qc) y Q. suber (Qs) en un rodal de bosque abierto (Ba) y de bosque cerrado (Bc). La tabla muestra para cada categoría huésped-rodal y para el total de individuos el número de micorrizas y especies encontradas, parámetros de diversidad, la abundancia relativa de las familias más representativas y la distribución de las micorrizas identificadas según el tipo de fructificación. Qc -Ba Qc -Bc Qs- Ba Qs - Bc Total Nº micorrizas muestreadas Nº micorrizas identificadas Nº spp que ocurren en un solo árbol Nº spp con una sola micorriza Diversidad Riqueza de especies (S) Promedio riqueza /árbol Índice diversidad de Simpson (1-D) Familias (% de micorrizas) Thelephoraceae Russulaceae Cortinariaceae Sebacinaceae Clavulinaceae Atheliaceae Boletaceae Melanogastraceae Pluteaceae Fructificaciones (% de micorrizas) Epigeas Hipogeas Resupinadas Asexuales Tomentella sublilacina Cortinarius dionysae Amanita citrina Russula sp.6 Melanogaster variegatus Macowanites ammophilus Russula cf. emetica Xerocomus subtomentosus Byssocorticium atrovirens Cenococcum geophilum Tomentella sp.4 Russula sp.2 Clavulina sp. 2 Lactarius chrysorrheus Tomentella sp.2 Cortinarius umbrinolens Tomentella sp.1 Tomentella sp.10 Russula sp.1 Q. canariensis Q. suber Figura 1. Abundancia relativa (%) de las especies de hongos ECM identificados. Sólo las más abundantes aparecen representadas. El estudio mediante PCA de la variación de las propiedades del suelo y la hojarasca recogidos bajo los individuos seleccionados mostró una alta correlación (r>0.75) y concentración de las variables (55% de la variabilidad) en un gradiente principal de

6 7/12 acidificación y empobrecimiento en nutrientes (Ca, K, P) del suelo y la hojarasca dependiente de los efectos de la especie huésped y el rodal. En ambos rodales los suelos y hojarasca asociados a Q. canariensis mostraron mayores valores de ph y fertilidad que los encontrados para Q. suber (Figura 2). Entre todas las variables ambientales estudiadas los niveles de calcio en la hojarasca fueron los que mejor explicaron la distribución de la comunidad de hongos ectomicorrícicos (8.4% de la varianza total de la comunidad ECM, según el primer eje del análisis CCA, Fig. 2), si bien la acidez y los niveles de calcio en el suelo mostraron también un efecto marginal significativo. Hojarasca- Ca (ppm) Qc-Ba Qs-Ba Qc-Bc Qs-Bc ,5-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 CCA Eje 1 Figura 2. Distribución de los individuos de Q. suber (Qs) y Q. canariensis (Qc) estudiados en los rodales de bosque abierto (Ba) y bosque cerrado (Bc) en función de la composición de su comunidad de hongos ECM (según el Eje 1 del análisis CCA) y los niveles de calcio determinados en su hojarasca (Hojarasca-Ca). Individuos próximos en el eje de abscisas (eje 1 del CCA) mostraron mayor similitud entre sus comunidades de ECM. 5. Discusión El número de especies de hongos ECM (69) encontrado es comparable con los hallados en otros trabajos llevados a cabo en bosques de quercíneas, en los que la riqueza de especies osciló entre 39 y 79 taxones identificados en 20 y 36 individuos, respectivamente (AVIS et al., 2008; VALENTINE et al., 2004). La comunidad de hongos micorrícicos estudiada comprende unos pocos géneros muy abundantes y muchos taxones raros, situación frecuente en estos organismos simbiontes (DAHLBERG, 2001). Las dos familias dominantes más diversas y extendidas fueron Telephoraceae y Russulaceae, que han sido también señaladas como dominantes en muchos otros estudios de ECM en bosques boreales y templados de coníferas y quercíneas (GARDES & BRUNS, 1996; RICHARD et al., 2005). Las poblaciones de hongos ECM con fructificaciones resupinadas representaron una importante fracción de las micorrizas identificadas (33%), mostrando abundancias máximas en las zonas con mayor concentración de nutrientes. Es frecuente que los trabajos sobre diversidad de ECM basados en el estudio de carpóforos ignoren los grupos con frutos inconspicuos, tales como los hipogeos o resupinados (RICHARD et al., 2004). El uso de técnicas moleculares ha puesto de manifiesto la importancia de estas especies de fructificación resupinada en las comunidades de ECM (DAHLBERG, 2001). Es notable la escasa presencia de secuencias correspondientes a taxones micorrícicos de la península ibérica en la base de datos genéticos internacional Genbank, sólo un 30% de las especies. Para progresar en el conocimiento de las comunidades micorrícias de los bosques

7 8/12 españoles, es esencial aunar esfuerzos que permitan la recolección, identificación y secuenciación de carpóforos. Un especial énfasis ha de ponerse en la identificación de especies resupinadas, dado el alto grado de desconocimiento que existe sobre ellas y su importancia en las comunidades micorrícicas. La elevada riqueza de especies y la proporción de especies raras encontradas en nuestro estudio impiden evaluar con precisión el grado de especificidad de las especies fúngicas con respecto a la especie huésped. Sin embargo, estudios previos no han encontrado diferencias entre las comunidades de huéspedes próximos filogenéticamente demostrando que, en la mayoría de los casos, la especificidad de los hongos ECM es baja (MOLINA et al., 1992). La presencia de taxones micorrícicos poco específicos capaces de asociarse con un amplio rango de especies vegetales posibilita la existencia de redes miceliares de conexión interespecífica (ROY et al., 2008), que permitirían una posible transferencia de agua, nutrientes y carbono entre individuos (SIMARD et al., 1997; HE et al., 2006). La importancia ecológica de estos intercambios es aún desconocida, pero podría suponer un mecanismo crítico para el funcionamiento y regeneración de la comunidad vegetal (DAHLBERG, 2001). Los resultados obtenidos muestran que el árbol huésped, a través de las propiedades de su hojarasca, puede modificar las condiciones del medio e influir indirectamente en el ensamblaje de especies ECM (CONN & DIGHTON, 2000; GARCIA et al., 2008). Los árboles son capaces de alterar los ciclos biogeoquímicos y modificar las propiedades de los horizontes edáficos de un modo específico mediado entre otros por las propiedades de la hojarasca (BOETTCHER & KALISZ, 1990). La interacción entre las especies huésped de árboles y las condiciones abióticas condicionan un gradiente de acidez y empobrecimiento de nutrientes a lo largo del cual varían los taxones fúngicos dominantes (APONTE 2008). La acidez del suelo, muy relacionada con los niveles de calcio contenidos en el suelo y la hojarasca, se mostró como uno de los factores más influyentes en la composición de la comunidad ectomicorrícica. Otros estudios han constatado que los cambios en los valores de ph pueden alterar el crecimiento, la densidad del micelio y el potencial de colonización (ERLAND & SODERSTROM, 1990) y las capacidades enzimáticas (COURTY et al., 2005), afectando a la capacidad competitiva de las especies micorrícicas y dando lugar a cambios en su abundancia relativa en la comunidad (MCAFEE & FORTIN, 1987). Estudios previos han mostrado que la hojarasca y los suelos enriquecidos limitan la colonización de ECM, afectan a la longitud de las hifas y alteran la composición de la comunidad (CONN & DIGHTON, 2000; TOLJANDER et al., 2006). La micorrización es una adaptación a situaciones con limitación de nutrientes fundamentada en un intercambio trófico bidireccional. En suelos enriquecidos, donde la planta disfruta de una mayor disponibilidad de recursos, la transferencia de carbohidratos al hongo simbionte podría verse limitada (WALLENDA & KOTTKE, 1998), afectando al crecimiento y mantenimiento del micelio y a la producción de frutos. Especies con capacidades saprófitas como las tomenteloides (KÕLJALG, 1996) son capaces de obtener carbono de la materia orgánica en descomposición disminuyendo su dependencia del aporte de carbohidratos del fitobionte. En ambientes enriquecidos, estas especies se encontrarían en ventaja competitiva aumentando su abundancia relativa (KOIDE et al., 2005) y generando un cambio en la composición de la comunidad.

8 9/12 6. Conclusiones 1. La comunidad de hongos ECM presente en las raíces de Q. suber y Q. canariensis en un bosque mediterráneo está formada por una alta diversidad de especies y está estructurada en pocos taxones abundantes y gran cantidad de especies raras. 2. Russulaceae y Telephoraceae fueron los grupos con mayor abundancia, ocurrencia y diversidad taxonómica. La importante proporción de especies resupinadas encontradas en la comunidad de hongos micorrícicos pone de manifiesto la relevancia del empleo de técnicas moleculares en estos estudios y la necesidad de ampliar el conocimiento acerca de este grupo fúngico. 3. La baja especificidad de los taxones micorrícicos observada en nuestro estudio podría indicar la existencia de una red miceliar de conexión entre especies vegetales que favorecería la transferencia de recursos entre individuos. 4. La especie de árbol huésped influye de forma indirecta sobre la composición de la comunidad de ECM a través de su capacidad para modificar las condiciones abióticas del medio. Como resultado de la interacción entre el árbol huésped y las características abióticas se genera una heterogeneidad ambiental que contribuye a mantener la elevada riqueza taxonómica de la comunidad de hongos ECM. 7. Agradecimientos Agradecemos a la Consejería de Medio Ambiente y a Marco Antonio Tena, Director del Parque Natural de Los Alcornocales por los medios y el apoyo prestado para llevar a cabo este trabajo así como a Ana Pozuelo, Maria Navarro, Eduardo Gutiérrez, Sophie Manzi y Juliet Rochet por su colaboración en los trabajos de campo y laboratorio. Este estudio esta financiado por una beca FPI-MEC otorgada a C.A., los proyectos de Investigación Nacional Dinamed (CGL C03-019) e Interbos (CGL C03-01) concedidos por el Ministerio de Educación y Ciencia y los fondos Europeos FEDER. Esta investigación forma parte de la red Globimed de cambio global y biodiversidad en los ecosistemas mediterráneos ( 8. Bibliografía ANÓNIMO; PORN / PRUG / PDS Parque Natural Los Alcornocales. Junta de Andalucía, Consejería de Medio Ambiente. Sevilla, España APONTE, C.; Diversidad y estructura de la comunidad de hongos micorrícicos en un bosque de quercíneas Mediterráneo. Diploma de Estudios Avanzados. Dpto. Biología Vegetal y Ecología. Universidad de Sevilla AVIS, P. G.; MUELLER, G. M.; LUSSENHOP, J.; Ectomycorrhizal fungal communities in two North American oak forests respond to nitrogen addition. New Phytol. 179 (2): BAUM, C.; MAKESCHIN, F.; Effects of nitrogen and phosphorus fertilization on mycorrhizal formation of two poplar clones (Populus trichocarpa and P. tremula x tremuloides). J. Plant Nutr. Soil Sc. 163 (5):

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