Proteasoma de 26S Mda - 32 polipeptidos diferentes

Transcripción

1 Proteasoma de 26S Mda - 32 polipeptidos diferentes 8 no-atpasas Binding a la cadena de poli-ubiquitina (?) (regulatoria) 18 subunidades (6 ATPasas) de la flia AAA Funciones: - Selección y preparación del sustrato - Su translocación al 20S 6 ATPasas 2 no- ATPasas (catalítica) Péptidos de 3 a 23 aa 3 de las subunidades con actividad de proteasa (6 en total), c/u con especificidad diferente

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4 Los complejos SCF Skp1 F-box Cul1-NTD Rbx1 E2 Cul1-CTD

5 ANGIOGENESIS / VASCULOGENESIS: Nuestro sistema vascular es plastico y responde a hipoxia Hypoxic Vascularized Normal Ischemic

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7 Hipoxia Respuesta sistemica HIF-1 Respuesta celular VEGF EPO transferrin inos tyrosine hydroxylase HRE Glut1 ALDA ENO1 PFK PGK1 LDH-A

8 Un poco de historia: HIF fue aislado merced a su capacidad de unirse a HREs Wang et al, JBC 268: (1993)

9 HIF es un heterodimero a/b de proteinas bhlh-pas HIF-1b

10 Luc Fragmento de HIF-1a Gal4 DNA BD UAS

11 Quimeras HIF-1a/Gal4 son regulables por oxígeno

12 La degradacion de HIF-1a Depende del sistema ubiquitina/proteasoma

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15 Angioblastoma retinal

16 La pérdida de VHL lleva a la sobre-expresión de genes inducibles por hipoxia

17 HIF-a está controlado directamente por VHL Reporteros Gel Shift Western

18 VHL forma complejos con Culina 2 y Elongina B Fibronectina Culina 2 Elongina B

19 Estructura del complejo VHL/Elongina B/Elongina C

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21 VHL tiene asociada actividad ubiquitina ligasa Células marcadas metabólicamente con met S35, IP ahif y Western antiubiquitina

22 La actividad ubiquitina ligasa depende de la región de binding a elongina B/C y a Culina 2

23 La actividad de VHL es específica para HIF-1a

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25 Ratones transgénicos que sobre-expresan HIF-1aDODD tienen hiper-vascularización

26 La hiper-vascularización de los ratones transgénicos correlaciona con los niveles de expresión de VEGF

27 La prolina 564 de HIF-1a es necesaria para la interacción con VHL Union de un peptido de HIF-1 a VHL

28 HIF-1a se une a VHL solo si la Pro564 esta hidroxilada Experimento de competencia VHL sintetizado in vitro y a-hif endogeno

29 La Prolina 864 efectivamente se hidroxila

30 La reacción de hidroxilación de las prolinas de HIF

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32 Mutaciones en el gen egl-9 de C.elegans presentan aumento constitutivo en los niveles de CeHIF-1

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34 Alelos mutantes de fatiga presentan inducción constitutiva de la respuesta a hipoxia

35 El sistema traqueal de Drosophila (btl-gal4/uas-gfpn)

36 El oxigeno puede modular la ramificacion de las celulas terminales traqueales Jarecki et al., 1999

37 Branchless atrae ramas terminales Branchless (target tissues) Breathless (tracheal cells) Breathless Branchless

38 O 2?? Branchless Ramificación traqueal

39 Nuestro sistema vascular es plastico y responde a hipoxia Hypóxico Vascularizado

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42 El sistema HIF esta conservado en la evolucion Mamiferos Drosophila O 2 O 2 PHD Fatiga HIFa/b Sima/Tango Transcripcion de genes-blanco

43 Regulacion transcripcional del remodelado traqueal en hipoxia

44 Las ramas terminales gruesas (TTBs)

45 Ramificación traqueal dependiente de oxígeno * w 21% O2 w 60% O2 w 5% O2 fga- 21% O2 sima- 21% O2 sima- fga- 21% O2

46 Fatiga y Sima controlan la ramificación tracheal O 2 Fatiga * * 4 2 Sima Ramificación 0 w 21% O2 w 60% O2 w 5% O2 fga- 21% O2 sima- 21% O2 sima- fga- 21% O2

47 Hipótesis (angiogenesis-like) TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 Fatiga Breathless Sima/Tango Branchless RAMIFICACION

48 La sobre-expresión de Sima en células no-traqueales no atrae el crecimiento de terminales traqueales

49 La sobre-expresión de Sima en células no-traqueales induce la formación de largos filopodios

50 Hypótesis II TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Breathless? Branchless RAMIFICACION

51 Reportero inducible por hipoxia 5 region of Lactate deshydrogenase-a gene (murine) Sima Sima Gal4 HRE HRE CRE HRE HRE CRE GFPn-lacZ UAS

52 Las células terminales traqueales son hiper-sensibles a hipoxia

53 Las células terminales traqueales responden a hipoxia con alta sensibilidad ON in terminal cells only ON in other tracheal cells as well

54 TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Breathless? Branchless RAMIFICACION

55 Sima es requerida dentro de las células traqueales para la sobre-ramificación en respuesta a hipoxia GFP in a wt cell GFP sólo en la célula mutante para sima

56 TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Breathless? Branchless RAMIFICACION

57 La sobre-expresión de Sima en las tráqueas provoca sobre-ramificación

58 La sobre-expresión de Sima en las tráqueas provoca sobre-ramificación

59 Sima induce a Breathless btl-gal4/uas-gfp btl-gal4/uas-gfp /UAS-Sima

60 Sima induce la transcripción de breathless en células S2

61 TEJIDO BLANCO CELULA TRAQUEAL O 2 O 2 Fatiga Sima? Fatiga Sima Breathless Breathless Breathless Branchless RAMIFICACION

62 La sobre-expresión de breathless en las tráqueas provoca sobre-ramificación

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