Resumen de investigació n: WTX, an unexpected regulatór fór p53

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1 Resumen de investigació n: WTX, an unexpected regulatór fór p53 El gen WTX frecuentemente se encuentra mutado o ausente en el tumor de Wilms. En la investigación de Kim et al. en 2012 se identifica a WTX como modulador de la actividad del supresor de tumores p53 regulando su acetilación. Además, WTX regula la ruta oncogen de la b -catenina y la ruta de supresión de tumores de p53. Mercè Montoliu Nerín Genética Molecular Grado en Biología Universidad Autónoma de Madrid 07 de diciembre de 2012

2 Intróducció n P53 El gen de p53 es un gen supresor de tumores y se ha comprobado que está implicado en la mayoría de las formas malignas esporádicas en humanos. Se encuentra codificado en el cromosoma 17p y ha sido estudiado en una amplia variedad de tumores y linajes celulares derivados de tumores. Estos tumores suelen ser causados por una pérdida de los dos alelos de p53, que puede ser por deleción o por mutaciones puntuales, o ambas al mismo tiempo. (Levine et al. 1991) El wild type de p53 puede suprimir o inhibir la transformación de células por oncogenes virales o celulares. También detiene el crecimiento celular dejando las células en G1 o incluso induciendo la apoptosis. Lo hace mediando en la regulación de la transcripción de otros genes implicados en el ciclo celular (Fig. 1). La mayoría de las mutaciones encontradas en p53 se producen en sus dominios de unión a DNA. (Laptenko, O. and Prives, C. 2006) Estrés celular DNA dañado Oncogenes activados Hipoxia Ausencia de ribonucleótidos Telómeros desgastados P53 Dianas del p53 Respuestas celulares Apoptosis Detención del ciclo celular Reparación de DNA Diferenciación Senescencia Figura 1. Esquema general de la función de p53 en la célula. Esquema propio. Modelo sacado de: Chène, P. Inhibiting the p53 MDM2 interaction: an important target for cancer therapy. Figura 1. The p53 mediated reponse. WTX y tumor de Wilms El tumor de Wilms es un tumor embrionario del riñón que afecta a 1 de cada nacidos vivos representando el tumor de órgano sólido más común diagnosticado en niños. El análisis genético de los pacientes y de sus tumores revelan varias alteraciones en los genes importantes del tumor de Wilms, incluyendo la eliminación o mutaciones de pérdida de Mercè Montoliu Nerín 1

3 función del gen del tumor de Wilms 1 (WT1), que codifica para un factor de transcripción supresor de tumores; mutaciones activadoras del oncogen de la β-catenina (CTNNB1), que es un efector clave de la vía de señalización de WNT; regulación epigenética positiva de un factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2), y la inactivación de un gen recientemente descubierto Wilms tumor en el cromosoma X (WTX). A diferencia de los supresores tumorales autosómicos, WTX solo necesita inactivarse por cambios en un solo alelo, el del único cromosoma X en hombres, o el del cromosoma X activado en las mujeres. (Kim et al. 2011; Dai, C. and Gu, W. 2012) Diversos estudios han demostrado diferentes funciones de WTX en diferentes compartimentos celulares. En el citoplasma, WTX downregula la vía de señalización de WNT por ubiquitinación y degradación del oncogen de la β-catenina; en el núcleo modula la activación de la transcripción de WT1. En este estudio se pretende ver la modulación de la actividad de p53 por acetilación, vinculando el WTX a la ruta clásica de supresión de tumores del p53, descubriendo así el papel de WTX en la tumorgénesis a través de la regulación de coactivadores de p53. (Dai, C. and Gu, W. 2012) Resultadós La expresión ectópica de WTX en células HEK293 disocia el complejo citoplasmático E1B 55K-p53 y activa el p53. Se ha generado una línea celular de riñón humano con expresión de WTX inducible por doxiciclina (HEK293) y se han estudiado dos clones (F-5 y F-18). A través de perfiles de expresión con microarrays en las 12 horas siguientes, WTX reveló una ganancia de 13 vías upreguladoras y 8 downreguladoras, visto mediante el análisis de enriquecimiento conjunto de genes (GSEA). De las 13 vías upreguladoras, 9 estaban funcionalmente relacionadas con p53, lo que indica que el p53 endógeno podría ser activado después de la expresión ectópica de WTX. La dependencia de p53 de los cambios mediados por WTX fue confirmado mediante knockdown de p53 mediado por sh-rna, viendo que disminuía la inducción de transcritos por activación de la expresión de WTX. Por otra parte, dos modificaciones postraduccionales de activación de p53 característicamente inducidas por radiación ionizante (IR), como son la fosforilación en Ser 15 y la acetilación en Lys 382, se incrementaron tras la inducción de WTX. Mercè Montoliu Nerín 2

4 La p53 endógena de las células HEK293 se inactiva por la expresión de la oncoproteína E1B 55K del adenovirus de tipo 5, en parte a través de su reclutamiento por la proteína citoplasmática E1B. Sorprendentemente, se observó que la expresión de WTX activa la interrupción de la forma E1B del adenovirus liberando el p53 en el núcleo (Fig. 2A). P53 se localizó en el citoplasma unido a la estructura E1B en las células F-5 no inducidas, pero al inducir el WTX doxicilina, se observó la desaparición de estos focos de p53 citoplasmáticos y el aumento de su localización en el núcleo. WTX codifica para dos transcritos distintos resultantes de un splicing alternativo en el cdna, produciéndose la deleción de 831 nucleótidos, que da como resultado un transcrito acortado por splicing (WTX-S), para identificar la localización del WTX de tamaño completo se creó un cdna sin capacidad para producir splicing (WTX-NS) por sustitución de un nucleótido. Ambos se marcaron con FLAG para localizarlos celularmente por inmunofluorescencia. En células U2OS se localizaron FLAG-WTX-NS y FLAG-WTX-S principalmente a la membrana plasmática y el núcleo, respectivamente (Fig. 2C). Sin embargo, en las células HEK293 que expresan E1B 55K, WTX-S se colocalizaba tanto con p53 y E1B 55K en el citoplasma (Fig. 1D y 1E). WTX-NS en células HEK293 se mantuvo localizada principalmente en la membrana plasmática, pero su expresión daba lugar a la interrupción de la forma E1B, y a la aparición de grandes agregados citoplasmáticos de E1B 55K. p53, al mismo tiempo, era liberado del cuerpo E1B por la expresión ectópica de WTX-NS y acumulado en el núcleo (Fig. 2D y 2E). Las imágenes celulares obtenidas demostraron que la interacción física entre E1B 55K y p53 se redujo por la expresión ectópica del cdna completo de WTX. (Kim et al. 2012) WTX interactúa con p53 y E1B 55K Para definir mejor la interacción entre la proteína WTX, p53, y/o E1B 55K, se realizó una inmunoprecipitación de lisados celulares de HEK293. Tanto E1B 55K y p53 coprecipitan con FLAG-WTX (Fig. 3A, carril 2). Recíprocamente, tanto WTX y p53 se encuentran en los inmunoprecipitados con E1B 55K (Fig. 3A, carril 3). Estas observaciones pueden ser explicadas por un complejo ternario incluyendo WTX, p53 y E1B 55K, o por distintas interacciones de pares de proteínas. Viendo que la interacción E1B 55K-p53 se redujo por la sobreexpresión de WTX (Fig. 3B), razonamos que WTX podría competir por la unión con estas proteínas, lo que conduce a la disociación. Mercè Montoliu Nerín 3

5 Figura 2. Localización celular de p53, E1B 55K, y WTX en células HEK293 transformadas por adenovirus. (A y B) inmunotinción de p53 (A) y E1B 55K (B) en células HEK293 5-F con WTX regulado por doxitocina. (C) la distribución normal celular de FLAG-WTX-NS (nonspliceable cdna) y FLAG-WTX-S (splicing cdna), en células U2OS. (D) La inmunotinción de p53, FLAG- WTX-NS y FLAG-WTX-S en células HEK293 con WTX inducible con lentiviral (E) La inmunotinción de E1B 55K, FLAG-NS-WTX y FLAG-WTX-S en células HEK293 con WTX inducible con lentiviral (Kim et al. 2012) Figura 3. Asociaciones entre WTX, E1B 55K y p53 (A) Coinmunoprecipitación de FLAG-WTX, E1B 55K y p53 en células HEK293 con WTX inducible. Para la inmunoprecipitación se utiliza anti-flag, E1B 55K anticuerpos IgG como control, para el blot utilizamos anticuerpos contra W1B 55K, p53 o FLAG. Flechas indican FLAG-WTX-NS (NS) y FLAG-WTX-S (S). (B) Análisis por Western Blot demostrando la coinmunoprecipitación de E1B 55K y p53 se reduce después de la la inducción de WTX. (Kim et al. 2012) Mercè Montoliu Nerín 4

6 Tras estos resultados, se probó si WTX puede interaccionar con p53 y E1B 55K independientemente. El complejo WTX-E1B 55K no se vio afectado por el knockdown de p53 en células HEK293 mediante shrna. De la misma forma, la interacción de WTX-p53 era independiente de E1B 55K como se demostró en un coinmunoprecipitado de células U2OS y H1299 que no expresaban E1B 55K. Por tanto, estos resultados, podrían sugerir que había distintas interacciones proteicas relacionadas con WTX-p53 y WTX-E1B 55K. Tras el estudio de sus dominios de asociación, por el mapeado de estas zonas, se sugirió que la disociación de E1B 55K y p53 puede ser resultado de la competición de WTX por el dominio de unión a E1B 55K. (Kim et al. 2012) WTX modula la acetilación de p53 en Lys 373/382 Para analizar las consecuencias funcionales de la expresión de WTX en la activación de p53, se hizo un estudio de las modificaciones más conocidas en la activación de p53, como son, la fosforilación de Ser 15 y 20, o la acetilación de Lys 373, 382 y 320. En las células HEK293 que sobreexpresan WTX se observó fosforilación potenciada en Ser 15 y acetilación en Lys 382 y 373. Se comprobó que la coexpresión de p53 y WTX en células H1299 (no transformadas por adenovirus) suponía una acetilación mejorada de Lys 373/382. A la inversa, una reducción de la acetilación de p53 en Lys 373/382 se observó con WTX agotado y p53 reconstruido. (Fig. 4) También se observó que la acetilación de p53 en Lys 320 y la fosforilación de Ser 15 y 20 se asociaba positivamente con WTX, pero sólo en el contexto de la expresión ectópica de p53, no tan consistente como la acetilación de Lys 373/382 mediada por WTX. (Kim et al. 2012) Figura 4. Acetilación en Lys 373/382/320 y Fosforilación en Ser 15 y 20. (A) Análisis del efecto en un medio con la droga Etoposide en las modificaciones del p53 endógeno, incluyendo acetilación de lisina 373, 382 y 320, y la fosforilación de serina 15 y 20 en células A549 tras un knockdown de WTX. (Kim et al. 2012) Mercè Montoliu Nerín 5

7 WTX regula la estabilidad de la proteína CBP/p300 y activa la interacción CBP-p53 La acetilación en Lys 373/382 de p53 está mediada por las acetiltransferasas CBP/p300. WTX no codifica dominios reconocibles por acetiltransferasas ni deacetilasas, pero se ha comprobado si podría modular la actividad de estos reguladores. Knockdown de WTX no altera la localización de estas proteínas modificadoras de p53 en el núcleo. Además, knockdown de sirna de deacetilasas, no alteró la acetilación de p53 mediada por la sobreexpresión de WTX. Sin embargo, la supresión de WTX tuvo como resultado una expresión significativamente menor de CBP y p300, pero ningún cambio en deacetilasas (Fig. 4A). La downregulación de CBP y las proteínas p300 no fue debido a una reducción en sus niveles de mrna (Fig. 4B), pero se asoció con una mayor degradación de proteínas (Fig. 4C, 4D), que fue rescatado por el inhibidor del proteasoma MG132, lo que indica la implicación de la degradación mediada por ubiquitina. (C) El aumento de la degradación de CBP y p300 tras caída de WTX en las células U2OS medido por análisis de inmunotransferencia. La cicloheximida (CHX, 100 mg / ml) se añadió en tiempo indicado 40 h después de la transfección, un tiempo en que se logra knockdown de WTX pero antes de que la downregulación de CBP/p300 se produzca. (D) La cuantificación de los resultados de inmunotransferencia en (C), utilizando software Quantity One (Bio-Rad), con CBP / p300 niveles se normalizaron a la tubulina. (Kim et al. 2012) Figura 5. Reducción de la estabilidad de CBP/p300 tras el agotamiento de WTX (A) Análisis de inmunotransferencia de las acetiltransferasas y desacetilasas de CBP y p300: SIRT1, HDAC1, HDAC2, y en células U2OS knockdown de WTX, utilizando cualquiera de los dos shrnas independientes, lo que demuestra la reducción de expresión de CBP/p300 sin WTX. (B) cuantitativa en tiempo real del análisis por PCR de los niveles de mrna de CBP y p300 en células knockdown para WTX, lo que demuestra los niveles de mrna inalterados. Mercè Montoliu Nerín 6

8 La downregulación de CBP/p300 por knockdown de WTX es dependiente de la presencia de ubiquitin ligasas E3. Knockdown del dominio F box de la proteína Skp2, un componente del complejo SCF Skp2 ubiquitin ligasa E3 que regula la estabilidad de la p300, así como knockdown del dominio F box de β-trcp, un componente del complejo SCF β-trcp ubiquitin ligasa E3, anuló la downregulación de CBP/p300 tras el agotamiento de WTX. Estos resultados apuntan a determinadas vías de degradación de proteínas a través del cual WTX pueden regular CBP y p300 a nivel postranscripcional. CBP/p300 interactúan con el dominio N-terminal de p53, y se ha visto que WTX aumenta la acetilación mediada en los p53 salvajes y, aunque en menor grado, también en las proteínas p53 con el dominio N-terminal truncado, que carecen de dominio de unión a CBP/p300, pero retienen el dominio de unión a WTX. Así, WTX puede ser capaz de acercar la interacción entre CBP/p300 y p53, permitiendo la acetilación mediada por CBP/p300 de las p53 truncadas. La unión de WTX-CBP es independiente de p53, pues en células H1299 sin p53, FLAG-WTX coinmunoprecipitó con CBP endógeno. En experimentos de cotransfección, la expresión de WTX activó la acetilación mediada por CBP de Lys 382 del p53 salvaje. La expresión ectópica de WTX no incrementó los niveles de CBP, lo que sugiere otros factores limitantes cuando WTX es abundante. Finalmente, experimentos de coinmunoprecipitado mostraron que la interacción física entre CBP y p53, durante la acetilación de p53, era activada en presencia de WTX ectópico. (Kim et al. 2012) Con todos estos resultados, el equipo de Kim sugirió que WTX modula la acetilación de p53 mediante la estabilización de CBP/p300 y actuando como enhancer para la formación del complejo CBP/p300-p53. Cónclusiónes Ha quedado demostrado que el gen supresor del tumor de Wilms, WTX, mejora la función de p53. Esta observación fue provocada por la colocalización de WTX con E1B 55K y proteínas p53 en la forma E1B citoplasmática de células renales transformadas con adenovirus, aunque el efecto de WTX en la modificación postraduccional de p53 es independiente de E1B 55K. En su lugar se asocia con modular la estabilidad de las acetiltransferasas CBP y p300 que acetilan p53 en los residuos de lisina 373 y 382, y mejora la asociación entre p53 y CBP. Mercè Montoliu Nerín 7

9 Al mismo tiempo, la modulación de WTX dejó ver una degradación de β-catenina en el citoplasma, sugiriendo que WTX también tiene efecto en el equilibrio de proteínas nucleares. (Kim et al. 2012; Dai, C. and Gu, W. 2012) Figura 6. Representación esquemática de la regulación por WTX de la ruta de la β-catenina y la activación de p53 WTX interactúa con el complejo SCF-TrCP ubiquitin ligase E3, y promueve la degradación de la β- catenina en el citoplasma, impidiendo la acumulación de β-catenina que conlleva la activación de dianas de genes oncogénicos. Por otro lado, WTX estabiliza CBP y activa la acetilación de p53, permitiendo la activación de dianas de genes supresores de tumores implicados en respuestas celulares ante estrés. Una inactivación genética de WTX implica una activación constitutiva del oncogen de la β-catenina, resultando en un desarrollo aberrante y tumorgénesis. La pérdida de WTX, además acelera la degradación de CBP, reduciendo la acetilación de p53 y su actividad transcripcional. (Dai, C. and Gu, W. 2012) Mercè Montoliu Nerín 8

10 Bibliógrafí a Chène, P Inhibiting the p53 MDM2 interaction: an important target for cancer therapy. Nature Reviews Cancer 3, Dai, C. and Gu, W WTX: An Unexpected Regulator for p53. Molecular Cell 45, Kim, M K-H.; Min, DJ.; Rabin, M.; Licht, JD Functional characterization of Wilms tumorsuppressor WTX and tumor-associated mutants. Oncogene 30, Kim, W J.; Rivera, M N.; Coffman, E J.; Haber, D A The WTX Tumor Suppressor Enhances p53 Acetylation by CBP/p300. Molecular Cell 45, Laptenko, O. and Prives, C Transcriptional regulation by p53: one protein, many possibilities. Cell Death and Differentiation 13, Nature Publishing Group. Levine, A J.; Momand, J; Finaly, C A.; The p53 tumour suppressor gene. Nature Vol 351, p Mercè Montoliu Nerín 9